Name: Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a visualizar la extrusión celular en tiempo real en la epidermis de Danio rerio mediante microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite estudiar la dinámica de actina durante la eliminación de células apoptóticas en tejidos epiteliales vivos.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Rosenblatt para los debates científicos, sugerencias y comentarios. También nos gustaría agradecer a María Halloran, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica RFP-UtrCH Grunwald y David, que siempre que el CK: GFP pez cebra transgénico. Gracias también a Gretchen Rey y el personal de los recursos de pez cebra centralizada en la Universidad de Utah para el mantenimiento de una excelente y el cuidado del pez cebra. Esta labor fue apoyada por Premio a la Innovación de Nueva NIH-NIGMS director de los NIH de un DP2 OD002056-01 a JR. GTE fue apoyado por el NIH Multidisciplinario del Cáncer Programa de Capacitación 5T32 subvención CA03247-8.

Flujo de trabajo básico para la visualización de la dinámica de actina durante la extrusión celular en la epidermis del pez cebra en desarrollo La epidermis del pez cebra en desarrollo se compone de dos capas distintas, la capa superficial (o peridermis) y una capa basal de células que en contacto con la membrana basal 2. Las células de la capa superficial externa someten a la apoptosis y se eliminan de los tejidos por extrusión 3 (Figura 1). Para visualizar este proceso en tiempo real, se inyecta el ARN que codifica la proteína fluorescente de color rojo unido al dominio de homología calponin de utrofina, una proteína de unión actina (RFP-UtrCH) 4,5, en una de las células etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP ) bajo el epitelio estratificado promotor citoqueratina 8 6 (Figura 2A). A pesar de RFP-UtrCH se expresó doquier en los animales después de la inyección de ARN, que se centran en las células superficiales epidérmicas que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y RFP para seguir la dinámica de actina en concreto en la epidermis (Figura 2B). A continuación, el tratamiento de las larvas con G418 para inducir extrusión celular por apoptosis y la imagen de los filamentos de actina y la epidermis con un microscopio confocal de disco giratorio y adquirir bases de datos 4D. Antes de iniciar el experimento <ol><li> In vitro transcribir el ARN a partir de una plantilla de ADN lineal con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) y purificar el ARN tope utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Diluir el ARN a ~ 60ng/ul con agua estéril, hacer 3-5μl alícuotas y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para la inyección. Nota: Evite congelar repetitivas / descongelación para impedir la degradación del ARN. </li><li> Hacer un molde para mantener los embriones durante la inyección mediante el vertido de 40 ml de agarosa al 2% en medio de embriones E3 (E3) en una placa de 100 x 15 mm cultura y la colocación de un molde de microinyección (Adaptive Herramientas de Ciencia, # I-34) en esta bandeja. Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar el molde para exponer los senos de la agarosa. Guarde la placa a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Tire las agujas de inyección capilar para el uso de vidrio de borosilicato con filamentos (OD 1,0 mm, 0,78 ID, longitud 10 cm) y un Sutter P-97 Extractor de una pipeta en los siguientes valores (Heat 485, Tire 50, Velocidad 60, Delay / Hora 90, de presión 200 ). Nota: Los diferentes tipos de vidrio se requiere la optimización de las condiciones mencionadas. </li><li> Representan el 1% de baja fusión (LM) de agarosa en E3 y almacenar alícuotas de 1 ml a 42 ° C. Ten cuidado ya que la evaporación del E3 de las reservas puede aumentar la concentración de agarosa. </li><li> Mantener el pez cebra adulto en condiciones de laboratorio estándar, con un regular de luz / oscuridad ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad 7. La noche antes de la configuración del experimento los peces a su compañero mediante la colocación de 3 mujeres y 2 hombres en un tanque separados por un divisor. A la mañana siguiente, cambiar el agua en el tanque y sacar el divisor cuando las luces se encienden. </li></ol> 1. La inyección de ARN que codifica la proteína actina marcado con fluorescencia Encuadernación <ol><li> Descongele el ARN en el hielo. Añadir un 0,5% de rojo fenol al ARN en una proporción de 1:1 para una final de la concentración de ARN del ~ 30ng/μl y la carga de solución 1μl en una aguja capilar tiró por atrás de llenado. </li><li> Recoge un ~ 75 células etapa 8 CK: embriones GFP en el E3. Pipeta de la recogida de embriones en el molde de la microinyección con una pipeta Pasteur 5 ¾ y orientar suavemente los embriones en el canal con FST Dumont # 5 fórceps. Nota: Tenga cuidado al trabajar con rapidez para evitar la inyección en un embrión en su fase de varias celdas, lo cual puede resultar en la expresión del mosaico de la ARN inyectada. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico estándar de laboratorio de disección, se inyecta el ARN en la yema de los embriones con un microinyector controlada por presión (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-inyector). Un punto rojo (rojo fenol) debe ser visible en el embrión después de la inyección. Inyectar por lo menos 50 embriones para cada experimento. (Vea el protocolo JoVe anterior para un protocolo detallado de inyección de ARN en embriones de pez cebra 9). Nota: <ol type="A"><li> Un volumen de ~ 2NL se debe utilizar para la inyección de ARN en una célula de embriones etapa. Para determinar la cantidad de ARN inyectado, prescindir de un bolo de la ARN en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro calibrado o con un microscopio con una barra de escala construido por los oculares. La gota de la ARN debe ser una esfera perfecta. Calcular la cantidad entregada por medio de la ecuación: Volumen (en nl) = 4/3πr 3. Ajustar el volumen entregado por el cambio de la presión de inyección o el tiempo en el instrumento. </li><li> También se deberían tomar para inyectar la menor cantidad de ARN que permite la visualización del fluoróforo, como altas concentraciones de ARN pueden ser tóxicos para el embrión en desarrollo. Para determinar el nivel de expresión apropiado, un experimento de dosis de la curva se debe realizar antes de ejecutar el experimento. &lt;/ Li&gt; </li></ol></li><li> Clasificar los embriones para eliminar los huevos no fertilizados o dañadas y colocar todos los embriones sobrantes a 28,5 ° C. </li><li> Después de 24 horas, usar un microscopio de fluorescencia de disección para seleccionar embriones de pez cebra que tienen un alto nivel de las buenas prácticas agrarias (epidermis) y la fluorescencia de RFP (actina). Colocar los embriones seleccionados a 28,5 ° C hasta que esté listo para proceder con el tratamiento con fármacos para inducir la apoptosis. </li></ol> 2. La inducción de la extrusión celular en larvas de pez cebra con G418 Hemos encontrado que la exposición al antibiótico aminoglucósido G418, o geneticina, provoca la apoptosis y la extrusión de las células epidérmicas en el desarrollo de larvas de pez cebra 3 por un mecanismo desconocido. Es importante destacar que este tratamiento sólo funciona en las larvas que son cuatro días después de la fecundación en adelante. Nos encontramos con que ~ 25.5 células pueden encontrarse en la extrusión en un momento dado de la aleta epitelial del G418 tratados larvas de pez cebra. Como la cantidad de células apoptóticas extrusión puede variar de un pez a, le recomendamos el montaje de pescado múltiples imágenes. <ol><li> Recoger y colocar cuatro días después de la fertilización (dpf) larvas de pez cebra exhibiendo las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia en una placa de 35 x 10 mm de la cultura que contiene 3 mililitros (ml) de la E3. Uno puede tratar hasta 25 larvas en esta placa de cultivo de tamaño. </li><li> Vuelva a colocar cuidadosamente los medios de comunicación con 3mLs de 1mg/ml E3 que contiene larvas de G418 y se incuban en el medicamento durante 4 horas a 28,5 ° C. Tenga en cuenta que G418 es sensible a la luz, así que tenga cuidado para mantener la placa de cultivo cubierto o en la oscuridad. </li><li> Eliminar los medios de comunicación y reemplazarlos con pre-calentado 28,5 ° C E3 Media que contiene 0,02% tricaína y proceder a la fijación de las larvas. </li></ol> 3. Las larvas de pez cebra de montaje de imágenes <ol><li> La transferencia de 3 larvas de un tubo eppendorf de 1,5 ml y eliminar la mayor parte de la E3 después de que el disipador de peces hasta el fondo del tubo. Hemos encontrado que hasta el 3 animales puede ser montado correctamente antes de la agarosa solidifica. </li><li> Usando una punta de pipeta corte, 120ul pipeta de 1% de agarosa LM-(42 ° C) en el tubo, mezclar, y luego una pipeta suavemente las larvas y la mezcla de agarosa en el cubre objetos en el fondo de una placa de cultivo MatTek. </li><li> Utilizando un soporte FST pin con una clavija de inserción o de aguja de tungsteno, orientar rápidamente las larvas por lo que son rectos y planos contra el cubre objetos del plato MatTek. Nota: Se suelen usar un alfiler para orientar primero la larva y luego un pin en forma de L para asegurarse de que son planas contra el cubre objetos, mientras que la prevención de daños a los especímenes. </li><li> Una vez que la agarosa se ha solidificado, vierta el plato con la E3 que contiene 0,02% tricaína. Nota: Como alternativa, G418 se puede agregar a la E3 en el plato de imagen para seguir la inducción de la extrusión, aunque a largo plazo la exposición a 1mg/ml G418 va a matar a las larvas. </li></ol> 4. Imágenes en directo de la dinámica de actina y los comportamientos individuales células epiteliales durante la extrusión celular utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Hemos encontrado que todo el proceso de extrusión celular apoptótica de la epidermis de desarrollo de larvas de pez cebra se tarda aproximadamente 20 minutos 3. Aquí se demuestra cómo configurar un experimento de time-lapse para recoger una serie de planos z a través de una sola capa de la epidermis del pez cebra para visualizar el proceso de extrusión. Hemos encontrado que la típica de los microscopios de campo amplio fluorescentes causa importante photobleaching de los filamentos de actina y no permiten obtener imágenes timelapse. Por lo tanto, para maximizar nuestra resolución y prevenir photobleaching, se utiliza un microscopio confocal de disco giratorio. A continuación se describe cómo configurar el experimento usando el software IQ Andor con un microscopio Nikon, aunque los principios que se discuten se pueden aplicar a microscopio similares set-ups. <ol><li> En primer lugar, a su vez en el argón (para la excitación de las buenas prácticas agrarias en 488 nm) y HeNe (para la excitación de la RFP a 561nm) láser, microscopio, cámara y la lámpara de epifluorescencia. </li><li> Dentro del software Andor IQ (versión 1.10.1), crear un protocolo de series de tiempo que contiene las longitudes de onda que desee a la imagen, la frecuencia de los intervalos entre las capturas de imágenes y el número de veces de la captura se debe repetir. </li><li> Con cuidado, coloque el plato que contiene MatTek su muestra en la platina del microscopio y el uso de un objetivo de 20x con luz transmitida a centrarse en las larvas. </li><li> Mueva el objetivo de inmersión en agua 40 veces (NA 0,8) en la posición correcta. El uso de este objetivo, podemos filmar aproximadamente 20 a 25 células por campo, lo que nos permite seguir los comportamientos celulares durante la extrusión a la vez que la resolución subcelular dinámica de la actina. Nota: El montaje mismo y las estrategias de imagen se pueden aplicar a microscopios verticales, aunque un objetivo de inmersión en agua 40 veces con una distancia de trabajo debe ser utilizado. </li><li> Con cuidado, coloque una gota de agua en la parte superior del objetivo de 40x y poner rápidamente el plato MatTek en la parte superior. Noe: Zeiss solución de inmersión Immersol también se puede utilizar si la evaporación del agua es un problema. </li><li> Identificar la muestra con la fase o la iluminación DIC y luego usar epifluorescencia 488nm para centrarse específicamente en la epidermis GFP positivos. </li><li> Cambiar al modo confocal de barrido. Ajustar la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada uno de los canales (488nm y 561nm) en consecuencia. Tenga cuidado de equilibrar la potencia del láser y el tiempo de exposición para la detección óptima de la señal y evitar que se photobleaching o toxicidad. </li><li> Para identificar las células de extrusión, el uso de epifluorescencia para visualizar la GFP etiquetados epidermis e identificar a un grupo de células en un patrón de roseta clásico, que consiste en un conjunto de células que rodean una pequeña celda redonda en el centro. Usando el modo confocal de barrido, también debería ser una acumulación de la actina RFP marcado visible como un anillo alrededor de la célula pequeña y redonda en el medio, un sello distintivo de la extrusión de la célula. Una vez que haya identificado una célula de extrusión, configurar rápidamente el microscopio para adquirir 4D (XYZ-Time) datos confocal. </li><li> Establecer los puntos superior e inferior en el plano z para visualizar una sola capa de la epidermis, incluida la celda de extrusión, y seleccionar el tamaño del paso. Por lapso de tiempo de imágenes, ajustar los intervalos de captura de imágenes y el número de repeticiones. Por ejemplo, adquieren una z-series que abarcan 5-10μm, con un tamaño de micras un paso, cada 1-2 minutos durante 30 minutos. </li><li> Para ver los datos, que suelen hacer las proyecciones 3-D de la serie Z y guardar el conjunto de datos como un archivo de película que es compatible con QuickTime (Apple). De esta manera, podemos visualizar la contracción del anillo de actina y los comportamientos epiteliales que se producen alrededor de la célula que muere con el tiempo. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de la extrusión de las células apoptóticas. Los filamentos de actina se muestran en rojo, las células epidérmicas de GFP positivos son de color verde. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Flujo de trabajo experimental. A. Esquema del flujo de trabajo para el experimento. B. Expresión de la RFP-UtrCH en la epidermis de un CK 4dpf: GFP pez cebra. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sin embargo marcos (z-proyecciones) de una película de lapso de tiempo que sigue viva la dinámica de actina durante el proceso de extrusión de las células epiteliales. Las flechas indican el anillo de actina formado por las células vecinas que se contrae y se cierra en el transcurso de 2 minutos.

<ol><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li>
<li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li>
<li>Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
<li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%2C+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
</ol>

Garantía de bienestar de los animales Todos los procedimientos realizados en el presente protocolo con el pez cebra, Danio rerio, han sido aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Utah (Aseguramiento de Bienestar Animal # 10-07017).

El protocolo se describe aquí se muestra un método simple y sencillo de visualizar el proceso de extrusión en un tejido epitelial en vivo. Este tipo de experimento nos permite examinar las sutilezas de la dinámica de actina no se había supuesto en los análisis de tejidos fijados, y por lo tanto, complementa los métodos comunes de inmunofluorescencia. Podemos utilizar este protocolo en combinación con inhibidores químicos o mutantes genéticos para analizar mejor el proceso de extrusión y los estados estudiar las enfermed...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reactivo </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reactivo </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Tanques que cruzaban </td><td> Herramienta </td><td> Thoren de Sistemas Acuáticos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La bomba de pipeta </td><td> Herramienta </td><td> Bel Art Productos </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipeta Pasteur </td><td> Herramienta </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinyección del molde </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de adaptación Ciencia </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de 100x15mm </td><td> Herramienta </td><td> Pescador </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipeta Extractor </td><td> Herramienta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modelo P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidrio de filamento </td><td> Herramienta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, 0.78mm ID, longitud 10 cm </td></tr><tr><td> Jar electrodo de almacenamiento </td><td> Herramienta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% en DPBS </td></tr><tr><td> Presión controlada y microinyector Micromanipulador </td><td> Herramienta </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de 35x10mm </td><td> Herramienta </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (geneticina) </td><td> Reactivo </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml en dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin titular </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserte las clavijas </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26007-02 y 03 </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo de vidrio Cultura plato con 1,5 cubreobjetos </td><td> Herramienta </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa Low Melt </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescentes microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio confocal de disco </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Equipado con un cabezal de disco Yokagawa spinning </td></tr><tr><td> Cámara CCD </td><td> Cámara </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micrones cuadrados píxeles </td></tr></tbody></table>

imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Mantenimiento homeostático de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas sin afectar la función de barrera. Nuestros estudios han encontrado que las células que mueren enviar señales a sus vecinos en vivo para formar y contratar a un anillo de actina y miosina que se expulsa hacia fuera de la hoja epitelial al cerrar las lagunas que pudiera haber resultado de su salida, un proceso llamado extrusión de la celda 1. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. Aquí se describe un método para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra. Para visualizar la extrusión, se inyecta una sonda roja de la proteína fluorescente etiquetados para la F-actina en los embriones de una célula etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente en la epidermis e inducir la apoptosis mediante la adición de G418 para las larvas. A continuación, el uso del tiempo-lapse de imágenes en un microscopio confocal de disco giratorio para observar la dinámica de actina y los comportamientos de las células epiteliales durante el proceso de extrusión celular por apoptosis. Este enfoque nos permite investigar el proceso de extrusión en vivo epitelio y proporcionar una vía para estudiar los estados de enfermedad causada por la falta de eliminación de células apoptóticas.

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

El mantenimiento homeostático de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas sin alterar la función de barrera. Nuestros estudios han revelado...

El mantenimiento de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de células dañadas y en muerte sin interrumpir la función de barrera. Para lograrlo, el epitelio extruye las células en muerte mediante la formación y contracción de un anillo de actina y miosina en la célula que rodea a la célula moribunda, expulsándola mientras cierra cualquier brecha que pudiera haberse generado tras su salida. En este artículo en video, se presenta un método para inducir y visualizar en tiempo real la extrusión de células apoptóticas desde el epitelio de larvas de pez cebra.En el ejemplo mostrado, esto se logra mediante la inyección de una sonda de F-actina marcada con una proteína fluorescente roja en embriones transgénicos de pez cebra de un estadio celular que expresan la proteína fluorescente verde en el epidermis, para visualizar los filamentos de actina en los tejidos epiteliales. Las larvas de día cuatro, posteriores a la personalización, que expresan tanto GFP como RFP, se tratan entonces con G418 para inducir apoptosis en el epidermis. La dinámica de la actina y los cambios en la forma de las células epiteliales que ocurren durante la extrusión se visualizan mediante imágenes

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Investigación

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Biología

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Aprende a visualizar la extrusión celular en tiempo real en la epidermis de Danio rerio mediante microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite estudiar la dinámica de actina durante la eliminación de células apoptóticas en tejidos epiteliales vivos.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

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