Name: El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende la técnica de doble inmunotinción en secciones de tejido de sistema nervioso central y ganglios linfáticos periféricos de rata. Este protocolo optimizado permite visualizar la localización proteica mediante microscopía óptica.

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Agradecemos a Hans Lassmann y Jan Bauer por su orientación y apoyo. También agradecemos a Katalin Benedek por su excelente asistencia técnica y a Caroline Westerlund por su evaluación crítica y lingüística.
Este estudio fue financiado por subvenciones de Biogen Idec, la Fundación Wenner-Gren, el Consejo Sueco de Investigación, la Asociación Sueca de Personas con Discapacidades Neurológicas, la Fundación Sueca del Cerebro, el 6º Marco de la UE EURATools (LSHG-CT-2005-019015) y Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Declaración de ética El presente estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Junta Nacional Sueca de Animales de Laboratorio y la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea (86/609 / CEE), por los permisos éticos N338 / 09, N15 / 10 y N65 / 10, los cuales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Estocolmo Norte. 1. Preparación del tejido <ol><li> Perfusión y de fijación <ol><li> Anestesiar al animal con isoflurano para realizar la perfusión transcardial a través del ventrículo izquierdo. Iniciar el enjuague de la vasculatura con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los componentes de la sangre, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (PFA). </li><li> Fijar los cerebros disecados, la médula espinal y el tejido LN periférica mediante la inmersión en PFA. Después de 24 horas a 4 ° C, transferir el tejido de PFA en PBS y se almacena a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. Como alternativa a PBS comercial, se disuelven 9 g de NaCl en 250 ml del S &amp;# 246; rensen tampón y añadir 750 ml de agua desionizada (DH 2 O); para preparar tampón 0,2 M Sörensen (pH 7,4) disolver 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1H 2 O y 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O en 2,5 L dH 2 O. </li></ol></li><li> La deshidratación y la incrustación <ol><li> Cortar el tejido en aproximadamente 5 mm partes gruesas mediante el uso de una hoja de afeitar. </li><li> Iniciar el proceso de endurecimiento del tejido (deshidratación) mediante el uso del procesador de infiltración a vacío Tissue-Tek VIP (procedimiento estándar basado en la inmersión en concentraciones ascendentes de etanol, seguido de xileno y finalmente parafina (Tabla 1). </li><li> Coloque el tejido en un molde y se vierte en la parafina líquida alrededor de la muestra para formar un &quot;bloque de parafina&quot;. El almacenamiento a largo plazo requiere la temperatura ambiente (TA). Sin embargo, antes de seccionar, es recomendable para enfriar los bloques, por ejemplo, durante la noche (o / n) a 4 ° C.</li></ol></li></ol> 2. Seccionamiento <ol><li> Coloque el bloque de parafina en un soporte fijo de la microtomo trineo, que puede moverse hacia atrás y hacia delante a través de la cuchilla. Ajuste el ángulo óptimo entre el bloque y el cuchillo microtomo (que depende de la geometría de cuchillo, sino también de la velocidad de corte y la técnica). </li><li> Cortar 3 - 5 de m de espesor secciones transversales del bloque de parafina. </li><li> Transferir la sección acaba de cortar en un recipiente de agua y montarlo posteriormente del agua sobre el portaobjetos de vidrio. </li><li> Presione la sección montada cuidadosamente con una toalla de papel para eliminar el agua residual y las burbujas de aire potenciales. Comercialmente pre-revestidas portaobjetos de vidrio adhesivas son recomendables. </li><li> Diapositivas montadas en seco por un par de horas en una estufa a 50 - 60 ° C. </li></ol> 3. desparafinación (Rehidratación y bloqueo de la peroxidasa endógena) <ol><li> Sumergir los portaobjetos en xileno 2x (sustituto de xileno, alternativamente,XEM-200), cada vez 15 a 20 &#39;. </li><li> Enjuague con etanol al 99%. </li><li> Para bloquear la actividad peroxidasa endógena, se incuban las secciones para 30 &#39;en solución de metanol que contiene 0,25% de peróxido de hidrógeno. </li><li> Continuar la rehidratación mediante el uso de etanol con el aumento de contenido de agua (99%, 70%, terminando en agua destilada. </li><li> Desde este punto hasta el montaje de la cubierta se desliza secciones tienen que mantenerse húmedo. </li></ol> 4. La recuperación del antígeno <ol><li> Utilice una vaporera para hervir los portaobjetos en una solución de recuperación de antígeno (en este caso EDTA pH 8,5 tampón) durante 60 &#39;(EDTA reserva de estabilización solución contiene 1,21 g de Tris y 0,37 g de EDTA se disuelve en 50 ml de H2O destilada, para preparar el trabajo solución diluida solución de 2,5 ml de EDTA de valores en 47,5 ml dH2O). </li><li> Enfriar los portaobjetos en la temperatura ambiente durante aprox. 1 hr y luego enjuague 3 - 5x con solución salina tamponada con Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste en 0,05 M Tris y 0,15 M NaCl; pH 7,5 ajustado wiTH HCl. Alternativamente, puede utilizar TBS comercial. </li></ol> 5. El bloqueo de los sitios de unión inespecífica <ol><li> Para evitar reacciones de fondo no específicas, se incuban las secciones sobre TA durante 30 &#39;en la solución de bloqueo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y tampón DAKO 90%. </li></ol> 6. Doble Immunolabeling: La incubación simultánea con los Abs primarias <ol><li> Diluir cantidad necesaria de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo y se incuba o / n a 4 ° C. Para la inmunotinción doble combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) con α-CD68 (Ed1; 1: 1.000) o α-Iba1 (AIF1, 1: 1.000) o α-CD8a (Ox-8; 1: 200) . </li><li> Enjuague los portaobjetos 3-5X con tampón TBS (alternativamente usar tampón 10x diluida DAKO). </li><li> Diluir cantidad necesaria de anticuerpos secundarios (biotinilado anti-cabra y AP-conjugado anti-ratón, ambos 1: 200) en la solución de bloqueo y se incuba 1 h en RT. </li><li> Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (use alternativamente 10x diluido tampón DAKO). </li><li> Incubar los portaobjetos con complejo de avidina-peroxidasa de rábano (HRP) diluidos en la solución de bloqueo durante 1 h en RT. </li><li> Enjuagar las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (utilizar alternativamente 10x tampón DAKO diluida). </li></ol> 7. Visualización <ol><li> La visualización del anticuerpo secundario marcado con AP enlazado <ol><li> Preparar tampón Tris-HCl 0,1 disolviendo 12,1 g de Tris en 1 L dH 2 O y ajustar el pH a mediante el uso de HCl. Usar el mismo tampón Tris-HCl para preparar una solución 1 M levamisol. Preparar solución recién 4% NaNO2 en dH2O </li><li> Para obtener 50 ml del sustrato Fast Blue (FB) (volumen requerido para una cubeta de vidrio estándar) disolver 6,25 mg Naftol-AS-MX-fosfato en 312,5 DMF l en el tubo de vidrio y se agita en 50 ml de pre-calentado (37 ° C) de tampón Tris-HCl. Para disolver 12,5 mg FB RR sal en l HCl 2 N 312,5 312,5 l de añadir previamente preparojo 4% de solución de NaNO 2 y se agita la mezcla en los mismos 50 ml de tampón Tris-HCl pre-calentado. Agitar suavemente hasta que el líquido amarillo se vuelve claro y por último añadir 77 l de solución 1 M levamisol previamente preparada. Filtrado obtenido mezcla y se vierte sobre portaobjetos colocados en la cubeta de vidrio. </li><li> Iniciar la incubación a 37 ° C y el control de procesos en desarrollo bajo el microscopio de luz aprox. cada 15 - 30 min. Si al girar difusa, reemplace la solución FB con la mezcla fresca. </li><li> Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS y la transferencia a continuación en tampón PBS. </li></ol></li><li> La visualización del anticuerpo secundario biotinilado unido <ol><li> Preparar DAB / H 2 O 2 solución de revelado diluyendo 1 ml de solución de DAB (DAB 25 mg por 1 ml de PBS) en 49 ml de PBS. Añadir 16,5 l de H 2 O 2 y filtrado antes de verter en secciones. </li><li> La conversión del cromógeno DAB en la frente precipitandon pigmento puede ser inmediata. Controlar el proceso de desarrollo bajo el microscopio de luz (incluso par de segundos de incubación más largo puede plantear un alto fondo y enmascarar la señal específica). </li><li> La intensidad del precipitado pigmento marrón puede ser, alternativamente, reforzada por la incubación en la solución que consiste en 2% de sulfato de cobre y 0,9% de NaCl para 5 &#39;. </li><li> Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con PBS y finalmente con H2O destilada Alternativamente, puede utilizar el agua del grifo. </li><li> Montar los portaobjetos con tapa se desliza directamente del agua mediante el uso de un medio de montaje acuoso GelTol. Evitar la creación de burbujas de aire. </li><li> Deje secar por completo del medio de montaje, por ejemplo, O / N a 4 ° C. Tienda secó diapositivas en RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % etanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % etanol </td><td> 60 y# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % etanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % etanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % etanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> xilol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> xilol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> Parafina </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Parafina </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Procesamiento de tejido por vacío Tissue-Tek VIP procesador de infiltración.

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<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Los procedimientos estándar de IHC menudo requieren ajustes específicos para obtener un resultado óptimo, lo que comúnmente implica una amplia experiencia, sino también de &quot;ensayo y error&quot; enfoque. Desde la preparación hasta la visualización del tejido diana, casi cada paso en el protocolo puede ser sometida a modificaciones diseñadas de forma individual con el fin de mejorar el resultado final. protocolo de tinción doble que aquí se presenta un ejemplo de proteínas a base de IHC focalización particular ajusta...

A pesar de la utilización de tecnologías avanzadas de alto rendimiento de los análisis realizados en el metiloma, transcriptoma o incluso de proteoma, inmunotinción sigue siendo el estándar de oro para la detección de proteínas directamente en la muestra de tejido, cultivo celular o un frotis celular. Al revelar el patrón de localización / distribución, inmunohistoquímica (IHC) puede evaluar proporciones relativas y las interrelaciones topográficas de las proteínas diana, e incluso indicar sus actividades biológicas. Por lo tanto, IHC se utiliza ampliamente para fines clínicos y de investigación, por ejemplo, para el diagnóstico, tratamiento, evaluaciones estudio de los mecanismos de la enfermedad, alteraciones funcionales y fenotípicas en modelos animales, etc. Que comprende esencialmente la histología, patología, bioquímica e inmunología, IHC ha avanzado significativamente desde 1941, cuando se utilizaron anticuerpos marcados con fluorescencia por primera vez para identificar antígenos de neumococo en el tejido infectado 1. Visualization de productos y componentes por IHC celulares se basa en la unión de anticuerpos (Abs) a su antígeno específico (Ag). Además de utilizar anticuerpos fluoróforo etiquetado, reacciones inmunes también se pueden visualizar mediante el uso de enzimas como la peroxidasa de 2,3 o fosfatasa alcalina 4. Además, los anticuerpos de oro coloidal-etiquetado 5 se utilizan para detectar la interacción específica antígeno-anticuerpo tanto por microscopía óptica y electrónica, mientras marcadores radiactivos se visualizaron por autorradiografía. La inmunorreacción Ag-Ab se puede detectar a través de métodos directos e indirectos. El método directo es esencialmente más rápido y más sencillo, ya que utiliza directamente etiquetada Abs primaria 6. Sin embargo, debido a la significativa falta de sensibilidad, los métodos indirectos se prefieren a los directos. Procedimientos de detección indirecta de dos pasos requieren no marcados Abs primaria, ya que el primero, y se marcaron Abs secundarios dirigidos contra el Abs primario, como la segunda capa 7.la amplificación de la señal se puede lograr mediante la participación adicional, terciaria Ab enzima acoplada (de tres pasos método indirecto) que se une al Ab secundario. métodos de detección indirectos utilizados están avidina-biotina y peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Alternativamente, fosfatasa alcalina fosfatasa antialkaline (APAAP) complejo se puede utilizar en lugar del método PAP. En particular, la fosfatasa alcalina (AP) métodos parecen ser aún más sensible que los métodos de inmunoperoxidasa 4. método del complejo avidina-biotina (ABC) utiliza biotina Ab secundario en combinación con la etiqueta complejo avidina-biotina (LAB), o el etiquetado de estreptavidina-biotina (LOSA). Sensibilidad de detección se puede aumentar más mediante la participación de avidina marcada con peroxidasa o fosfatasa alcalina 8. Otros métodos de detección utilizados son el etiquetado polimérico, tiramina y la amplificación círculo 9 inmuno-balanceo. En particular, los métodos de detección diferentes se pueden combinar para la detección múltiple Ag en el mismo tejidomuestra, el cual fue reportado por primera vez en 1978 4. inmunotinción doble simultánea que aquí se presenta se realizó en fijado en formol, ratas incluido en parafina cortes de tejido del SNC y LN utilizando peroxidasa unida y AP-conjugado con anticuerpos secundarios, respectivamente. Las señales se visualizaron utilizando 3,3&#39;-diaminobencidina cromógeno (DAB) y el Fast Blue (FB) APAAP compleja, respectivamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><reactivo>fuerte</fuerte></td></tr><tr><td>Isoflurano (Isofluran): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Irradiación ocular. Probablemente influye en la fertilidad y daña al bebé en el útero. Administrar solo en un ambiente anestésico adecuadamente equipado.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS), tableta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% en 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td> Peligro para la <td>salud. Corrosivo. Inflamable. Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>Etanol &#8805; 99.5%, absoluto (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Inflamable.</td></tr><tr><td>Xileno (Xilenos, grado histológico; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>534056 Inflamable. Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>Histo-Comp Cera de parafina</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio adhesivo</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de xilol XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) ratón anti-rata, anticuerpo primario</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) ratón anti-rata, anticuerpo primario</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) ratón anti-rata, anticuerpo primario</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-eotaxina C-19 (CCL11) cabra anti-rata, anticuerpo primario</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP)</td><td>Dakopatts, Dinamarca</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario biotinilado</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidina-complejo peroxidasa de rábano picante (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-MX fosfato (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>Sal RR Azul Rápida, Diazo Azoico Nº 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de levamisol (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobencidina tetraclorhidrato (Cromo DAB)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Altamente inflamable. Nocivo.</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Toxicidad aguda. Peligrosidad ambiental.</td></tr><tr><td>GelTol Medio de montaje acuoso</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno, 30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Toxicidad aguda. Sensibilización respiratoria. Carcinogenicidad. Inflamable.</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano, TRIS base (C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Irritación de la piel y los ojos.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Tris (TBS), tableta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di- Hidrogenofosfato de sodio dihidratado (Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado por citomación DAKO 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>Debe almacenarse a 2-8 & deg; C para inhibir el crecimiento bacteriano. Evite la formación de espuma.</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Inflamable. Toxicidad aguda.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, conc. (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo.</td></tr><tr><td>Solución volumétrica de ácido clorhídrico, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>Corrosivo, irritante, permeante. Sensibilizador pulmonar (en forma de neblina ácida). Nocivo.</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio, ReagentPlus, &#8805; 99.0% (NaNO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>Oxidante. Nocivo. Peligroso para el medio ambiente.</td></tr><tr><td>Sal disódica dihidratada de ácido etileninittrilotetraacético (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>Las exposiciones orales pueden causar efectos reproductivos y de desarrollo.</td></tr><tr><td colspan="4"> Equipo</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P Procesador de infiltración al vacío</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 Series Microtomo de trineo </td><td>base Instrumentos Hacker Vaporizador</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>alimentos para el hogar </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

La inmunohistoquímica (IHC) proporciona una visualización altamente específico, fiable y atractivo proteína. rendimiento correcta y la interpretación de un etiquetado multicolor basado en la IHC es un reto, especialmente cuando se utiliza para la evaluación de las interrelaciones entre las proteínas diana en el tejido con un alto contenido de grasa, tales como el sistema nervioso central (SNC). Nuestro protocolo representa un refinamiento de la técnica immunolabeling estándar especialmente ajustado para la detección de ambas proteínas estructurales y solubles en el CNS de rata y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) afectadas por la neuroinflamación. No obstante, con o sin modificaciones adicionales, nuestro protocolo probablemente podría ser utilizado para la detección de proteínas relacionadas con otros objetivos, incluso en otros órganos y especies que aquí se presenta.

immunostainings dobles (co-tinciones) se realizaron en fijado en formol e incluido en parafina de rata secciones del SNC y LN. 3-5 micras rodajas de tejido espesor fueron cortadas usando un microtomo trineo, montados posteriormente en portaobjetos de vidrio recubierto con adhesivo previamente y se trata como se ha descrito previamente 10,11,12. En resumen, después deparaffinizing, la rehidratación del tejido y la inactivación de la peroxidasa endógena, las secciones se sometie...

Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse a una proteína específica en el tejido de rata. Esto se logra primero aislando, fijando e incluyendo el tejido en parafina, seguido del corte del tejido y su montaje sobre portaobjetos. El segundo paso consiste en desparafinar e hidratar las secciones de tejido incluidas en parafina, y luego bloquear la peroxidasa endógena.A continuación, los epítopos se exponen mediante la recuperación de antígenos. Posteriormente, se realiza un bloqueo para reducir la unión inespecífica antes de introducir los anticuerpos. El paso final consiste en detectar el epítopo específico mediante inmunomarcado con anticuerpos primarios y secundarios, y desarrollar la señal proveniente del anticuerpo secundario marcado.Finalmente, la señal se visualiza mediante microscopía óptica para mostrar el patrón de localización de la proteína en las secciones de tejido. Aunque este método puede proporcionar información sobre los patrones de localización y expresión de proteínas en el sistema nervioso central de la rata y en los ganglios linfáticos periféricos, también puede aplicarse a otros órganos y especies. Para demostrar el procedimiento, será un técnico.Su nombre es Katalin Benedek, del centro de instalaciones básicas de microbiología, tumor y biología celular del Karolinska Institutet. Para comenzar la preparación del tejido, sumerja el cerebro, la médula espinal y el tejido de ganglios linfáticos periféricos disecados en paraformaldehído al cuatro por ciento y colóquelos a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Después de que los tejidos estén fijados, transfiera el tejido a P-B-S y guárdelo a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento.Para comenzar el procesamiento del tejido, utilice una cuchilla de afeitar para cortar el tejido en porciones de aproximadamente cinco milímetros. Luego, inicie el proceso de endurecimiento del tejido con un procesador de infiltración al vacío. El procedimiento estándar se basa en la inmersión en concentraciones crecientes de etanol, seguido de xilol y, finalmente, parafina.A continuación, coloque el tejido en un molde. Vierta la parafina líquida alrededor de la muestra para formar un bloque de parafina y almacénelo a temperatura ambiente. Antes de seccionar el tejido, enfríe el bloque de parafina durante la noche sobre la placa fría o en el refrigerador.Después de que el bloque de parafina se haya enfriado, coloque el bloque en el soporte fijo de un micrótomo de deslizamiento que pueda moverse hacia adelante y hacia atrás sobre una cuchilla. Luego, ajuste el bloque y la cuchilla del micrótomo al ángulo óptimo, que depende de la geometría de la cuchilla y de la velocidad y técnica de corte. Corte tres secciones transversales de cinco micrómetros de grosor del bloque de parafina.A continuación, transfiera las secciones cortadas a un recipiente con agua y monte las secciones desde el agua sobre un portaobjetos de vidrio adhesivo pre-recubierto comercial. Luego, presione cuidadosamente la sección montada contra una toalla de papel para eliminar el agua residual y posibles burbujas de aire. Seque los portaobjetos montados durante un par de horas en una estufa ajustada a 50-60 grados Celsius.Una vez que las láminas estén secas, sumérjalas dos veces en xilol durante 15 a 20 minutos cada vez. Luego, enjuague cada lámina con etanol al 99 por ciento. Para bloquear la actividad de peroxidasa endógena, incube los cortes durante 30 minutos en una solución de metanol que contenga peróxido de hidrógeno al 0,25 por ciento.Luego, continúe rehidratando las secciones de tejido lavando con soluciones de etanol que contengan un contenido creciente de agua. Realice el paso final de rehidratación en agua destilada. Asegúrese de mantener las secciones húmedas hasta que se coloquen las laminillas.Para recuperar el antígeno, caliente las laminillas con una vaporera doméstica y tampón EDTA a pH 8,5 durante 60 minutos. Luego, enfríe las laminillas a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Una vez frías las laminillas, enjuague cada una tres a cinco veces en solución salina tamponada con Tris, o TBS.A continuación, incubar las secciones de tejido a temperatura ambiente durante 30 minutos en una solución bloqueadora que contenga 10 por ciento de suero de ternera fetal y 90 por ciento de tampón de lavado para bloquear cualquier reacción de fondo no específica. Después de bloquear las secciones de tejido, diluir la cantidad necesaria de anticuerpos primarios en la solución bloqueadora e incubar las laminillas en esta solución de anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, enjuagar las laminillas de tres a cinco veces con tampón T-B-S.Luego, incubar las laminillas con anticuerpos secundarios diluidos en la solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, enjuagar nuevamente las laminillas de tres a cinco veces con tampón T-B-S. A continuación, incubar las laminillas con el complejo de avidina peroxidasa de rábano picante, diluido uno a 100 en la solución bloqueante, durante una hora a temperatura ambiente.Una vez completada la incubación de una hora, enjuague las laminillas tres a cinco veces con tampón T-B-S. Después de preparar la solución de azul rápido según se describe en el protocolo escrito, agite suavemente el recipiente y filtre la mezcla obtenida. Vierta la solución sobre las laminillas en la cubeta de vidrio.Inicie la incubación a 37 grados Celsius y observe el proceso de desarrollo bajo el microscopio óptico cada 15 a 30 minutos. Una vez finalizada la incubación, enjuague las laminillas de tres a cinco veces con tampón T-B-S y luego transfiéralas sucesivamente al tampón P-B-S. Para preparar la solución reveladora de peróxido de D-A-B, primero diluya un mililitro de una solución stock de D-A-B en 49 mililitros de P-B-S.Añada 16,5 microlitros de peróxido de hidrógeno y luego filtre la solución. Vierta la solución sobre los portaobjetos y asegúrese de controlar el proceso de revelado bajo el microscopio óptico para evitar un fondo elevado que pueda enmascarar la señal específica. A continuación, enjuague los portaobjetos de tres a cinco veces con P-B-S, seguido de un lavado final con agua destilada o agua del grifo.Monte los portaobjetos con cubreobjetos directamente desde el agua, utilizando un medio de montaje acuoso. Evite la formación de burbujas de aire entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Después de montar las secciones, incube los portaobjetos durante la noche a cuatro grados Celsius para permitir que el medio de montaje se seque completamente.Almacene los portaobjetos secos a temperatura ambiente. La tinción doble de secciones de tejido de ganglios linfáticos periféricos aisladas de ratas el día siete post-inmunización reveló que los linfocitos T positivos para CD8 no secretaron la quimiocina C-C-L 11. Alternativamente, se encontró que C-C-L 11 co-localizaba con E-D uno, un marcador para proteínas lisosomales en macrófagos activados.La tinción doble I-H-C de la médula espinal de una rata identificó la producción de C-C-L 11 en los pericarion de neuronas, dendritas y axones, pero no en macrófagos positivos para I-B-A 1 ni en células de microglía residentes en el cerebro. Además, se encontró que la mayoría de los macrófagos positivos para E-D 1 y las células de microglía residentes en el cerebro tampoco eran positivas para C-C-L 11. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un marcado inmunohistoquímico específico y confiable de la proteína directamente en secciones de tejido.

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Investigación

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Neurociencia

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica de fibras colinérgicas en el núcleo basal de la región de Meynert de secciones de cerebro de ratón. Las secciones se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios contra la colina acetiltransferasa, seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados. Se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios, seguidos del sustrato cromogénico. A continuación, las secciones se deshidratan y se montan antes de...

Tinción inmunohistoquímica de fibras nerviosas en el núcleo basal de Meyner del cerebro de ratón

Fuente: Evilsizor, M. N., et. al., Primer para inmunohistoquímica en tejido cerebral de rata crioseccionado: ejemplo de tinción para microglía y neuronas. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra un procedimiento de tinción inmunohistoquímica paso a paso en tejido cerebral de rata crioseccionado para visualizar la disposición espacial de la microglía y las neuronas.

Tinción inmunohistoquímica de criosecciones de tejido coronal de rata para microglía y neuronas

Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Aquí, describimos un método simple y barato que permite la cuantificación de células tumorales adhesivas a criosecciones de ganglios linfáticos (LN). Las células tumorales adsemiantes con LN se identifican fácilmente mediante microscopía de luz y se confirman mediante un método basado en fluorescencia, lo que proporciona un índice de adhesión que revela la afinidad de unión celular tumoral al parénquima LN.

Cuantificación de la adhesión de células tumorales en criosecciones de nodos linfáticos

Los ganglios pélvicos principales contienen neuronas parasimpáticas y simpáticas que inervan órganos pélvicos. Aquí describimos un método de disección y proporcionamos esquemas para la identificación de estos ganglios y sus nervios asociados. Estos métodos se pueden aplicar a la manipulación experimental de estos ganglios in vivo o eliminación post-mortem para su estudio posterior.

Disección de Ganglia Autonómica Pélvica y Nervios Asociados en Ratas Masculinas y Femeninas

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Se presenta un método de perfusión conveniente alimentado por gravedad para el análisis histológico del sistema nervioso central del ratón. La detección inmunofluorescente de α-sinucleína fosforilada se demuestra en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson. Este trabajo también describe exhaustivamente los pasos de perfusión transcárdica, disección, congelación / incrustación de tejidos y seccionamiento congelado.

Un método de perfusión transcárdica alimentado por gravedad para el análisis histológico del sistema nervioso central del ratón

Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

Aprende la técnica de doble inmunotinción en secciones de tejido de sistema nervioso central y ganglios linfáticos periféricos de rata. Este protocolo optimizado permite visualizar la localización proteica mediante microscopía óptica.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

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