Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

Este experimento prueba la capacidad del Staphylococcus aureus para utilizar la hemoglobina humana como única fuente de hierro. Primero, aísle los glóbulos rojos de la sangre humana fresca. Purifique la hemoglobina mediante cromatografía líquida de alta resolución para garantizar la integridad de la hemoglobina.

Ahora agregue hemoglobina en el medio empobrecido en hierro para suministrar el hierro en forma de hemoglobina Next cultivo. S reus. En presencia de hemoglobina y medir su capacidad para utilizar la hemoglobina como fuente de hierro.

Los resultados muestran que el as reus prolifera en presencia de hemoglobina como única fuente de hierro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como si un patógeno puede utilizar las proteínas del huésped como fuentes de hierro y qué mecanismos se requieren para utilizar el hierro mediante este proceso. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la adquisición de hierro de estafilococos reus a partir de la hemoglobina.

También se puede aplicar a los estudios de otras bacterias y cómo utilizan las proteínas que contienen hierro del huésped. Demostrando esta técnica estarán GLA Ani y Catherine Haley de mi laboratorio. Primero, obtenga sangre humana recién aislada, suplementada con un anticoagulante y manténgala a cuatro grados centígrados durante toda la purificación Granule los glóbulos rojos por centrifugación durante 20 minutos a 15, 000 Gs.Aspire cuidadosamente el snat y vuelva a suspender suavemente el pellet en una solución helada de cloruro de sodio al 0,9% Después de tres lavados, resus, suspenda el pellet en un volumen de triss helado de 10 milimolares, HCL a los glóbulos rojos por presión osmótica.

A continuación, añadir tolueno hasta el 20% del volumen final e incubar a cuatro grados centígrados en un rotador durante la noche. Siguiente centrífuga. El lisado a 20.000 Gs por hora.

Recoja la fracción media del hemolisado, dejando la capa superior de tolueno y el pellet intactos. Pase el hemólisis a través de un filtro de jeringa de 0,44 micrómetros. Si la solución contiene partículas y no se puede pasar a través del filtro, repita la centrifugación a alta velocidad.

Ahora purifique la hemoglobina con una columna de intercambio aniónico de cromatografía líquida de alta resolución. Utilice una fase A móvil de 10 milimolares tris, HCL, y una fase móvil B de 10 milimolares tris, HCL más cloruro de sodio 0,5 molar. Ejecute un gradiente de 0% a 100% de solvente B durante dos minutos a un caudal de dos mililitros por minuto.

Monitoree la elución en función de la absorción a 410 nanómetros y 280 nanómetros. Recoja la fracción caracterizada por un color rojo brillante y un pico de absorción prominente. Diálisis la elución contra solución salina tamponada con fosfato durante aproximadamente 16 horas.

Para esterilizar la muestra, pásela a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros para determinar la concentración de hemoglobina. Prepare las soluciones estándar de HP en PBS. Ahora mezcle las soluciones estándar o las soluciones de muestra con dos reactivos xra kins en una proporción de uno a uno en placas de 96 pocillos después de una incubación de 15 minutos para medir la absorbancia a 540 nanómetros.

Traza una curva estándar y determina la concentración de HP de las muestras de cinco a 15 miligramos por mililitro. Los rendimientos son alícuotas típicas de 15 a 20 microgramos de muestra de hemoglobina purificada en dos geles de página 15%STS. Teñir uno de los geles y transferir las proteínas de otro gel a una membrana de nitrocelulosa para inmuno borrar para hemoglobina, congelar y almacenar un mililitro de alícuotas de la hemoglobina aislada en nitrógeno líquido de un caldo congelado rayado S aureus en tríptico, agar soja, e incubar a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas.

Inocular colonias individuales en cinco mililitros de RPMI que contengan E-D-D-H-A y cultivar a 37 grados Celsius con agitación a 180 RP M durante la noche. Granular las bacterias por centrifugación durante cinco minutos a 7, 500 Gs. Luego Resus, suspender las bacterias en RPMI que contengan 0,5 milimolares E-D-D-H-A, y normalizar a un OD 600 de aproximadamente tres. A continuación, prepare N-R-P-M-I que contenga 2,5 microgramos por mililitro, HB y de 0,1 a un milimolar E-D-D-H-A para quelar el hierro libre.

Ahora, subcultivando 10 microlitros de suspensión bacteriana en un mililitro de N-R-P-M-I más E-D-D-H-A más HP incuban los cultivos a 37 grados Celsius durante un máximo de 48 horas con agitación a 180 RRP M cada seis a 12 horas. Retire 50 microlitros de la mezcla de cultivo con 150 microlitros de PBS en placas de 96 pocillos y tome lecturas de OD 600. En esta purificación por HPLC de hemoglobina humana a partir de hemolisado, se mide la absorbencia de eluido a longitudes de onda de 280 y 410 nanómetros con la fracción cinco que contiene la hemoglobina.

Por lo general, se obtienen rendimientos de cinco a 15 miligramos de hemoglobina por mililitro por preparación. La hemoglobina purificada se analizó por duplicado, y los geles se sustituyeron por proteínas o se transfirieron a nitrocelulosa e inmunotransferencia. A continuación, se probó la capacidad de la hemoglobina humana purificada para apoyar el crecimiento de ASUS de tipo salvaje y ASUS que carecen del receptor de hemoglobina necesario para la adquisición de hierro derivado de la hemoglobina.

El aumento de la densidad óptica de los cultivos a lo largo del tiempo indica que en N-R-P-M-I más E-D-D-H-A más hb, el tipo salvaje ASUS prolifera, pero el mutante no. Por el contrario, la capacidad de utilizar el hierro libre suplementado es idéntica tanto en las cepas de tipo salvaje como en las mutantes, y ninguna de las dos prolifera en ausencia de una fuente. En esta comparación de medios suplementados con hemoglobina purificada de sangre fresca o hemoglobina liofilizada, la hemoglobina purificada de sangre requiere ISDB para su crecimiento.

Mientras que la hemoglobina liofilizada permite la proliferación del mutante ISDB Una vez dominada, se puede completar una purificación adecuada de la hemoglobina en unas pocas horas. Recuerde que los donantes son portadores potenciales de patógenos transmitidos por la sangre, por lo que debe tratar la sangre humana como un material biopeligroso.