El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

El objetivo general de este procedimiento es dirigirse a una proteína específica en el tejido de la rata. Esto se logra primero aislando, fijando e incorporando el tejido en parafina, seguido de la sección del tejido y montándolo en portaobjetos. El segundo paso es desparafinar y rehidratar las secciones de tejido incluidas en parafina, y luego bloquear la peroxidasa endógena.

A continuación, los epítopos se descubren mediante la recuperación de antígenos. Posteriormente, se realiza un bloqueo para reducir la unión inespecífica antes de introducir los anticuerpos. El paso final es detectar el epítopo específico mediante inmunomarcaje con anticuerpos primarios y secundarios, y desarrollar la señal a partir del anticuerpo secundario marcado.

En última instancia, la señal se visualiza mediante microscopía óptica para mostrar el patrón de localización de proteínas en las secciones de tejido. Aunque este método puede proporcionar información sobre los patrones de localización y expresión de proteínas en el sistema nervioso central de la rata y en los ganglios linfáticos periféricos, también se puede aplicar a otros órganos y especies. Para la demostración del procedimiento estará un técnico.

Su nombre es Katalin Benedek y trabaja en el centro de microbiología, tumores y biología celular del Instituto Karolinska. Para comenzar la preparación del tejido, sumerja el tejido disecado del cerebro, la médula espinal y los ganglios linfáticos periféricos en un cuatro por ciento de paraformaldehído y colóquelo a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Una vez que se fijan los tejidos, transfiera el tejido a P-B-S y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento.

Para comenzar a procesar el tejido, use una hoja de afeitar para cortar el tejido en porciones de aproximadamente cinco milímetros. A continuación, inicie el proceso de endurecimiento de los tejidos con un procesador de infiltración al vacío. El procedimiento estándar se basa en la inmersión en concentraciones ascendentes de etanol, seguido de xilol y, finalmente, parafina.

A continuación, coloca el pañuelo en un molde. Vierta la parafina líquida alrededor de la muestra para formar un bloque de parafina y guárdelo a temperatura ambiente. Antes de cortar el tejido, enfríe el bloque de parafina durante la noche en la placa fría o en el refrigerador.

Después de que el bloque de parafina se haya enfriado, colóquelo en el soporte fijo de un micrótomo de trineo que pueda moverse hacia atrás y hacia adelante a través de un cuchillo. A continuación, ajuste el bloque y la cuchilla del micrótomo al ángulo óptimo, que depende de la geometría de la cuchilla y de la velocidad y la técnica de corte. Corte tres secciones transversales de cinco micras de grosor del bloque de parafina.

Luego, transfiera las secciones cortadas a un recipiente de agua y monte las secciones del agua en un portaobjetos de vidrio adhesivo prerrevestido comercial. A continuación, presione la sección montada con cuidado contra una toalla de papel para eliminar el agua residual y las posibles burbujas de aire. Seque las correderas montadas durante un par de horas en una estufa a 50 a 60 grados centígrados.

Una vez que los portaobjetos estén secos, sumérjalos dos veces en xilol durante 15 a 20 minutos cada uno. Luego, enjuague cada portaobjetos con etanol al 99 por ciento. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, incube las secciones durante 30 minutos en una solución de metanol que contenga peróxido de hidrógeno al 0,25 por ciento.

Luego, continúe rehidratando las secciones de tejido enjuagando con soluciones de etanol que contengan un contenido de agua creciente. Realice el paso final de rehidratación en agua destilada. Asegúrese de mantener las secciones húmedas hasta que se monten los resbalones de la cubierta.

Para recuperar el antígeno, caliente los portaobjetos con una vaporera doméstica y un tampón EDTA a pH 8,5 durante 60 minutos. Luego, enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Una vez que los portaobjetos estén fríos, enjuague cada portaobjetos de tres a cinco veces con solución salina tamponada con Tris, o T-B-S.

A continuación, incube las secciones de tejido a temperatura ambiente durante 30 minutos en una solución de bloqueo que contenga un 10 por ciento de suero fetal de ternera y un 90 por ciento de tampón de lavado para bloquear cualquier reacción de fondo no específica. Una vez que se hayan bloqueado las secciones de tejido, diluya la cantidad requerida de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo e incube los portaobjetos en esta solución de anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos de tres a cinco veces con tampón T-B-S.

A continuación, incubar los portaobjetos con anticuerpos secundarios diluidos en la solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Después, vuelva a enjuagar los portaobjetos de tres a cinco veces con tampón T-B-S. A continuación, incubar los portaobjetos con el complejo de peroxidasa de rábano picante avidina, diluido de uno a 100 en la solución de bloqueo, durante una hora a temperatura ambiente.

Una vez que se complete la incubación de una hora, enjuague los portaobjetos de tres a cinco veces con tampón T-B-S. Después de preparar la solución azul rápida como se describe en el protocolo de texto, agite ligeramente el plato y filtre la mezcla obtenida. Vierta la solución en los portaobjetos de la cubeta de vidrio.

Comience la incubación a 37 grados centígrados y observe el proceso de desarrollo bajo el microscopio óptico cada 15 a 30 minutos. Una vez completada la incubación, enjuague los portaobjetos de tres a cinco veces con tampón T-B-S y, posteriormente, transfiera los portaobjetos al tampón P-B-S. Para hacer la solución de desarrollo de peróxido de hidrógeno D-A-B, primero diluya un mililitro de una solución madre D-A-B en 49 mililitros de P-B-S.

Agregue 16,5 microlitros de peróxido de hidrógeno y luego filtre la solución. Vierta la solución en los portaobjetos y asegúrese de controlar el proceso de revelado bajo el microscopio óptico para evitar un fondo alto que pueda enmascarar la señal específica. Luego, enjuague los portaobjetos de tres a cinco veces con P-B-S, seguido de un lavado final con agua destilada o agua del grifo.

Monte las guías con cubreobjetos directamente del agua, utilizando un medio de montaje acuoso. Evite crear burbujas de aire entre el cubreobjetos y la corredera. Después de montar las secciones, incube las guías durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir que el medio de montaje se seque por completo.

Guarde los portaobjetos secos a temperatura ambiente. La doble tinción de secciones de tejido de ganglios linfáticos periféricos aisladas de ratas en el séptimo día después de la inmunización reveló que los linfocitos T CD8 positivos no secretaban la quimiocina C-C-L 11. Alternativamente, se encontró que C-C-L 11 se colocaliza con E-D one, un marcador de proteína lisosomal en macrófagos activados.

La tinción doble de I-H-C de la médula espinal de una rata identificó la producción de C-C-L once en el pericario neuronal, las dendritas y los axones, pero no en los macrófagos I-B-A uno positivos y las células de microglía residentes en el cerebro. Además, también se encontró que la mayoría de los macrófagos E-D uno positivos y las células de microglía residentes en el cerebro no eran C-C-L 11 positivos. Después de haber visto este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una orientación inmunohistoquímica específica y confiable de la proteína directamente en secciones de tejido.