Name: Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende un ensayo de crecimiento para estudiar la adquisición de hierro en Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina humana purificada. Este método permite identificar factores bacterianos críticos en la obtención de hierro.

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Esta investigación fue apoyada por los EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvenciones AI69233 y AI073843 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. EPS es un compañero Burroughs Wellcome en la patogénesis de las enfermedades infecciosas. KPH fue financiado por el Celular y Molecular Microbiología Programa de Entrenamiento de subvención T32 5 A107611-10.

1. La purificación de la hemoglobina de la sangre fresca <ol><li> Adquirir sangre humana fresca suplementada con un anticoagulante. Mantener la sangre en hielo oa 4 ° C durante toda la purificación. </li><li> Centrifugar la sangre durante 20 min a 1.500 x g. Los glóbulos rojos (GR) será en la parte inferior del tubo. Aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente en helado 0,9% (w / v) de solución de NaCl. Repetir la centrifugación y lavar 3 veces. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 volumen de helado de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Esto induce la lisis de los glóbulos rojos debido a la presión osmótica. Añadir tolueno a ~ 20% del volumen final. </li><li> Incubar a 4 ° C durante la noche en un asador. </li><li> Se centrifuga el lisado a 20.000 xg durante 1 hr. Recoger la fracción hemolizado medio dejando intacto el tolueno (flotante en la parte superior) y pellet. Utilizar una pipeta de cuello largo para recoger la fracción intermedia. </li><li> Pasar a través de filtro de jeringa de 0,44 m. Si la solución contiene partículasla materia y no se puede pasar a través del filtro, repita el paso 1,5. </li><li> Purificar la hemoglobina (Hb) con una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en columna de intercambio aniónico (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 micras, 150 mm x 4,6 mm). La fase móvil A es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) y la fase móvil B es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un 0% -100% de gradiente de disolvente B se ejecuta más de 2 min a una velocidad de flujo de 2,0 ml / min. La elución se controla sobre la base de la absorción (λ: 410 nm y 280). Recoger sólo la fracción caracteriza por un color rojo brillante y un pico de absorción prominente (Figura 1). </li><li> Dializar la elución contra salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche y luego durante unas pocas horas más. Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras jeringa. </li><li> Para medir la concentración de Hb, preparar las soluciones estándar de concentraciones conocidas de Hb en PBS. Determinar la concentración de Hb en la muestra mediante la mezcla de las soluciones patrón (véase la tabla con reactivos nosotrosed) o la solución de la muestra con el reactivo de Drabkin 2x (preparado a partir de polvo) en una relación 1:1. Por ejemplo, mezclar 100 l solución de Hb con 100 l de reactivo de Drabkin 2x en placas de 96 pocillos. Incubar durante 15 min y la absorbancia medida a 540 nm. Trazar una curva estándar y determinar la concentración de Hb en la muestra. Cinco a quince mg / ml rendimientos son típicos. </li><li> Ejecutar 15-20 g hemoglobina purificada en un 15% SDS-PAGE por duplicado. Mancha de uno de los geles; transferir las proteínas a partir de otro gel a una membrana de nitrocelulosa y de inmunotransferencia para la hemoglobina (Figura 2). </li><li> Congelar y almacenar alícuotas de 1 ml de hemoglobina en nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Preparación de hierro agotan Medios de Crecimiento <ol><li> Preparar Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo disolviendo el polvo RPMI en agua, añadir bicarbonato de sodio según lo recomendado por el fabricante y el 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,2 micras y refrigerador tiendaerated. </li><li> Preparar metálica empobrecida en RPMI (NRPMI) mediante la adición de 7% (w / v) Chelex 100 y mezcla durante la noche en una placa de agitación. Eliminar Chelex 100 pasando a través de un filtro de 0,2 micras y almacén refrigerado. Suplemento medios imprescindibles de metales no ferrosos: 25 mM ZnCl 2, 25 mM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 y 1 mM MgCl 2, preparado de antemano como una solución estéril x 1.000. Use recipientes desechables de plástico para este paso para evitar la contaminación de hierro de re-utilizables suministros. </li></ol> 3. Staphylococcus aureus Crecimiento utilizando hemoglobina como una única fuente de hierro <ol><li> Streak S. para el aislamiento de S. aureus en agar tripticasa soja (TSA) de un stock congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 h. </li><li> Resuspender etilendiamina-N, N&#39;-bis (2-hidroxifenilacético) (EDDHA) en etanol anhidro a 100 mM. EDDHA no entra en solución, pero se esteriliza por etanol. </li><li> Añadir EDDHA de RPMI a una concentración final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para disolver durante al menos 30 min antes de proceder al siguiente paso. Debido a la variación de lote a lote, la concentración final EDDHA puede ser necesario disminuir a 0,25 mm para permitir el crecimiento bacteriano. </li><li> Inocular colonias individuales de S. aureus en 5 ml de RPMI que contiene EDDHA en 15 ml con tapón de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C con agitación a 180 revoluciones por minuto (rpm) durante 16-20 h. </li><li> Centrifugar los cultivos de una noche durante 5 min a 7.500 xg y resuspender el precipitado en NRPMI que contiene 0,5 mM EDDHA. Normalizar OD 600 a ~ 3. </li><li> Preparar NRPMI que contiene 2,5 g por ml Hb y EDDHA 0.1-1.0 mM. Debido a la variación entre los lotes, la concentración de EDDHA requerido para quelar el hierro libre en NRPMI puede variar. </li><li> Subculture 10 l de suspensión bacteriana de la etapa 1 en 3,5 ml NRPMI + EDDHA + Hb en un 15 ml con tapón de rosca tubo cónico. </li><li> Incubar los cultivos a 37 ° C durante un máximo de 48 horas con agitación a 180 rpm o en un tambor de enrollamiento. </li><li&gt; Cada hora 12.06 tomar lecturas de OD 600 mediante la eliminación de 50 l de la cultura y la mezcla con 150 ml de PBS en placas de 96 pocillos. </li></ol>

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<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El hierro es un nutriente esencial requerido por los organismos de todos los reinos de la vida 15. En los vertebrados, el hierro es retenido para evitar la toxicidad causada por este elemento. Este secuestro también oculta de hierro de los microbios invasores en un proceso conocido como inmunidad nutricional 16. En respuesta, los patógenos han desarrollado estrategias que evitan la inmunidad nutricional. Uno de estos mecanismos depende de la hemoglobina, que es la fuente más abundante de hierro den...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> HPLC columna de intercambio de aniones </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo de Drabkin </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> La hemoglobina normal </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 sodio forma </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobina un anticuerpo </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Agar de soja tríptico </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus es una bacteria patógena que requiere de hierro para llevar a cabo las funciones metabólicas vitales y causan enfermedades. El depósito más abundante de hierro en el interior del huésped humano es heme, que es el cofactor de la hemoglobina. Para adquirir el hierro de la hemoglobina, S. aureus utiliza un complejo sistema conocido como el determinante superficie regulada por hierro (Isd) del sistema 1. Los componentes del sistema Isd primero hemoglobina anfitrión bind, a continuación, extraer e importar hemo, y, finalmente, liberar el hierro del grupo hemo en el citoplasma bacteriano 2,3. Esta vía ha sido diseccionado a través de numerosos estudios in vitro 4-9. Además, la contribución del sistema de Isd a la infección se ha demostrado repetidamente en modelos de ratón 8,10-14. El establecimiento de la contribución del sistema de Isd a la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro y crecimiento ha demostrado ser más difícil. Ensayos de crecimiento usando hemoglobina como única fuente de hierro son complicadas by la inestabilidad de la hemoglobina disponible comercialmente, contaminando hierro libre en el medio de crecimiento, y la toxicidad asociada con quelantes de hierro. Aquí presentamos un método que supera estas limitaciones. Hemoglobina de alta calidad se preparó a partir de sangre fresca y se almacena en nitrógeno líquido. Hemoglobina purificada se completa en hierro-agotan medio que imitan el entorno pobre en hierro encontrada por patógenos dentro del huésped vertebrado. Al privar S. aureus de hierro libre y se completa con una forma mínimamente manipulados de hemoglobina que inducir el crecimiento de una manera que es totalmente dependiente de la capacidad de unirse a la hemoglobina, extraer hemo, heme pasar a través de la envoltura celular bacteriana y degradar hemo en el citoplasma. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan para dilucidar los mecanismos de adquisición de hierro hemoglobin-/heme-derived en S. aureus y posiblemente otros patógenos bacterianos.

Hemos purificado hemoglobina humana de hemolizado con HPLC (Protocolo de paso 1,7). Figura 1 muestra registró la absorbancia del eluato a 280 y 410 nm longitud de onda. La fracción 5 se recogió y otras fracciones fueron descartados. Los rendimientos de cinco a quince miligramos de hemoglobina por mililitro de eluato se adquieren. Hemoglobina purificada se analizó por SDS-PAGE por duplicado y los geles se tiñeron para las proteínas o se trasladaron a nitrocelulosa y se inmunotransfirieron (Protocolo de p...

Aquí se describe un ensayo de crecimiento para<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando hemoglobina como la única fuente de hierro nutrientes disponibles. Este ensayo establece el papel de los factores bacterianos implicados en la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro.

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Este experimento prueba la capacidad del Staphylococcus aureus para utilizar la hemoglobina humana como única fuente de hierro. Primero, aísle los glóbulos rojos de la sangre humana fresca. Purifique la hemoglobina mediante cromatografía líquida de alta resolución para garantizar la integridad de la hemoglobina.Ahora agregue hemoglobina en el medio empobrecido en hierro para suministrar el hierro en forma de hemoglobina Next cultivo. S reus. En presencia de hemoglobina y medir su capacidad para utilizar la hemoglobina como fuente de hierro.Los resultados muestran que el as reus prolifera en presencia de hemoglobina como única fuente de hierro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como si un patógeno puede utilizar las proteínas del huésped como fuentes de hierro y qué mecanismos se requieren para utilizar el hierro mediante este proceso. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la adquisición de hierro de estafilococos reus a partir de la hemoglobina.También se puede aplicar a los estudios de otras bacterias y cómo utilizan las proteínas que contienen hierro del huésped. Demostrando esta técnica estarán GLA Ani

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo general para el estudio de la invasión de las células huésped por un patógeno bacteriano, centrándose...

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Fuente: Gupta, S., et al. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para cultivar Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas de hierro para inducir estrés ferropérico y promover la secreción de sideróforos que apoyan la supervivencia bacteriana.

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas por el hierro

Fuente: Maurakis, S., et al. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra un ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales. Las bacterias mutantes y de tipo salvaje cultivadas en un medio sin metal se incuban con ligando metálico y su crecimiento se monitorea mediante un...

Ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales

Fuente: Behera, R.K. et al., Un método basado en fluorescencia para estudiar la regulación génica bacteriana en tejidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra la preparación de cultivos hemolíticos de Staphylococcus aureus para estandarizar el crecimiento bacteriano y lograr la sincronización metabólica para estudios de interacción huésped-patógeno.

Preparación de un cultivo hemolítico de Staphylococcus aureus para estudios de interacción huésped-patógeno

En este vídeo, demostramos un ensayo para detectar la citotoxicidad de cepas de S. taphylococcus aureus virulentas y menos virulentas frente a neutrófilos humanos después de la fagocitosis utilizando citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad de cepas de Staphylococcus aureus en neutrófilos después de fagocitosis

Aquí se describe un protocolo para la extracción de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus y su posterior análisis por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas.

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Aquí describimos un método para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en medio líquido restringido por metal para facilitar la expresión de genes para la toma de metales. También delineamos experimentos aguas abajo para caracterizar el fenotipo de gonococci cultivados en estas condiciones. Estos métodos pueden adaptarse para ser adecuados para la caracterización de genes sensibles al metal en otras bacterias.

Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands

Este protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar el alcance de la internalización de Staphylococcus aureus y su capacidad para sobrevivir dentro de la célula huésped humana, así como la eficacia intracelular de los compuestos antimicrobianos.

Ensayo de protección enzimática mejorado para estudiar la internalización de Staphylococcus aureus y la eficacia intracelular de compuestos antimicrobianos

En este manuscrito, proporcionamos un protocolo completo para evaluar la supervivencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, transformando plásmidos en P. aeruginosa y S. aureus para crear cepas reporteras y visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, mediante microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo.

Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

Aprende un ensayo de crecimiento para estudiar la adquisición de hierro en Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina humana purificada. Este método permite identificar factores bacterianos críticos en la obtención de hierro.

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

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