Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

El objetivo general del siguiente protocolo es permitir la interrogación a escala del genoma de la función génica mediante el monitoreo simultáneo de múltiples lecturas celulares. En esta demostración, se utilizan reporteros basados en luciferasa de luciérnaga (Firefly RAN) y luciferasa de Cipro Dina para monitorear la actividad de las vías P 53 WINT y KRAS, respectivamente. Estos tres reporteros se transfectan conjuntamente con ARNi dirigido a un gen de interés en células HCT one 16, una línea celular de cáncer colorrectal.

Posteriormente, se miden las actividades de la luciferasa de luciérnaga y de la luciferasa de vainilla en los lisados celulares, junto con la actividad de la luciferasa Cipro DEA. Un enzima secretado se mide en el cultivo. Se obtienen resultados del medio que muestran la reproducibilidad del sistema de ensayo, así como la capacidad para revelar acciones compartidas y únicas de genes dentro de estas tres vías relacionadas con el cáncer.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como microrray o pruebas multicolor es que representa una forma asequible, universal y rentable de analizar los productos de transcripción celular. Este método puede ayudar a responder preguntas en la investigación del cáncer, como el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a nivel molecular. Aunque nuestro protocolo de transfección transitoria requiere poco esfuerzo y un tiempo inicial mínimo para el montaje del ensayo, es probable que aumente la variabilidad de señal entre pozos, lo cual puede compensarse analizando las relaciones de expresión del reportero en lugar de examinar las lecturas absolutas provenientes de los pozos. Para comenzar este procedimiento, lave cinco placas de 10 centímetros cuadrados con células HCT116 al 80-90 % de confluencia con PBS y luego recupere las células mediante tripsinización para cada placa.

Utilice un mililitro de solución de tripsina seguido de la neutralización con 10 mililitros de DMEM que contenga 2 %FBS y 1 %penicilina. Transfiera las células en suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue aproximadamente a 130 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y re suspenda el botón celular en 10 mililitros de medio.

Cuente el número de células con un contador de células y luego prepare una solución celular con 10 a la quinta células por mililitro. Mantenga 150 mililitros de suspensión celular para el siguiente paso utilizando una placa dispensadora automática de líquidos multiposición. Añada 100 microlitros o 10 a la cuarta células en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos.

En este caso, la suspensión celular debería ser suficiente para sembrar placas de 1296 pocillos. Incube las placas con las células a 37 grados Celsius en un incubador con 5 % de dióxido de carbono mientras prepara la mezcla de transfección. El ADN del constructo reportero de alta calidad utilizado aquí se aisló mediante kits estándar de preparación MIDI y se diluyó a una concentración final de un miligramo por mililitro.

Para cada reportero, prepare 100 microlitros de solución stock del constructo de reportero combinando lo siguiente: 30 microlitros de P 53, 30 microlitros de FL, 30 microlitros de ocho X-T-C-F-R-L, 30 microlitros de elk uno G cuatro, 6 microlitros de U-A-S-C-L y 4 microlitros de H dos O. Esto dará como resultado una mezcla de ADN con una proporción final de uno a uno a uno a 0,2 de los reporteros y una concentración final de ADN de 0,3 miligramos por mililitro. A continuación, prepare mezclas de transfección de ARN-ADN suficientes para transfectar 1296.

Las placas de pozo diluyen 80 microlitros de la solución stock del constructo reportero en ocho mililitros de tampón EC del kit QIAGEN effecting para obtener una solución de ADN con una concentración final de tres microgramos por mililitro en la placa. Añadir 20 microlitros de la solución de ADN en cada pozo de una placa PCR de 96 pozos. El número de placas de 96 pozos dependerá de cuántas piscinas de irna se vayan a probar.

Por ejemplo, en este caso, necesitaremos 4 placas de 96 pocillos para evaluar. 384 diferentes grupos de siRNA utilizando un manipulador automático de líquidos biome para transferir dos microlitros de cada siRNA de cinco micromolar al pocillo correspondiente de la placa de PCR que contiene el stock de ADN diluido. A continuación, añada un microlitro de solución potenciadora a cada pocillo de la placa de ADN y siRNA.

Deje que la reacción del potenciador ocurra a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, agregue tres microlitros del reactivo de transfección a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. Para detener la formación del complejo de transfección, agregue 10 microlitros de DMEM que contenga 2% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a cada pocillo de la placa de PCR.

Retire las placas de 1296 pozos que contienen las células HCT116 del incubador. Transfiera 10 microlitros de la mezcla de transfección a cada pozo de una placa de 96 pozos que contenga las células, ya que cada transfección se realizará por triplicado. La misma mezcla se aplicará a dos placas adicionales de 96 pozos que contengan células.

Incube las células con las mezclas de transfección a 37 grados Celsius en un ambiente humedecido con 5% de dióxido de carbono durante 36 horas. 36 horas después de la transfección de las células, las actividades de luciferasa están listas para ser medidas.

Dado que este estudio incorpora múltiples reporteros, uno secretado al medio de cultivo y otros dos expresados en el citoplasma celular, las mediciones se obtendrán tanto del medio de cultivo como de un lisado celular para detectar la actividad de la luciferasa Cipro Dina o CL en el cultivo. Placa de réplica del medio.

20 microlitros de un medio de cultivo a una placa de 96 pocillos blanca opaca. Mediante el multicanal, añada 20 microlitros de tampón de ensayo CL a cada pocillo. A continuación, añada 10 microlitros de Cipro Dina Lucifer y sustrato a cada pocillo y detecte la actividad CL utilizando un luminómetro para detectar las actividades de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de vainilla; primero deben obtenerse lisados celulares.

Retire el medio de cultivo de las células dándole la vuelta a cada placa e introduciendo el medio en un fregadero. Retire el medio restante golpeando suavemente la placa boca abajo sobre toallas de papel. Añada 30 microlitros de tampón de lisis pasiva 1x a cada pocillo de células.

Coloque las placas sobre un agitador rotatorio ajustado a velocidad media durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, añada 20 microlitros del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo de células y mida inmediatamente la actividad de luciferasa de luciérnaga utilizando el luminómetro. A continuación, añada el reactivo stop and glow para inhibir la actividad de luciferasa de luciérnaga y luego mida la actividad de luciferasa.

Antes de la multiplexación, se evaluó individualmente la robustez de las tres plataformas de cribado diferentes. Se transfectaron líneas celulares de cáncer colorrectal indicadas con los ocho constructos reporteros que codifican XTCF PP 53 ta Luke o ALK uno Luciferasa de Luciérnaga junto con pools de siARN que dirigen WINT beta-Catenina P 53 o KAS, respectivamente. Se indican los genotipos relevantes para la vía en cada línea celular.

La fortaleza de cada plataforma de cribado se evaluó mediante la reproducibilidad de estos efectos inducidos en la vía de transducción de señales relevante. Como se muestra en estos resultados representativos, la betaina y los ARNip no tienen ningún efecto sobre la actividad del reportero XTCF ocho en células RKO. En contraste con las células DLD1 y HCT116, que son deficientes respectivamente en la vía APC, proteína supresora y expresan una forma activada de β-catenina.

Posteriormente, se demostró que estos reporteros podían utilizarse conjuntamente para mediciones simultáneas de la actividad génica de las vías de transducción de señales de beta-catenina wind, P53 y KRAS, empleando los grupos de ARNi indicados en estas gráficas. Las actividades relativas de luciferasa se muestran en el eje Y, y los ARNi dirigidos al gen de interés indicado se muestran en el eje X. Por ejemplo, un grupo de ARNi dirigido contra beta-catenina reduce la actividad de la vía de señalización beta-catenina wind, sin afectar significativamente las vías P53 y KRAS.

Al intentar desarrollar un sistema de repórter múltiple, es importante optimizar la línea celular de interés para la región de transfección y la señal del repórter deseada.