Name: Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprende a inducir la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en cultivos celulares mediante un medio inductor específico. Este método reproducible facilita el estudio de la metástasis y el cribado de fármacos.

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Los autores desean agradecer a Julia Hatler y Martin Ramsden (R &amp; D Systems) útil para el debate y la revisión del manuscrito.

1. La inducción de EMT <ol><li> Medios de cultivo caliente a 37 ° C en un baño de agua. El medio de cultivo utilizado es el mismo que los medios utilizados para el cultivo estándar de las células de interés. Por ejemplo, la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se cultiva en F12 de Kaighn enriquecido con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM. </li><li> Células Cosecha de interés usando una solución de disociación (por ejemplo TrypLE Express). </li><li> Suspender las células en medios de cultivo pre-calentado en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 400 xg durante 5 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante mediante el vertido en un contenedor de residuos. </li><li> Suspender el sedimento de células en medios de cultivo pre-calentado. </li><li> Contar las células viables usando azul de tripano. Extraiga una muestra de la suspensión de células y se diluye en el 0,4% de solución de azul tripán. Ponga 10 l de la muestra diluida en un hemocitómetro y contar las células viables (células que no vuelven azules). Utilizar los recuentos de células para determinar la celda density en su solución. </li><li> Placa sobre células de cultivo de tejidos tratados placas o frascos a 0,9-1,0 x 10 4 células por cm 2. Por ejemplo, 0,5 x 10 6 células en placas en una placa de 100 mm en un medio de cultivo que contiene Suplemento 1X EMT medio inductor (6 ml de medio por placa de 100 mm). </li><li> Cultura células chapada en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 °. Monitorear la morfología celular diaria. </li><li> Tres días después de la siembra, retire y vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de la cultura pre-calentado fresco que contiene Suplemento 1X EMT Inducir Media. Continuar a la cultura en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 °. </li><li> Cinco días después de la siembra, las células están listas para el análisis. La morfología celular se visualiza mediante microscopía de luz invertida. </li></ol> 2. Análisis de la expresión de la proteína por inmunocitoquímica <ol><li> Preparar cubreobjetos estériles 12 mm para una placa de 24 pocillos mediante la colocación de cubreobjetos en una placa de Petri que contiene etanol al 95%. Retire suavemente cubreobjetos de etanol nosotrosing una aguja y pinzas curvas y esterilizar llama. Coloque el cubreobjetos estéril en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Repita con el resto cubreobjetos. </li><li> Preparar la suspensión de células como se describe en la sección 1,1 - 1,7. </li><li> Placa 1.6 x 10 4 células / pocillo en 0,5 ml de medios de cultivo pre-calentado que contiene Suplemento 1X EMT Inducir Media. </li><li> Crecer y alimentar a las células como se describe en las secciones 1.9 a 1.11. </li><li> Cinco días después de la siembra, retirar el medio y fijar las células con 300 l / pocillo de 4% de paraformaldehído en 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Quite el fijador y enjuagar las células 2 veces con 1X PBS, 500 l / pocillo. </li><li> Se incuban las células en 400 l / pocillo de tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA), 10% de suero normal de burro, y 0,3% de Triton X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Incubar en anticuerpo primario a los fabricantes de concentración recomendada en 400 l / pocillo de tampón de bloqueo durante 3 h a temperatur habitaciónE o durante la noche a 4 ° C. Cuando se utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente a un fluorocromo, incubar las muestras en la oscuridad. </li><li> Lavar las células tres veces en 500 l / pocillo de 1X PBS que contenía 0,1% de BSA durante 5 minutos cada lavado. Cuando se utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente a un fluorocromo, vaya directamente al paso 2.12. </li><li> Se incuban las células en anticuerpo secundario a la concentración recomendada por el fabricante en 400 l / pocillo de 1X PBS que contenía 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavar las células tres veces en 500 l / pocillo de 1X PBS que contenía 0,1% de BSA durante 5 minutos cada lavado. </li><li> Si se desea, los núcleos con solución DAPI. </li><li> Enjuague las células en agua desionizada y se montan los cubreobjetos boca abajo sobre una diapositiva utilizando medio de montaje. </li></ol>

<ol><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
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<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

R &amp; D Systems, Inc. es una empresa pública con fines de lucro. Producción y acceso gratuito a este artículo es patrocinado por R &amp; D Systems, Inc.

Los métodos anteriores para la inducción de EMT han utilizado generalmente la estimulación de TGF-β o modificación genética. Aunque se ha demostrado que solo el TGF-β para inducir EMT en algunos tipos de células, ahora se ha demostrado que el TGF-β es necesario para EMT, pero no es suficiente en todos los tipos de células 6,14. Uso de modificación genética para la inducción de EMT es mucho tiempo y mano de obra intensiva. El método descrito aquí usa una combinación de factores que incluyen, E-cadherina anti-humano, sFRP-1 anti-humano, DKK-1 anti-humano, Wnt-5a humana recombinante, y TGF-β1 humano recombinante para inducir de forma fiable de EMT. Esta combinación de factores ha sido diseñado para bloquear la adhesión basada E-cadherina, un paso crítico para la EMT de inducción 4, y mejorar la señalización de Wnt mediante la adición de la proteína Wnt-5 bis, así como el uso de anticuerpos que bloquean a los inhibidores de Wnt, sFRP-1 y DKK -1. Wnt y la señalización de TGF-β se ha demostrado que actuar en un bucle autocrino para inducir y mantener la estadística de células mesenquimalese 6. Este método de inducción evita la manipulación genética y es más eficaz que el uso de TGF-β solo. Es importante destacar que somos capaces de observar la inducción de la EMT en tipos de células, incluidas las células MCF7 y PANC-1, que han sido previamente demostrado no responder exclusivamente a la estimulación del TGF-β (Figura 5) 14. Las células tratadas con el espectáculo Suplemento EMT Inducir Medios morfología fusiforme menos compacto y una mayor (Figura 1). Además, hay una disminución en la superficie de la E-cadherina expresión concurrente con un aumento en la expresión de fibronectina, que son características de la EMT (Figuras 2 y 3). Marcadores adicionales mesenquimales tales como vimentina y caracol también están regulados por incremento en las células inducidas EMT como comparación con los controles no inducidas (Figura 4). El aumento de las capacidades de migración y la invasión son las principales características funcionales de las células mesenquimales. En in vitro </em&gt; Ensayos de migración y la invasión, las células tratadas con el Suplemento EMT Inducir Medios demostraron un aumento significativo de la capacidad de migrar e invadir (Figura 6). Este método simple para la inducción de EMT es útil para el estudio de la señalización de EMT como se demuestra usando los datos de expresión matriz de anticuerpos mostrados en la Figura 7. Diferentes tipos de células se pueden comparar de pre-y post-inducción de EMT para obtener firmas de expresión comunes asociados con la EMT, tales como el aumento de CREB fosforilado y ERK1 / 2 visto en tanto MCF7 y células inducida EMT-A549. S133 fosforilación de CREB estimula la unión de ADN y se ha demostrado que actúa aguas abajo de TGF-β1 inducida EMT-15. ERK1 / 2 fosforilación también se ha demostrado que actúa aguas abajo de TGF-β1 inducida EMT-16. Las diferencias en las vías de señalización entre los tipos de células también pueden ser aclarados como se ha visto con el aumento de la fosforilación de GSK-3β en las células A549 frente a p70S6K fosforilación en células MCF7. La fosforilación de GSK-3β en la serina 9 que disminuye la función, y GSK-3β se ha demostrado que inhiben el factor de transcripción pro-EMT, caracol 17. En contraste, p70S6K induce la actividad de caracol y su fosforilación está asociada con la activación de esta proteína 18. En general, la inducción sencillo y fiable de la EMT, particularmente en las células mostrados anteriormente no responder únicamente a TGF-β, es útil para la comprensión de la biología de la EMT, la identificación de firmas de expresión comunes para su uso como marcadores de pronóstico, y el desarrollo y la evaluación de nuevas terapias para el cáncer y enfermedad fibrótica.

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) es el proceso por el cual una célula epitelial polarizada se somete a una variedad de cambios resultantes en una, de células mesenquimales similar a fibroblastos muy móviles. Este proceso se produce, en parte, a través de los cambios de expresión de genes y la degradación de uniones adherentes, lo que resulta en una mayor capacidad para migrar e invadir. Fisiológicamente, la EMT desempeña un papel importante durante el desarrollo embrionario y la curación de heridas. La pérdida de un control adecuado de la EMT puede conducir a la fibrosis y la metástasis de carcinomas de 1,2. La reducción de la E-cadherina en la superficie de las células epiteliales es un paso crítico en la progresión de una célula a través de EMT 3,4. E-cadherina es una proteína transmembrana de paso único que interactúa directamente con las proteínas cadherina en células adyacentes. Además de su papel en la adhesión celular, E-cadherina influencias de señalización celular a través de interacciones entre la cola citoplasmática de un E-cadherinada variedad de proteínas reguladoras, en particular β-catenina. β-catenina desempeña un papel en la estabilización de las uniones adherentes. Durante la señalización canónica de Wnt, β-catenina se libera de E-cadherina y transloca al núcleo donde actúa como un factor de transcripción aguas abajo en la vía de Wnt 3,4,5. En el núcleo, β-catenina se ha demostrado que aumenta la transcripción de varios factores relacionados con el EMT-incluyendo Twist, Slug, fibronectina, y una variedad de metaloproteasas de la matriz 3,6. Además de Wnt, la señalización de TGF-β se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la inducción de EMT tanto durante el desarrollo normal y en estados de enfermedad 7,8,9. TGF-β está implicado en la EMT que se produce durante la formación del paladar y en el corazón en desarrollo 10. También se ha implicado en la fibrosis y en la progresión del cáncer a la metástasis 7. El procedimiento descrito aquí PRovides inducción consistente de EMT en una variedad de tipos de células, sin la necesidad de la manipulación genética. Este procedimiento utiliza un cóctel de E-cadherina, DKK-1 anticuerpos bloqueantes y Wnt-5a y proteínas recombinantes TGF-β1 sFRP-1, y. Este cóctel está diseñado para bloquear E-cadherina basado en la adhesión al tiempo que mejora Wnt y la señalización de TGF-β. La capacidad para robusta inducción de EMT es crítica para la comprensión de la biología de este proceso y cómo manipular con fines terapéuticos. Marcadores comunes actuales de EMT, E-cadherina (downregulated en EMT) y vimentina (upregulated en EMT), se pueden encontrar co-expresada en cánceres y por lo tanto no proporcionan los mejores marcadores de diagnóstico de potenciales células metastásicas 12. Es importante destacar que el análisis de una variedad de tipos de células que han sido objeto de EMT es útil para desarrollar comunes firmas de expresión de genes que se pueden utilizar con fines de diagnóstico en el cáncer y la fibrosis 11. Además, estudios recientes han demostrado que EMT puede desempeñar un papel en la formación de las células madre de cáncer, lo que sugiere que las células que han sido objeto de EMT pueden ser útiles para el cribado de fármacos para identificar compuestos que pueden apuntar estas células 13.

<table><tbody><tr><td>Células epiteliales de interés</td><td></td><td></td><td>Hemos probado: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 y PANC1</td></tr><tr><td>EMT Inducing Media Supplement</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>TGF humano recombinante-&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B</td><td>Utilizado en 10ng/ml</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin NL557 anticuerpo conjugado</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Utilizado en una dilución 1:10 para inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin </td><td>R& D Los sistemas</td><td>MAB1838</td><td>utilizan a 0,1 &mu; g/ml para Western</td></tr><tr><td>Blot Anti-Fibronectina</td><td>R& D Los sistemas</td><td>MAB1918</td><td>utilizan a 10 &mu; g/ml para inmunocitoquímica; Se utiliza a 0,5 &mu; g/ml para Western blot</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>utilizado a 0.2 &mu; g/ml para Western blot</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón NL493 Anticuerpo Secundario</td><td>R& D Systems</td><td>NL009</td><td>Utilizado en una dilución 1:200 para inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>Utilizado a 1:2000 para Western blot</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón HRP Anticuerpo Secundario</td><td>R& D Systems</td><td>HAF007</td><td>Utilizado a 1:2000 para Western blot</td></tr><tr><td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td><td>R& D Systems</td><td>SC026</td><td>Utilizado según las especificaciones del fabricante s instrucciones. Este kit contiene anticuerpos directamente conjugados contra E-cadherina, Vimentina y Snail.</td></tr><tr><td>96 Ensayo de invasión celular BME de 96 pozos</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Este kit se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</td></tr><tr><td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td><td>R& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Este kit se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante19.</td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0.4% Solución Azul de Tripán Life</td><td>Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td><td>Diluir en 1X PBS para hacer una solución madre al 10%</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluir en 1X PBS a una concentración de trabajo del 4%.</td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Fabrica una solución madre a 14,3 mM disolviéndola en agua. La solución de trabajo es una dilución 1:5000 de la solución madre en 1X PBS.</td></tr><tr><td>Pinza curva de punta fina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12 mm cubreobjetos</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada Utilizado</td><td></td><td></td><td>al 5% en TBST para el bloqueo en Western blot</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Para Western blot Bloqueo y lavado</td></tr><tr><td>Membrana</td><td></td><td></td> <td>de PVDFPara Western blot </td></tr><tr><td>4-20% SDS-page gel</td><td></td><td></td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>Sustrato</td><td></td><td></td> ECL <td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de</td><td></td><td></td><td></td>15 ml</tr><tr><td>Placas/matraces tratados</td><td></td><td></td><td></td>con cultivo</tr><tr><td>de tejidos Placas de 24 pocillos, tratamiento</td><td></td><td></td><td></td>con cultivo de tejidos</tr><tr><td>Pipetas / puntas</td><td></td> <td>de pipeta</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid / pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Baño</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>37 &deg; C/5%CO2 Centrífuga</td><td></td><td></td> de incubadora <td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de fluorescencia</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inducción y análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) es esencial para la morfogénesis durante el desarrollo adecuado. Regulación deficiente de este proceso ha sido implicado como un acontecimiento clave en la fibrosis y la progresión de los carcinomas a un estado metastásico. La comprensión de los procesos que subyacen a la EMT es imprescindible para el diagnóstico precoz y el control clínico de estos estados de enfermedad. Inducción fiable de EMT in vitro es una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos, así como para identificar comunes firmas de expresión genética con fines de diagnóstico. Aquí se demuestra un método directo para la inducción de EMT en una variedad de tipos de células. También se incluyen los métodos para el análisis de las células pre-y post-EMT de inducción por inmunocitoquímica. Además, se demuestra la eficacia de este método a través del análisis conjunto basado en anticuerpos y ensayos de migración / invasión.

. La EMT que inducen condiciones de cultivo descritas aquí proporcionan un método robusto para la inducción de EMT en una variedad de tipos de células Figuras 1 y 2 demuestran la morfología de los niveles de expresión y marcador para 4 diferentes líneas celulares humanas: células de glioblastoma T98G, células HT29 de adenocarcinoma de colon , células de carcinoma de pulmón A549, y MCF10A células epiteliales mamarias. Las células que fueron tratados con el suplemento de EMT medio inductor de cambiar desde una morfología epitelial clásica (figuras 1A - 1D) a una mesenquimal, la morfología en forma de huso (Figuras 1E - 1H). Las células inducidas EMT parecían menos densamente poblado en colonias cerradas en comparación con las células no inducidas. Muestras no inducidas MCF10A contenían racimos apretados rodeadas por las células de manera más flexible para llevar. Estos racimos apretados eran la E-cadherina positivo (Figura 2D) y desaparecieron tras el tratamiento con el inductor de EMT Medios Supplement (Figura 2H). EMT también fue evaluada por la regulación a la baja de marcadores epiteliales y la regulación positiva de los marcadores mesenquimales. La regulación a la baja de la expresión de E-cadherina se observa típicamente después de la inducción de EMT en diferentes tipos de células 3,4 La figura 2 muestra la expresión en superficie de la E-cadherina en la mayoría de las células no tratadas (Figuras 2A - 2D, rojo). En comparación con su ausencia después de inducción de EMT (Figuras 2E - 2H; rojo). Una línea celular, T98G, se encontró que tienen un muy bajo nivel basal de la E-cadherina antes de la inducción de EMT, que impidió su análisis. Upregulation del marcador mesenquimal, fibronectina, también fue visible después de la inducción con el Suplemento EMT medio inductor (Figuras 2A - 2D frente Figuras 2E - 2H; verde). Los niveles de expresión de E-cadherina y fibronectina vistos por inmunocitoquímicase confirmaron adicionalmente a través de Western Blot de lisados ​​de células totales (Figura 3). El western blot confirmó regulación a la baja de la E-cadherina y la regulación positiva de la expresión de fibronectina visto por inmunocitoquímica. Las bandas se cuantificaron utilizando densitometría y se normalizaron a GAPDH para determinar el cambio veces en relación después de la inducción de EMT. Niveles de E-cadherina se redujeron 6,4 y 3,4 veces en la A549 y células MCF10A, respectivamente. Niveles de fibronectina se incrementaron 4,6, 4,1, y 2,3 veces en T98G, A549, y células MCF10A, respectivamente. Aunque la transferencia de western no muestra una reducción significativa de los niveles de proteína E-cadherina en células HT29 de inducción después de la EMT, los resultados de inmunocitoquímica demostraron una reducción en la expresión en la superficie de la E-cadherina (Figura 2B frente 2F), que no es capaz de distinguirse en Western Blot de lisados ​​de células totales. A fin de evaluar el estado de EMT, conocido marcador adicionalSe analizaron s para EMT pre y post-inducción de la EMT. En consonancia con los resultados anteriores, la E-cadherina se downregulated en todas las líneas celulares examinadas, lo que indica que la EMT fue inducida. Además, los marcadores mesenquimales, vimentina y caracol, se upregulated en el A549, T98G, y células MCF10A después del tratamiento con suplemento de EMT medio inductor (Figura 4). La línea de células HT29 no mostró expresión de estos marcadores mesenquimales ya sea con o sin la inducción de EMT (datos no presentados), lo que puede indicar que estas células utilizan vías alternativas para la inducción de EMT. Aunque el TGF-β es suficiente para inducir la EMT en cierta célula de contextos de 7,8,9, otros tipos de células no responden únicamente a la adición de TGF-β 14. MCF7 células de cáncer de mama humano y PANC-1 en las células de carcinoma de páncreas humanos son a la vez informaron a no responder a TGF-β señalización solo 14. Para determinar si ambas líneas podrían someterse a EMT en vitrO, las células se cultivaron en presencia del suplemento de medio inductor de EMT. Las células fueron estimuladas con TGF-β1 solo recombinante, en la concentración en el Suplemento medio inductor de EMT. Estas células conservan su morfología epitelial, que consiste en colonias apretados de células (datos no presentados) y de superficie los niveles E-cadherina fueron similares a los observados en las células control (Figuras 5C y 5D frente a las figuras 5A y 5B). En contraste, las células estimuladas con el Suplemento EMT Inducir medios mostraron una disminución drástica de los niveles superficiales E-cadherina (Figuras 5E y 5F). Estas células también obtienen una morfología más mesenquimal, como las células llegaron a ser menos compacta y más de tipo huso (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que el método de EMT inducir descrito aquí es capaz de promover la morfología de EMT y cambios en la expresión de marcadores en células típicamente resistentes a TGF-β-iEMT nduced. Además de los cambios en la expresión del marcador, otra característica de las células mesenquimales es su capacidad para migrar e invadir. La migración y la invasión de células cultivadas con o sin el suplemento de EMT medio inductor se analizaron usando el ensayo de invasión así BME de la célula 96 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (50.000 células / pocillo) que contiene insertos de filtro con 8,0 m poros. Después de 48 h, la migración se evaluó por tinción de calceína AM de las células que habían migrado a través del filtro. Cada muestra se ensayó por triplicado dos veces con resultados similares. Los resultados representativos de un experimento se muestran en la Figura 6A. Aumentos estadísticamente significativos (p-valor &lt;0,003) en la migración celular se observó tanto con A549 y células PANC-1 después de la inducción de EMT. Para evaluar la capacidad de estas células para invadir (es decir, migrar a través de la matriz extracelular), el mismo ensayo fuerealizado con un filtro de extracto recubierto de la membrana basal. Células inducida EMT-mostraron un (valor P &lt;0,001) aumento estadísticamente significativo en la capacidad de invasión en comparación con las células no tratadas como se ve en la Figura 6B. La inducción robusta de EMT es útil para el análisis de los cambios de expresión génica y de señalización que tienen lugar en estas células. Matriz de análisis basados ​​en anticuerpos utilizando lisados ​​de células tanto tratados y no tratados es un método para analizar los niveles de expresión de una variedad de moléculas en una sola muestra. A modo de ejemplo, se analizaron los niveles de miembros de la familia MAPK fosforilada en lisados ​​de un-inducido y EMT inducida MCF7 y células A549 utilizando el Kit de array Proteoma Humano Profiler fosfo-MAPK. La matriz se ejecutó dos veces a partir de tratamientos de EMT-inducción independientes con resultados similares. Figura 7 muestra los datos representativos de una matriz. Ambos tipos de células mostraron aumento de la fosforilación de CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), y ERK2 (T185/Y187) en células inducidas-EMT en comparación con los controles. Se observaron diferencias en los eventos de señalización entre los dos tipos de células así. Células A549 mostraron un aumento en GSK-3 β (S9) la fosforilación, mientras que las células MCF7 mostraron aumento de la p70S6K (T421/S424) fosforilación. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Mesenquimales morfología de inducción después de la estimulación con el Suplemento EMT Inducir Media (A - D). Morfología epitelial en los cuatro tipos de células indicó tras el cultivo durante 5 días en medio de cultivo estándar sin el Suplemento EMT medio inductor (E - H). Morfología mesenquimales en el cuatro tipos de células indicaron cultivadas con el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Regulación a la baja de la expresión de marcadores epiteliales y la regulación positiva de la expresión de marcadores mesenquimales en células inducidas-EMT. Las células se tiñeron por inmunofluorescencia para detectar la expresión del marcador epitelial, E-cadherina (rojo), y el marcador mesenquimal, fibronectina (verde). (Un - D) Control de las células cultivadas sin el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días (E - H.) Las células cultivadas con el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Todas las células se contratiñeron con DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Confirmación de expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales con un western blot<html> . estudio de carácter de transferencia de Western de lisados ​​de células totales de los cuatro tipos de células indicado, se trató con (EMT) o sin (-) el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Bandas para la E-cadherina, fibronectina y el control GAPDH carga son como se indica a la izquierda. El marcador de tamaño es como se indica a la derecha. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. La regulación por incremento de los marcadores mesenquimales, vimentina y Snail en células inducidas-EMT. Las células se tiñeron por inmunofluorescencia multicolor para detectar la expresión del marcador epitelial, E-cadherina (gris), y los marcadores mesenquimales, vimentina (verde) y Caracol (rojo) Las células de control cultivadas sin el suplemento de EMT medio inductor durante 5 días. - (C A). (D - F) Las células cultivadas con el suplemento de EMT medio inductor durante 5 días. iempre &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="La figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. La inducción de EMT en células que no responden de TGF-β1. (A y B) Las células cultivadas con medio solo durante 5 días. (C y D) Las células cultivadas en medio que contenía 10 ng / ml de TGF-β1 durante 5 días. (E y F) Las células cultivadas en el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Todas las células se tiñeron para la expresión de E-cadherina (rojo) y counterstained con DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="La figura 6"/> Figura 6. Células inducida EMT-han aumentado la capacidad de migración e invasión. A. Número promedio de células que migraron a través de un filtro de poro 8 micras después de la incubación durante 48 horas. B. Número promedio decélulas que fueron capaces de invadir a través de un filtro de poro 8 micras recubierto con extracto de membrana basal después de la incubación durante 48 horas. Las barras de error indican la desviación estándar de más de 3 pozos. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="La figura 7"/> La expresión de matriz basada en anticuerpos Figura 7. De la EMT de inducción. Los lisados ​​de A549 (A y C) y MCF7 (B y D) las células cultivadas con o sin suplemento EMT Inducir medios se utilizaron para el análisis conjunto con el Kit de array Proteoma Humano Profiler fosfo-MAPK. Spots destacan en A y B fueron entonces su cuantificación mediante densitometría. Las comparaciones de los inducidos por la ONU lisados ​​inducida EMT a se muestran en los correspondientes gráficos de barras a continuación (C y D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura &lt;</a>/ A&gt;.

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método sencillo y reproducible para la inducción de la transición epitelial a mesenquimatosa o EMT in vitro. Esto se logra primero sembrando el tipo celular epitelial de interés en presencia del suplemento para el medio de inducción de EMT. El segundo paso del procedimiento consiste en reemplazar el medio de cultivo por medio de cultivo fresco que contiene el suplemento para el medio de inducción de EMT tres días después del sembrado inicial.El paso final consiste en recolectar las células cinco días después del siembra inicial para su caracterización posterior, como la inmunotinción. En última instancia, los resultados pueden mostrar que las células adquieren características mesenquimales mediante microscopía de luz, inmunocitroquímica, análisis de matriz por inmunotransferencia o cualquier otro procedimiento de análisis elegido. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la estimulación con TGF-beta o la modificación genética son que este método es rápido y sencillo, a diferencia de la modificación genética, y permite la inducción de la EMT en una variedad de tipos celulares, algunos de los cuales podrían no responder únicamente a la estimulación con TGF-beta.Las implicaciones de estas técnicas se extienden a la terapia y al diagnóstico de la metástasis del cáncer. Esta técnica permite a los investigadores desarrollar firmas de expresión comunes de células metastásicas que podrían utilizarse en el diagnóstico. Asimismo, proporciona células que pueden emplearse en la selección de fármacos.Comience calentando el medio de cultivo para las células de interés a 37 grados Celsius en un baño de agua. A continuación, recolecte las células utilizando una solución de disociación, como la triple E express. Luego, suspenda las células en medio de cultivo precalentado en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos.Retire cuidadosamente el sobrenadante vertiéndolo en un recipiente de desecho y suspenda el botón celular en medio de cultivo precalentado. Ahora cuente las células viables, diluya una muestra de la suspensión celular en solución de azul de tripan al 0,4 %. Coloque 10 microlitros de la muestra diluida en un hemocitómetro y cuente las células viables.Células viables. No deben volverse azules tras calcular la densidad celular en su placa de solución. De nueve a diez mil células por centímetro cuadrado en medio de cultivo precalentado que contenga un suplemento de medio inductor XEMT, utilizando placas o matraces de cultivo celular tratados.Incubar las células a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono y monitorear su morfología diariamente utilizando un microscopio invertido de luz. Tres días después, reemplazar el medio con medio de cultivo precalentado fresco que contenga un suplemento de medio inductor XEMT. Cinco días después de la siembra, las células estarán listas para el análisis.Visualice la morfología celular bajo un microscopio invertido de luz. Ahora las células pueden fijarse o recolectarse para estudios posteriores. Prepare laminillas estériles de 12 milímetros para una placa de 24 pocillos colocando las laminillas en una placa de Petri que contenga etanol al 95%. Retire cuidadosamente las laminillas del etanol utilizando una pinza curva.Las llamas esterilizan cada cubreobjetos y se transfieren a un pozo de una placa de 24 pozos; manipular los cubreobjetos requiere cuidado y práctica. A continuación, añada 0,5 mililitros de medio de cultivo precalentado que contenga un medio inductor de XEMT. Suplemente las células y siembre 16.000 células por pozo.Ahora cultive y alimente las células como se describió anteriormente. Cinco días después de sembrar las células, retire el medio y fíjelas con 300 microlitros por pozo de paraformaldehído al 4 % en 1X PBS, dejando que la fijación progrese durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego retire el fijador y enjuague las células dos veces con 500 microlitros de 1X PBS por pozo.A continuación, incubar las células fijadas en 400 microlitros de tampón bloqueante por pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Tras aplicar el bloqueo, preparar el anticuerpo primario en la concentración recomendada por el fabricante en 400 microlitros de tampón bloqueante por pocillo. Luego eliminar la solución de bloqueo de los pocillos y añadir la mezcla de anticuerpo a las células.Incube las células durante tres horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Y si el anticuerpo primario está directamente conjugado con un fluorocromo, incúbelos a oscuras. A continuación, elimine el anticuerpo primario y lave los pocillos tres veces con 500 microlitros por pocillo de PBS 1X que contiene 0,1 % de BSA, permitiendo que cada lavado dure cinco minutos y, si es necesario, proteja las células de la luz.Ahora, si es necesario, incubar las células con un anticuerpo secundario en la concentración recomendada por el fabricante. Diluir el anticuerpo en 400 microlitros por pozo de un XPBS que contenga 1% de BSA. Incubar durante una hora a temperatura ambiente protegido de la luz después de una hora.Lave las células tres veces tal como se hizo para eliminar el anticuerpo primario después de los lavados. Si se desea, aplique una tinción contraste DPI a las células. Por último, enjuague las células con agua desionizada y monte las laminillas boca abajo sobre portaobjetos utilizando medio de montaje.Una vez más, tenga cuidado al manipular las laminillas. Las condiciones de cultivo que inducen el MTE proporcionan un método robusto para la inducción del MTE en una variedad de tipos celulares. Esto se probó en cuatro líneas celulares humanas diferentes.Las células que fueron tratadas con el suplemento de medio inductor de EMT cambiaron de una morfología epitelial clásica a una morfología alargada de tipo mesenquimal. La doble tinción para la expresión de E-cadherina y fibronectina demostró la regulación negativa del marcador epitelial E-cadherina en rojo y la regulación positiva del marcador mesenquimal fibronectina en verde. Las muestras de CF10A no inducidas contenían grupos estrechamente empaquetados rodeados por células más dispersas. Estos grupos eran positivos para E-cadherina, mostrado en rojo.Los cúmulos desaparecieron tras el tratamiento con el suplemento de medio inductor de EMT. Esto coincidió con un aumento en la expresión de fibronectina en verde. T 98.Se encontró que G tenía un nivel basal extremadamente bajo de terrina antes de la inducción del EMT, lo que impidió su análisis. Sin embargo, con este marcador, se observó un aumento significativo en los niveles de fibronectina tras la inducción del EMT en estas células. Los niveles de expresión de e adhere y fibronectina se confirmaron además mediante inmunotransferencia de lisados totales de células.Aunque el inmunoblot no muestra una reducción significativa de los niveles totales de la proteína EAD herrin en células HT 29, se observó una reducción en la expresión en la superficie de terrin detectada mediante inmunoquímica para evaluar más a fondo el estado de EMT. Los marcadores mesenquimales característicos del EMT, menton en verde y snail en rojo, se analizaron antes y después de la inducción de EMT, lo cual es consistente con resultados previos. Eki, mostrado aquí en gris, se reguló a la baja en todas las líneas celulares examinadas, lo que indica que se indujo el EMT. Además, se observó una regulación al alza de snail en rojo y menton en verde en células 5 49 T 98 G y MCF 10 A. Se ha reportado que las células CCF siete de cáncer de mama humano y las células PanIN de carcinoma pancreático humano no entran en EMT mediante la señalización de TGF beta por sí sola.Estos informes se confirmaron con TGF beta uno recombinante solo. A la concentración presente en el suplemento del medio inductor de EMT, las células mantuvieron su morfología epitelial y los niveles superficiales de E coherina fueron similares a los de las células de control. En contraste, las células estimuladas con el suplemento del medio inductor de EMT mostraron una disminución drástica en sus niveles superficiales de E cadherina.Estas células también adquirieron una morfología más mesenquimal. Otra característica distintiva de las células mesenquimales es su capacidad para migrar e invadir. Esto se analizó utilizando el ensayo de invasión celular BME de 96 pocillos.De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se observaron aumentos significativos en la migración celular tanto en células 5 49 como en células pan uno. Tras la inducción de la EMT, se realizó el mismo ensayo con un filtro recubierto de extracto de membrana basal para evaluar la invasión. Las células con EMT inducida mostraron un aumento significativo en las capacidades invasivas en comparación con las células no tratadas.La inducción robusta del EMT es útil para el análisis de los cambios en la expresión génica y la señalización que tienen lugar en estas células. Se utilizó un arreglo comercial basado en anticuerpos, empleando lisados de células MCF seven y células 5 49, para analizar los niveles de fosforilación de los miembros de la familia de quinasas MA. Ambos tipos celulares mostraron un aumento en la fosforilación de kreb irk uno y irk dos en las células con EMT inducido en comparación con los controles.Las células A549 también mostraron un aumento en la fosforilación de GSK3β. Las células MC7 mostraron un aumento en la fosforilación de P70S6K, además del incremento en la fosforilación de Kreb o uno y DIRK2. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que puede haber cierta variabilidad en los resultados entre diferentes tipos celulares, no todas las células.Utilizamos las mismas vías descendentes para la inducción de EMT, lo que conduce a diferencias en la expresión de marcadores entre los tipos celulares. Además, muchos marcadores de EMT no muestran estados estrictamente encendidos y apagados, y pueden presentar niveles basales en células epiteliales. Dichos marcadores pueden mostrar un intercambio creciente en su localización tras la transición mesenquimal siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como la cribado de fármacos, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como qué compuestos son capaces de modular la transición epitelial a mesenquimal. Estos compuestos podrían ser muy útiles en el tratamiento del cáncer y la fibrosis.

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Investigación

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Biología

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Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

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