Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

El objetivo general del siguiente protocolo es permitir la interrogación a escala genómica de la función génica mediante el monitoreo simultáneo de múltiples lecturas celulares. En esta demostración, se utilizan reporteros basados en Firefly RAN y Cipro Dina Luciferase para monitorear la actividad de las vías P 53 WINT y KRAS, respectivamente. A estos tres reporteros se les transega irna dirigido a un gen de interés en las células HCT 16, una línea celular de cáncer colorrectal.

Posteriormente, se miden las actividades de luciferasa de luciérnaga y vainilla en los lisados celulares mientras que la actividad de la luciferasa Cipro DEA. Una enzima secretada se mide en el cultivo. Se obtienen resultados medios que muestran la reproducibilidad del sistema de ensayo, así como la capacidad de revelar acciones compartidas y únicas de genes dentro de estas tres vías relevantes para el cáncer.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los microrrayos o los sistemas multicolores, es que es una forma asequible, universal y rentable de observar las salidas celulares de transcripción. Este método puede ayudar a responder preguntas en la investigación del cáncer, como el desarrollo de estrategias terapéuticas molecularmente dirigidas. A pesar de que nuestro protocolo de transfectación transitoria se esfuerza por IL y un compromiso mínimo de tiempo inicial para la configuración de la pantalla, es probable que aumente la variabilidad de la señal de pozo a pocillo, lo que se puede contrarrestar observando las proporciones de informes en lugar de observar las fallas absolutas de los pocillos. Para comenzar este procedimiento, lave cinco placas de 10 centímetros cuadrados de 80 a 90% de HCT confluente en 16 celdas con PBS y luego recoja las celdas por tripsinización para cada placa.

Utilice un mililitro de solución de tripsina seguido de neutralización con 10 mililitros de DMEM que contengan 2% de FBS y 1% de penicilina. La estreptomicina transfiere las células suspendidas a un tubo cónico de 50 mililitros y se centrifuga a aproximadamente 130 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 10 mililitros de medio.

Cuente el número de células con un contador de células y luego haga una solución de células con 10 a la quinta célula por mililitro. Guarde 150 mililitros de suspensión celular para el siguiente paso usando una placa dispensadora de líquido automatizada de múltiples gotas. 100 microlitros o 10 a la cuarta celda en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos.

En este caso, la suspensión de la celda debería ser suficiente para el recubrimiento 1296. Las placas de pocillos incuban las placas con células a 37 grados centígrados en una incubadora con 5% de dióxido de carbono mientras se prepara la mezcla de transfección. El ADN de construcción reportera de alta calidad utilizado aquí se aisló utilizando kits de preparación MIDI estándar y se diluyó hasta una concentración final de un miligramo por mililitro.

Para cada reportero, prepare 100 microlitros de solución madre combinada los siguientes 30 microlitros de P 53, FL, 30 microlitros de ocho X-T-C-F-R-L, 30 microlitros de alce, un G, cuatro seis microlitros de U-A-S-C-L y cuatro microlitros de H dos oh. Esto dará como resultado una mezcla de ADN con una proporción final de uno a uno a uno a 0,2 de los reporteros y una concentración final de ADN de 0,3 miligramos por mililitro. A continuación, prepare mezclas de transfección I-R-N-A-D-N-A suficientes para la transección 1296.

Las placas de pocillos diluyen 80 microlitros de la solución madre reportera en ocho mililitros de tampón EC del kit de efecto QIAGEN para obtener una solución de ADN con una concentración final de tres microgramos por placa de mililitro. 20 microlitros de la solución de ADN en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. El número de placas de 96 pocillos dependerá de la cantidad de piscinas de irna que se vayan a probar.

Por ejemplo, en este caso, necesitaremos 4 placas de 96 pocillos para evaluar. 384 grupos de sir a diferentes utilizando un manipulador de líquidos automatizado de bioma transfieren dos microlitros de cada cinco siRNA micromolares al pocillo correspondiente de la placa de PCR que contiene el stock de ADN diluido. A continuación, agregue un microlitro de solución potenciadora a cada pocillo de la placa de siRNA de ADN.

Deje que la reacción del potenciador ocurra a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada tres microlitros de reactivo de transfección efectuante a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos más. Para detener la formación de complejos de transfección, agregue 10 microlitros de DMEM que contengan 2% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina a cada pocillo de la placa de PCR.

Recupere las placas de 1296 pocillos que contienen HCT 16 células de la incubadora. Transfiera 10 microlitros de la mezcla de transfección a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga las células, ya que cada transfección se realizará por triplicado. La misma mezcla se aplicará a dos placas adicionales de 96 pocillos que contienen celdas.

Incubar las células con mezclas de transfección a 37 grados centígrados en un ambiente humidificado con 5% de dióxido de carbono durante 36 horas, 36 horas después de la transfección de las células. Las actividades de luciferasa están listas para ser medidas.

Como este estudio incorpora múltiples reporteros, uno secretado en el medio de cultivo y otros dos expresados en el citoplasma celular. Las mediciones se obtendrán tanto de un medio de cultivo como de un lisado celular para detectar la actividad de Cipro Dina luciferasa o CL en el cultivo. Placa de réplica mediana.

20 microlitros de un medio de cultivo a una placa blanca opaca de 96 pocillos. Usando la gota múltiple, agregue 20 microlitros de tampón de ensayo CL a cada pocillo. A continuación, agregue 10 microlitros de Cipro Dina Lucifer y sustrato a cada pocillo y detecte la actividad de CL utilizando un luminómetro para detectar las actividades de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga y luciferasa de vainilla, primero se deben realizar lisados celulares.

Retire el medio de cultivo de las celdas volteando cada placa boca abajo y arrojando el medio en un fregadero. Retire el medio restante golpeando suavemente el plato al revés sobre toallas de papel. Agregue 30 microlitros de un tampón de lisis pasiva a cada pocillo de células.

Coloque las placas en un balancín de plataforma ajustado a velocidad media durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, agregue 20 microlitros del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo de células y mida inmediatamente la actividad de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga con el luminómetro. A continuación, agregue un reactivo de parada y brillo para apagar la actividad de la luciferasa de luciérnaga y luego mida la actividad de la luciferasa.

Antes de la multiplexación, se evaluó individualmente la robustez de las tres plataformas de cribado diferentes. Las líneas celulares de cáncer colorrectal indicadas se transfectaron con las ocho construcciones reporteras que codifican XTCF PP 53 ta, Luke o ALK one, Firefly Luciferasa, junto con grupos de siRNAs dirigidos a WINT, beta-Catenina, P 53 o KAS, respectivamente. Se indican los genotipos relevantes para cada línea celular.

La resistencia de cada plataforma de cribado se evaluó mediante la reproducibilidad de estos efectos inducidos en la vía de transducción de señales relevante. Como se muestra en estos resultados representativos, la betaína y los siRNAs no tienen ningún efecto sobre la actividad de los ocho reporteros XTCF en las células RKO. A diferencia de las células DLD one y HCT one 16, que son respectivamente deficientes en la vía A PC, la proteína supresora y expresan una forma activada de bebetenina.

Posteriormente, se demostró que estos reporteros podían utilizarse conjuntamente para realizar mediciones simultáneas de la actividad génica de las vías de transducción de señales P 53 y KRAS de beta-catenina eólica utilizando los grupos de IRNA indicados en estos gráficos. Las actividades relativas de la luciferasa se muestran en el eje Y y los siRNAs dirigidos al gen de interés indicado se muestran en el eje X. Por ejemplo, un grupo de siRNA dirigido a la beta-catenina reduce la actividad de la vía de la beta-catenina del viento, mientras que no afecta significativamente a las vías P 53 y KRA S.

Al intentar desarrollar un sistema reportero múltiplex, es importante optimizar la línea celular de interés para la región de transfección y la intención de la señal reportera.