Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método simple y reproducible para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal o EMT in vitro. Esto se logra colocando primero la siembra del tipo de célula epitelial de interés en presencia del suplemento de medios inductores de EMT. El segundo paso del procedimiento es reemplazar el medio de cultivo con un medio de cultivo fresco que contenga el suplemento de medios inductores de EMT tres días después de la siembra inicial.

El paso final es recolectar las células cinco días después de la siembra inicial para la caracterización posterior, como la inmunotinción. En última instancia, los resultados pueden mostrar que las células obtienen características mesenquimales a través de microscopía óptica, inmunocitoquímica, matriz de análisis de sangre occidental u otro procedimiento de análisis de elección. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la estimulación con TGF beta o la modificación genética, son que este método es rápido y sencillo, a diferencia de la modificación genética, y permite la inducción de EMT en una variedad de tipos de células, algunas de las cuales pueden no responder únicamente a la estimulación de TGF beta.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden a la terapia y al diagnóstico de las metástasis del cáncer. Esta técnica permite a los investigadores la capacidad de desarrollar firmas de expresión comunes de células metastásicas que podrían usarse en el diagnóstico. También proporciona células que se utilizan para la detección de fármacos.

Comience calentando los medios de cultivo de las células de interés a 37 grados centígrados en un baño de agua. A continuación, recoja las células utilizando una solución de disociación como con triple E express. A continuación, suspenda las células en medios de cultivo precalentados en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuga la suspensión celular a 400 Gs durante cinco minutos.

Retire con cuidado el sobrenadante vertiéndolo en un contenedor de residuos y suspenda el pellet de la célula en medios de cultivo precalentados. Ahora cuente las células viables, diluya una muestra de la suspensión celular en una solución azul de Triam al 0,4%. Coloque 10 microlitros de la muestra diluida en un hemo, citómetro y cuente las células viables.

Células viables. No se vuelva azul después de calcular la densidad de celdas en su placa de solución. De nueve a 10.000 células por centímetro cuadrado en un medio de cultivo precalentado que contenía un suplemento de medio inductor de XEMT, se utilizaron placas tratadas con cultivo de tejidos o matraces de cultivo.

Las células se siembran a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y controlan su morfología diariamente utilizando un microscopio de luz invertida. Tres días después, sustituya el medio por un nuevo medio de cultivo precalentado que contenga un suplemento de medio inductor de XEMT. Cinco días después de la siembra, las células están listas para el análisis.

Visualice la morfología de las células bajo una luz invertida: las células del microscopio ahora se pueden fijar o recolectar para estudios posteriores. Prepare cubreobjetos estériles de 12 milímetros para una placa de 24 pocillos colocando cubreobjetos en una placa de Petri que contenga etanol al 95%. Retire suavemente los cubreobjetos del etanol con unas pinzas curvas.

Las llamas esterilizan cada cubreobjetos y los transfieren a un pocillo de una placa de 24 pocillos que manipulan los cubreobjetos requieren cuidado y práctica. A continuación, a 0,5 mililitros de medio de cultivo precalentado que contiene un medio inductor XEMT. Suplemento a las celdas y placa 16.000 células por pocillo.

Ahora crezca y alimente las células como se describió anteriormente. Cinco días después de enchapar las células, retire el medio y fíjelas con 300 microlitros por pocillo de 4%Paraform aldehído en un XPBS permita que la fijación continúe durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el fijador y enjuague las células dos veces con 500 microlitros de un XPBS por pocillo.

A continuación, incube las celdas fijas en 400 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Después de aplicar el bloque, prepare el anticuerpo primario a la concentración recomendada por el fabricante en 400 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo. A continuación, retire la solución de bloqueo de los pocillos y añada la mezcla de anticuerpos a las células.

Incubar las células durante tres horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Y si el anticuerpo primario está directamente conjugado con un fluorocromo, incubarlos en la oscuridad. A continuación, retire el anticuerpo primario y lave los pocillos tres veces con 500 microlitros por pocillo de un XPBS que contenga 0,1%BSA, permita que cada lavado dure cinco minutos y, si es necesario, proteja las células de la luz.

Ahora, si es necesario, incube las células en un anticuerpo secundario a la concentración recomendada por el fabricante. Diluir el anticuerpo en 400 microlitros por pocillo de un XPBS que contenga 1%BSA. Permita una incubación de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz después de una hora.

Lave las células tres veces, tal como se hizo para eliminar el anticuerpo primario después de los lavados. Si lo desea, aplique una tinción de contador de DPI a las celdas. Por último, enjuague las celdas con agua desionizada y monte los deslizadores de la cubierta boca abajo en portaobjetos utilizando medios de montaje.

Nuevamente, tenga cuidado al manipular los cubreobjetos. Las condiciones de cultivo inductoras de EMT proporcionan un método robusto para la inducción de EMT en una variedad de tipos de células. Esto se probó en cuatro líneas celulares humanas diferentes.

Las células que se trataron con el suplemento de medios inductores de EMT cambiaron de una morfología epitelial clásica a una morfología mesenquimal en forma de huso. La doble tinción para la expresión de e-cadherina y fibronectina demostró la regulación a la baja del marcador epitelial e cadherina en rojo y la regulación al alza del marcador mesenquimal fibronectina en las muestras de CF 10 A no inducidas en verde. Estos conglomerados eran E que en este documento se mostraban en positivo, en rojo.

Los conglomerados desaparecieron tras el tratamiento con el suplemento de medios inductor de EMT. Esto coincidió con un aumento en la expresión de fibronectina en verde. T 98.

Se encontró que G tenía un nivel basal extremadamente bajo de terrina antes de la inducción de EMT, lo que impidió su análisis. Con este marcador, sin embargo, se encontró que los niveles de fibronectina aumentaban significativamente con la inducción de EMT en estas células. Los niveles de expresión de e adherente y fibronectina se confirmaron aún más a través de la transferencia occidental de lisados de células totales.

A pesar de que el western blot no muestra una reducción significativa de los niveles totales de la proteína herrina EAD en las células HT 29, hubo una reducción en la expresión superficial de terrina observada por Inmunoquímica para evaluar más a fondo el estado de EMT. Se analizaron marcadores mesenquimales característicos de EMT: el mentón en verde y el caracol en rojo se analizaron antes y después de la inducción de EMT, de acuerdo con los resultados anteriores. El Eki en gris se reguló a la baja en todas las líneas celulares examinadas, lo que indica que se indujo EMT. Además, hubo una regulación positiva de caracol en rojo y mentón en verde en 5 49 células T 98 G y MCF 10 A, se informó que las células de cáncer de mama humano siete y las células de carcinoma de páncreas humano PanIN no ingresan a EMT solo por la señalización beta de TGF.

Estos informes se confirmaron con TGF beta uno recombinante solo. A la concentración dentro del suplemento de medios inductores de EMT, las células conservaron su morfología epitelial y los niveles coherentes de E en superficie fueron similares a los de las células de control. Por el contrario, las células estimuladas con el suplemento de medios inductores EMT mostraron una disminución drástica en sus niveles de cadherina E superficial.

Estas células también obtuvieron una morfología más mesenquimatosa. Otra característica distintiva de las células mesenquimales es su capacidad para migrar e invadir. Este se analizó mediante el ensayo de invasión de células BME de 96 pocillos.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se observaron aumentos significativos en la migración celular tanto con una celda 5 49 como con una pan. Después de la inducción de EMT, se realizó el mismo ensayo con un filtro recubierto de extracto de membrana basal para probar la invasión. Las células inducidas por EMT mostraron un aumento significativo en las capacidades de invasión en comparación con las células no tratadas.

La inducción robusta de EMT es útil para el análisis de los cambios en la expresión génica y la señalización que tienen lugar en estas células. Se utilizó una matriz comercial basada en anticuerpos que utilizó lisados de MCF siete y 5 49 células para analizar los niveles de miembros de la familia de MA quinasas fosforilados. Ambos tipos de células mostraron un aumento de la fosforilación de kreb irk one e irk two en las células inducidas por EMT en comparación con los controles.

A 5 49 células también mostraron un aumento en la fosforilación de GSK tres beta. Las células Mc siete mostraron un aumento de la fosforilación de P 70 S six K, además de un aumento de la fosforilación de kreb o uno y DIRK dos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que puede haber cierta variabilidad en los resultados de diferentes tipos de células, no de todas las células.

Utilizamos las mismas vías posteriores para la inducción de EMT, lo que conduce a diferencias en la expresión de marcadores entre los tipos de células. Además, muchos marcadores de EMT no muestran estados estrictos de encendido y apagado y pueden tener niveles basales en las células epiteliales. Dichos marcadores pueden mostrar un aumento del intercambio de localización en la transición mesenquimal siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como el cribado de fármacos, pueden utilizarse para responder a preguntas adicionales, como qué compuestos son capaces de modular la transición epitelial a mesenquimatosa. Estos compuestos podrían ser muy útiles en el tratamiento del cáncer y la fibrosis.