Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

El mantenimiento de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas y moribundas sin interrumpir la función de barrera. Para lograr esto, los epitelios extruyen las células moribundas formando y contrayendo un anillo de actina y miosina en la célula que rodea a la célula moribunda para expulsarla y cerrar los espacios que puedan haber resultado de su salida. En este artículo de video, Un método para inducir e imaginar la extrusión de células apoptóticas de la epidermis de larvas de pez cebra en tiempo real.

En la imagen, esto se logra mediante la inyección de una sonda de actina F marcada con proteína fluorescente roja en embriones de pez cebra transgénicos en una etapa celular que expresan proteína fluorescente verde en la epidermis para visualizar los filamentos que actúan en los tejidos epiteliales. Al cuarto día, las larvas posteriores a la personalización que expresan tanto GFP como RFP se tratan con G 4 18 para inducir la apoptosis en la epidermis. La dinámica de la actina y los cambios en la forma de las células epiteliales que se producen durante la extrusión se visualizan mediante imágenes de lapso de tiempo en un microscopio confocal de disco giratorio.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la inmunofuerza y los análisis, es que podemos observar los cambios rápidos y la dinámica de la actina que se producen durante el proceso de extrusión en un tejido epitelial vivo. En este video, le mostraremos un procedimiento para la extrusión de imágenes de células apoptóticas de la epidermis de peces cebra en desarrollo en tiempo real. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para comprender cómo las células reorganizan coordinadamente su citoesqueleto de actón para eliminar las células apoptóticas mientras mantienen la función de barrera y cómo la interrupción del proceso de extrusión puede conducir a ciertos estados de enfermedad.

Así que comencemos: para visualizar la dinámica de acción durante la extrusión celular en la epidermis del pez cebra en desarrollo, comience por descongelar el ARN previamente transcrito en hielo. Transcribimos el Mr.mRNA que codifica la proteína fluorescente roja fusionada con la calp en el dominio de homología de la utrofina y actuamos en la proteína de unión. Agregue rojo de fenol al ARN en una proporción de uno a uno para obtener una concentración final de ARN de alrededor de 30 nanogramos por microlitro y cargue un microlitro de solución en una aguja capilar estirada mediante relleno posterior.

Recoja alrededor de 75 embriones de 1 etapa celular C-K-G-F-P en tampón E tres. Pipetear los embriones recolectados en el molde de microinyección con una pipeta de pasta de cinco y tres cuartos y orientar suavemente los embriones en el canal con FST Dumont. En quinto lugar, las pinzas funcionan rápidamente para evitar tener que inyectar el ARN en embriones de varias etapas bajo un microscopio estereoscópico de disección de laboratorio estándar.

Utilice un microinyector controlado por presión para inyectar el ARN en el yugo de los embriones como fósil de fenol. El rojo debe ser visible en el embrión después de la inyección. Asegúrate de inyectar al menos 50 embriones para cada experimento.

Clasifique los embriones para eliminar los óvulos no fertilizados o dañados e incube todos los embriones restantes a 28 grados centígrados. Después de 24 horas, use un microscopio de disección fluorescente para seleccionar embriones de pez cebra que tengan un alto nivel de fluorescencia GFP en la epidermis y fluorescencia actuante marcada con RFP. Incubar los embriones seleccionados a 28 grados centígrados hasta que estén listos para continuar con el tratamiento farmacológico para inducir la exposición por apoptosis al aminoglucósido.

El antibiótico G 44 18 o medicamento provoca la extrusión de células apoptóticas de la epidermis de las larvas de pez cebra en desarrollo. Es importante destacar que este tratamiento solo funciona en larvas que tienen cuatro días después de la fertilización y son mayores para inducir la extrusión celular. Recoja hasta 25 larvas de pez cebra después de la fertilización de 4 días que expresen GFP y RFP en un plato de cultivo de 35 por 10 milímetros que contenga tres mililitros de medio E tres.

Reemplace cuidadosamente el medio con tres mililitros de E tres que contengan un miligramo por mililitro de G cuatro 18 e incube la larva en el medicamento durante cuatro horas en la oscuridad a 28 grados centígrados. A continuación, retire el medio y reemplácelo con E precalentado tres medios que contengan 0.02%trica y proceda a montar las larvas para montar las larvas para la obtención de imágenes. Transfiera hasta tres larvas a un tubo fendor de 1,5 mililitros y retire la mayor parte del medio E tres.

Con una punta de pipeta cortada, pipetea 120 microlitros de 1%,, Y luego pipetear suavemente la mezcla de larvas y aro en el vidrio de cobertura en el fondo de una placa de cultivo de matech. Usando un soporte de alfiler FST con un alfiler de inserción o una aguja de tungsteno adjunto, oriente rápidamente las larvas para que queden rectas y planas contra el vidrio de cobertura.

Deje que el aose se solidifique. A continuación, llene suavemente el plato con E tres medios que contengan 0,02%trica. Hemos encontrado que todo el proceso de extrusión de células apoptóticas de la epidermis de las larvas de pez cebra en desarrollo toma aproximadamente 20 minutos.

Aquí demostramos cómo configurar un experimento de imágenes de lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal de disco giratorio y el software and or IQ para recolectar una serie de planos Z a través de una sola capa de la epidermis del pez cebra. Primero, encienda la cámara del microscopio de láseres de neón de argón y helio y la lámpara epifluorescente dentro del software y/o IQ. Cree un protocolo de serie temporal que contenga las longitudes de onda que se van a visualizar.

La frecuencia de los intervalos entre las capturas de imágenes y el número de veces que se debe repetir la captura: Coloque suavemente el plato mattec que contiene el espécimen en la platina del microscopio y luego use un objetivo de 20 veces con luz transmitida para enfocar las larvas. Mueva el objetivo de inmersión en agua 40 veces a la posición correcta. Con este objetivo, podemos filmar aproximadamente de 20 a 25 células por campo, lo que nos permite seguir los comportamientos celulares durante la extrusión, al mismo tiempo que resolvemos la dinámica de acción subcelular.

Coloque con cuidado una gota de agua en la parte superior del objetivo de 40 veces y coloque rápidamente el plato mattec encima. Identifique la muestra utilizando iluminación de campo claro y, a continuación, utilice la epifluorescencia de 488 nanómetros para centrarse específicamente en la epidermis GFP positiva. Cambie al modo de escaneo confocal.

Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada uno de los canales en consecuencia. Tenga cuidado de equilibrar la potencia del láser y el tiempo de exposición para una detección óptima de su señal y para evitar cualquier fototoxicidad. Para identificar las células que extruyen, utilice la epifluorescencia para visualizar la epidermis marcada con GFP e identifique un grupo de células en un patrón de roseta clásico que consiste en una colección de células que rodean una pequeña célula redonda en el medio.

Además, debe haber una acumulación de la actina marcada como RFP visible como un anillo alrededor de la pequeña celda redonda en el medio, un sello distintivo de la extrusión celular. Una vez que se haya identificado una celda de extrusión, establezca rápidamente los límites superior e inferior para la serie Z y el tamaño del paso. A continuación, comience a adquirir cuatro conjuntos de datos confocales D para ver los datos y visualizar la contracción del anillo de actina y los comportamientos epiteliales que se producen alrededor de la célula moribunda.

Con el tiempo, realice proyecciones en 3D de la serie Z y guarde los datos como un archivo de película. Este paso se puede realizar utilizando una variedad de paquetes de software. Esta figura muestra la expresión de RFP UTR CH en la epidermis de una larva de pez cebra CK GFP cuatro días después de la fertilización.

Aquí todavía se encuadran las proyecciones Z de una película de lapso de tiempo que siguen la dinámica de la actuación en vivo. Durante el proceso de extrusión de las células epiteliales se muestran las flechas que denotan el anillo de actina formado por las células vecinas, que se contrae y se cierra en el transcurso de dos minutos. Siguiendo este procedimiento, podemos utilizar otros métodos en combinación con esta técnica, como el uso de inhibidores químicos o mutaciones genéticas para comprender mejor cómo la alteración de la extrusión puede conducir a ciertos estados de enfermedad.

A raíz de la incapacidad de eliminar las células apoptóticas, acabamos de mostrarle cómo configurar un experimento de imágenes de lapso de tiempo para visualizar el proceso de extrusión de la epidermis del pez cebra en desarrollo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe limitar la cantidad de luz expuesta a su muestra para evitar cualquier fotoblanqueo o toxicidad. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.