Name: Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a detectar splicing alternativo durante la transición epitelial-mesenquimal utilizando un modelo inducible con células epiteliales mamarias humanas. Este método combina RT-PCR cuantitativa e inmunoblot para analizar isoformas.

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Los autores desean agradecer a Wensheng Liu por su inestimable ayuda con la obtención de imágenes celulares. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01 CA182467), la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-09-252-01-RMC), la Fundación Lynn Sage y la Fundación A Sister's Hope.

1. cultivo celular de EMT Inducción Nota: EMT puede ser inducida por tratamiento de TGF o la expresión ectópica de factores de transcripción Twist, Snail, o ZEB1 / 2 en las células epiteliales. Se describe en este protocolo es un sistema inducible EMT través de la expresión de la proteína de fusión Twist-ER en las células mamarias humanas inmortalizadas epiteliales (HMLE / Twist-ER, un regalo del Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Tras 4-hidroxitamoxifeno tratamiento (TAM), la proteína de fusión Twist-ER se transloca al núcleo para conducir la transcripción y los resultados en una transición EMT completa en 12-14 días 9,11,29. Sistemas inducibles EMT adicionales, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF, y MCF10A / TGF, se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores 11,30. <ol><li> Mantener células HMLE / desenroscables ER en mamaria medio de crecimiento de células epiteliales sin suero (MEGM) en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2. Pasaje de las células cada 2-3 días cuando llegan a 80% de confluencia. Se incuban las células con 0,15% de tripsina a 37 ° C durante 5-10 min, y después inactivar la tripsina con suero de ternera 5% / DMEM. Centrifugar las células y resuspender en MEGM. Células de la placa en una nueva placa de cultivo tisular en una proporción de 1 a 4. </li><li> Disolver TAM en etanol para preparar una solución 200 mM. Proteja TAM de la luz y almacenar a -20 ° C. Antes de su uso, recién añadir TAM en medios MEGM a una dilución de 1: 10.000 para hacer una concentración final de 20 nM TAM. </li><li> Para la inducción de la EMT, placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos por duplicado. Células de cultivo con medios 20 nM TAM-que contiene MEGM. </li><li> Placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm por duplicado y el tratamiento de las células con etanol 0,01% como control no tratada con TAM. </li><li> Dos días después de la incubación, tomar fotografías bajo un microscopio de luz a un aumento de 10X para registrar los cambios morfológicos de las células. </li><li> Aspirar el medio de un plato de control o tratados con TAMcélulas. Lavar las células con PBS frío, y las células de la cosecha mediante el desguace de un medio de la placa en tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en tampón RIPA para el análisis de proteínas. </li><li> Células pasaje del control o platos tratados con TAM en 1,6 x 10 6 células re-enchapado en una placa de 10 cm por duplicado. Continuamente tratar las células con 20 nM de TAM o vehículo. </li><li> Repita los pasos 5 a 7 una vez cada dos días hasta el día 14, momento en el cual, las células Twist-ER tratados con TAM muestran una morfología mesenquimal fusiforme, mientras que las células de control tratados con vehículo mantienen la morfología epitelial-adoquines similares. </li></ol> 2. Caracterización de EMT Nota: A la finalización de la EMT se indica mediante: (1) celulares cambios morfológicos de una morfología epitelial-adoquines como éste adopte un aspecto fibroblástico en forma de huso; (2) Pérdida de localización E-cadherina en las uniones célula-célula; y (3) La expresión de los marcadores de EMT de conmutación, que se define por la pérdidade marcadores epiteliales y ganancia de marcadores mesenquimales. Cambios morfológicos celulares son capturados por microscopio de luz a un aumento de 10X durante el curso del tiempo de la inducción de EMT, descrito en la Sección 1.-Immuno fluorescencia detección de E-cadherina en células uniones se describe en esta sección. La expresión de marcadores de EMT se detecta por inmunotransferencia. Marcadores epiteliales comunes son la E-cadherina, γ-catenina, y ocludina y marcadores mesenquimales incluyen fibronectina, N-cadherina y vimentina. Procedimientos generales de inmunotransferencia se describen en la Sección 4. <ol><li> En el día 12 del tratamiento TAM, semilla de 1 x 10 5 células en un 12 mm de vidrio cubreobjetos circular colocado en un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> 48 horas después de la siembra de células, medio aspirado y lavado con PBS precalentado. </li><li> Fijar las células con pre-calentado paraformaldehído al 4% durante 15 min. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 15min a TA. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células en 5% de BSA / PBS durante 1 hora a TA para bloquear la unión no específica. </li><li> Se incuban las células con el anticuerpo primario E-cadherina en una dilución 1:50 en 1% de BSA / PBS en una cámara humidificada O / N a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1:50 y 1: 200, y la dilución óptima para cada anticuerpo debe ser determinado experimentalmente. </li><li> Decantar el anticuerpo primario y lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en una dilución 1: 500 durante 1 hora a RT. Desde este paso en, proteger las células de la luz. </li><li> Decantar el anticuerpo secundario y lavar tres veces con PBS. </li><li> Las células se tiñen con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst durante 10 min. </li><li> Enjuagar las células con PBS tres veces. </li><li> Monte cubreobjetos con una gota de medio de montaje y cubreobjetos sello con esmalte de uñas. </li><li> Observar las células y tomarimages bajo un microscopio de fluorescencia 63X. </li></ol> La tinción con anticuerpos adicionales se puede realizar para confirmar el fenotipo EMT. Por ejemplo, N-cadherina y α-actina de músculo liso se pueden teñir para un 29,31,32 fenotipo mesenquimal. Reorganización de la estructura del citoesqueleto se puede controlar mediante tinción de las células con faloidina para F-actina 11. Además, los ensayos para la motilidad celular y la resistencia a la muerte celular se pueden realizar para examinar las propiedades de EMT 11. 3. Detección de Empalme isoformas utilizando ensayos de qRT-PCR <ol><li> Diseño Primer NOTA: Primer pares deben ser cuidadosamente diseñados para amplificar distintas isoformas de empalme. Omisión de exón, el evento splicing alternativo más comúnmente observado, se muestra aquí como un ejemplo para ilustrar la estrategia de diseño del cebador. Figura 1A representa una de cuatro exón pre-ARNm, con el tercer exón como un exón variable. La inclusión del exón 3 resultados enla producción de una isoforma de empalme más largo, mientras que la omisión del exón 3 genera una isoforma de empalme más corta. Los cebadores deben ser diseñados para distinguir la isoforma exón-3-y-incluido el exón 3-omitido isoforma, y ​​para detectar la transcripción de ARNm total de este. <ol><li> Para la detección de exón inclusión, diseñar cuidadosamente un cebador directo dentro de la variable de exón 3, y un cebador inverso en el interior del exón constitutiva cerca 4, lo que permite la amplificación específica de la isoforma exón-incluido variable. Asegúrese de no diseñar adelante y atrás primers dentro del mismo exón variable con el fin de evitar los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o pre-mRNA. </li><li> Para amplificar específicamente eventos omisión de exón, diseño uno de los cebadores que abarcan la unión del exón constitutiva 2 y el exón 4 que de otro modo se destruye cuando el exón variable de 3 se incluye. Diseñar el otro cebador dentro del exón constitutiva 4. Como tal, los productos PCR se generan sólo cuando el exón variable de 3 es en excluired y la constitutiva posteriormente se unen exón 2 y el exón 4 juntos. </li><li> Para detectar los transcritos totales del gen, el diseño de los cebadores dentro de los dos exones constitutivos 1 y 2 Por lo tanto, los productos de PCR se amplificaron a partir de todas las isoformas. </li><li> Asegúrese de que la temperatura de fusión (Tm) para todos los cebadores es de aproximadamente 55 ° C, la longitud de cada cebador es de aproximadamente 18-22 nucleótidos, y el tamaño de los productos de PCR es de entre 80 y 150 pares de bases. </li></ol></li><li> La extracción de RNA: Extracto de ARN utilizando un kit de aislamiento total de ARN (véase la Tabla de Materiales). <ol><li> Recoger las células en 350 l de tampón de lisis de ARN. </li><li> Añadir 350 l de etanol al 70% al lisado y mezclar bien. </li><li> Transferir la muestra a la columna de purificación de ARN. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min y descarte de flujo a través. </li><li> Lavar la columna una vez con 500 l de tampón de lavado ARN I y dos veces con tampón de lavado II de ARN. </li><li> Retirar el tampón de lavado residual de ARNII de la columna por centrifugación a velocidad máxima durante 2 min. </li><li> Transferir la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml, añadir 50 l de agua libre de nucleasa en el centro de la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación a la velocidad máxima. </li></ol></li><li> Síntesis de la primera cadena de ADNc <ol><li> Determinar la concentración y la calidad del ARN mediante medición de la absorción UV. NOTA: Good ARN de calidad debe tener una relación de absorbancia / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0. </li><li> Configuración de la transcriptasa inversa (RT) reacciones que contienen 250 ng de ARN total 0,05 g cebadores hexámeros al azar, 50 pmol de MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 l 5 x tampón de goscript, y 1 l de la enzima RT en un volumen final de 20 l. </li><li> Realizar RT reacciones a 42 º C durante 1 hora, seguido de incubación a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la enzima RT. </li></ol></li><li> PCR en tiempo real <ol><li> Establezca 20 l reacciones que consisten en 10 l SYBR verde Master Mix,0,1-1,0 l molde de ADNc, y 5 pmol cebadores directo e inverso. </li><li> Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos de los siguientes pasos: 95 ° C desnaturalización durante 10 segundos, 58 ° C recocido durante 10 segundos, y 60 ° C de extensión durante 30 segundos. Lleve a cabo reacciones de PCR por triplicado. </li><li> Compruebe curvas de disociación y asegúrese de que un solo pico se observa para cada grupo de cebadores. </li><li> Obtener los valores de ciclo de cuantificación (Cq) mediante el cálculo de los segundos valores derivados de curvas de amplificación. </li><li> Calcular la cantidad relativa (RQ) de ARNm diana en las muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida a través del "delta delta Cq (ΔΔCq) 'método como se muestra por la siguiente fórmula. Utilice los genes de limpieza, tales como GAPDH o PDD, como referencia. </li></ol></li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> Para calcular con mayor precisión los valores relativos de las isoformas de empalme, tl uso de múltiples genes de referencia debe ser considerada. Los resultados pueden ser analizados usando un método de cuantificación valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al 33,34. 4. Examen de Empalme Isoformas a nivel de proteínas <ol><li> Recoger las células en 100 tampón RIPA helada l. </li><li> Conjunto lisados ​​en hielo durante aproximadamente 10 min. </li><li> Centrifugar a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante. </li><li> Medir la concentración de proteína mediante ensayos de Bradford. </li><li> Diluir las muestras de proteína en tampón de carga SDS y cargar 20-40 g de proteínas en 10% geles de SDS-PAGE. </li><li> Ejecute geles SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas. </li><li> Proteínas de transferencia a membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas diana. </li><li> Bloquear la membrana en la leche desnatada al 5% durante 30 min a 1 hora a TA. </li><li> Incubar wi membranath un anticuerpo primario a 4 ° CO / N. El rango de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1: 200 y 1: 5000, determinar la dilución óptima para cada anticuerpo experimentalmente. La dilución de los anticuerpos utilizados en este protocolo se puede encontrar en la "Tabla de reactivos y equipos específicos". <ol><li> Para detectar isoformas de empalme, utilizar anticuerpos específicos que reconocen una isoforma particular. Alternativamente, utilizar un anticuerpo que reconoce el epítopo en la región de codificación de exón constitutiva y detectar isoformas de empalme de forma simultánea sobre la base de sus diferentes tamaños de proteína. </li><li> Al mismo tiempo, controlar EMT por inmunotransferencia para los marcadores de EMT. Utilice E-cadherina, γ-catenina, y ocludina como marcadores epiteliales, y la fibronectina, N-cadherina y vimentina como marcadores mesenquimales. </li></ol></li><li> De membrana de lavado tres veces con TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) en un intervalo de 5 min. </li><li> Incubar la membrana con una hormiga secundario conjugado con HRPibody en una dilución de 1: 10.000 durante 1 hora a RT. </li><li> Membrana Lavar tres veces con TBS-T en un intervalo de 5 min. </li><li> Visualizar proteína con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponer la membrana a una película de autorradiografía. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El procedimiento descrito aquí permite la detección de corte y empalme alternativo en un modelo inducible EMT. Como tales, las alteraciones dinámicas de empalme isoforma expresión pueden ser capturados durante todo el curso de tiempo de EMT. Este método tiene ventajas sobre el uso de diferentes epithelial- o líneas de células mesenquimales-que representa para la comparación de splicing alternativo debido a antecedentes genéticos distintos de líneas celulares no relacionados, podrían influir indebidamente en el splicing ...

La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un programa de desarrollo que impulsa la morfogénesis de órganos y la remodelación de tejidos durante la embriogénesis. Cuando se activa de forma anormal, EMT promueve la metástasis tumoral y la fibrosis de órganos 1,2. Estudios convincentes han descrito la importancia de la regulación transcripcional durante el proceso de la EMT, que se define por varios factores de transcripción, como Twist, Caracol, y ZEB, que reprimen la expresión de la proteína de unión adherens E-cadherina, lo que resulta en la pérdida de un cobble- piedra, como la morfología del epitelio y la ganancia de un fenotipo mesenquimal fusiforme 3-8. Estudios recientes a través del análisis de todo el genoma de ARN revelaron que existe un grupo de genes cuyos patrones de empalme están asociados ya sea con fenotipos epiteliales o mesenquimales 9,10. El trabajo de nuestro laboratorio funcionalmente conectado splicing alternativo y EMT. Mediante el estudio de la superficie celular molécula de adhesión CD44, hemos demostrado que CD44 alternativa empalme está estrechamente regulada durante EMT, y lo más importante, que la isoforma de empalme CD44 conmutación causalmente contribuye a EMT 11. Splicing alternativo representa un modelo generalizado y conservado de la regulación de genes, ya que hasta el 95% de los genes de varios exones humanos están empalmados alternativamente 12-14. Mediante la generación de múltiples productos de proteína a partir de un único gen, corte y empalme alternativo constituye un mecanismo esencial para la diversidad de proteínas, la adición de otra capa de complejidad al genoma humano. Como tal, la desregulación de splicing alternativo podría dar lugar a profundos efectos biológicos que causan enfermedades humanas. De hecho, el splicing alternativo aberrante en enfermedades se ha documentado desde hace más de una década 15-25, incluyendo los recientes hallazgos de que las mutaciones en los genes que codifican la maquinaria spliceosome se encuentran comúnmente en los síndromes mielodisplásicos 26-28. Por lo tanto, el desarrollo de métodos fiables para la detección de i empalmados alternativamentesoforms es de gran importancia en el estudio de diversos procesos biológicos incluyendo la EMT. Aquí proporcionamos un protocolo para detectar cambios en el splicing alternativo utilizando un modelo EMT inducible. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la detección de isoformas de empalme son adecuados no sólo para el estudio de corte y empalme alternativo durante la EMT, sino también para el estudio de splicing alternativo en otros procesos biológicos. La investigación de corte y empalme alternativo durante EMT es imperativo con el fin de comprender mejor los mecanismos de la EMT y la metástasis del tumor, facilitando así el desarrollo de estrategias eficaces para tratar la metástasis del cáncer.

<table><tbody><tr><td>4-hidroxitamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Haga una solución madre disolviendo 4-hidroxitamoxifeno en etanol a 200 &#956;M. Mantenga la solución a -20 &#176; C protegido de la luz.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit de aislamiento de ARN total</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Kit de aislamiento de ARN total</td></tr><tr><td>Sistema de transcripción inversa GoScript</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reactivo para ensayo qRT-PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reactivo para ensayo qRT-PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipo para ensayo qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD44</td><td>R& D Systems</td><td>BBA10</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo E-cadherina</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4065</td><td>Dilución 1:2.500 para inmunotransferencia; Dilución 1:50 para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>&gamma;-Catenina anticuerpo</td><td>Tecnología de señalización</td> celular <td>2309</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Occludin</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>anticuerpo de fibronectina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>anticuerpo de N-cadherina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>dilución 1:2.000</td></tr><tr><td>anticuerpo de vimentina</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>anticuerpo GAPDH</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>Amasham ECL Reactivo de detección de Western blot</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Sistema de quimioluminiscencia</td></tr></tbody></table>

detección de splicing alternativo durante epitelial-mesenquimal de transición

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

El empalme alternativo desempeña un papel crítico en la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial que ocurre en varios procesos fisiológicos y patológicos. En este trabajo describimos una estrategia para detectar el splicing alternativo durante la EMT utilizando un modelo de EMT inducible mediante la expresión del represor de transcripción Twist. La EMT se controla mediante cambios en la morfología celular, la pérdida de la localización de la E-cadherina en las uniones célula-célula y la expresión conmutada de los marcadores de EMT, como la pérdida de los marcadores epiteliales E-cadherina y γ-catenina y la ganancia de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. Utilizando conjuntos de cebadores específicos de isoformas, el empalme alternativo de los ARNm interesados se analiza mediante RT-PCR cuantitativa. La producción de las isoformas proteicas correspondientes se valida mediante ensayos de inmunotransferencia. El método de detección de isoformas de empalme descrito aquí también es adecuado para el estudio de empalme alternativo en otros procesos biológicos.

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para detectar splicing alternativo durante la EMT. Los resultados representativos de empalme isoforma CD44 conmutación durante EMT inducida Twist-A continuación se dan como ejemplo. EMT inducida Twist-en las células HMLE / Twist-ER se caracteriza por una transición de un adoquín como fenotipo epitelial a un fenotipo fibroblástico alargada (Figura 2A), la ausencia de marcadores epiteliales E-cadherina, ...

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar cambios en el empalme alternativo durante la EMT. Esto se logra mediante la utilización de un modelo EMT inducible en el que la expresión de la proteína de fusión retorcido er. En las células epiteliales mamarias humanas, las células se someten a EMT tras el tratamiento con tamoxifeno como segundo paso.La expresión de las isoformas de empalme se analiza mediante R-T-P-C-R cuantitativo utilizando conjuntos de cebadores específicos de isoformas, lo que revela cambios de empalme alternativos a nivel de ARN. A continuación, se determina la abundancia de proteína correspondiente a cada isoforma mediante inmuno transferencia con el fin de confirmar la expresión de isoformas de empalme a nivel de proteína, se obtienen resultados que muestran cambios en el splicing alternativo en genes de interés durante la EMT, basados en análisis cuantitativos de R-T-P-C-R e inmuno transferencia, Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del empalme alternativo de RN y EMT, por ejemplo, cómo se regula el empalme alternativo durante la EMT y cómo esta regulación afecta a la EMT y a los procesos patológicos relacionados con la EMT. Las implicaciones de esta técnica son favorables a la terapia del cáncer, ya que la EMT desempeña un papel importante en la promoción de la invasión tumoral y la metástasis.Aunque este método puede proporcionar información sobre el empalme alternativo durante EMT. El método para la detección de MRA específico de isoformas también se puede aplicar en otros sistemas, como el estudio del splicing alternativo en la diferenciación de neuronas y el programa de muertes celulares. El primer paso es colocar las células que expresan la semilla de la proteína de fusión ER de torsión en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros por duplicado, a continuación, preparar y proteger la luz de la solución de tamoxifeno para inducir la transición mesenquimal epitelial o tratar las células EMT con 20 medios que contienen tamoxifeno nanomolar para un grupo de control no tratado con tamoxifeno, agregar etanol al 0,01% a un conjunto adicional de células dos días después de la incubación.Tome fotografías bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x para registrar cualquier cambio morfológico. A continuación, lave las celdas con PBS frío. Raspe las células de una mitad de la placa en un tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en 100 microlitros de tampón de ripa helado para el análisis de proteínas, pase las células de ambos grupos como se muestra anteriormente y trate continuamente con tamoxifeno de 20 nanomolares o vehículo.Repita estos pasos cada dos días hasta el día 14, momento en el que las células RE retorcidas tratadas con tamoxifeno deben mostrar una morfología mesenquimal en forma de huso. Mientras que los controles tratados con vehículos deben mantener la morfología epitelial similar a la de los adoquines. Aquí se utiliza un NNA prem de cuatro exones como ejemplo para la detección de la inclusión de exones.Diseñe un cebador directo dentro del exón variable tres y un cebador inverso dentro del exón cuatro constitutivo cercano. Permitiendo la amplificación específica de la variable exón incluido isoforma para amplificar específicamente los eventos de omisión de exón. Diseñe cebadores que abarquen la unión del exón constitutivo dos y el exón cuatro que, de otro modo, se destruirían cuando se incluye el exón variable tres.Diseñe el otro cebador dentro del exón constitutivo cuatro para detectar las transcripciones totales del gen y evite los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o cebadores de prem NA.Design dentro de dos exones constitutivos cuando esté listo. Sigue los procedimientos estándar de extracción de ARN para aislar el ARN de las muestras celulares recolectadas anteriormente. Determinar la concentración y calidad del ARN por absorción UV para sintetizar la primera hebra de CD NA configurada para reacciones de transcriptasa inversa en un volumen final de 20 microlitros.Realice reacciones RT a 42 grados centígrados durante una hora, seguidas de incubación a 70 grados centígrados durante cinco minutos. Para inactivar la enzima RT en tiempo real. PCR configuró 20 reacciones de microlitros que consisten en 10 microlitros de mezcla maestra de verde cibernético, 0.1 a 1.0 microlitros de plantilla de CD NA y cinco cebadores de picomoles hacia adelante y hacia atrás.Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos por triplicado. Verifique las curvas de disociación y asegúrese de que se observe un solo pico para cada conjunto de cebadores. Obtener los valores del ciclo de cuantificación calculando los valores de la segunda derivada de las curvas de amplificación.Calcule la cantidad relativa de ARNm objetivo en muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida utilizando el método CQ delta delta como se muestra en esta fórmula. Deje las células recolectadas para el análisis de proteínas en hielo durante aproximadamente 10 minutos antes de centrifugar y recolectar el sobrenadante. Después de determinar la concentración de proteínas, diluya las muestras en SDS cargando, tamponando y cargue de 20 a 40 microgramos de proteínas en geles de página de SDS al 10%.Ejecute los geles de página SDS a 20 miliamperios durante 1,5 horas. Después de este tiempo, transfiera las proteínas a las membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a cuatro grados centígrados durante tres horas a 85 voltios. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas objetivo.A continuación, bloquee la membrana en leche descremada al 5% durante 30 minutos a una hora. A temperatura ambiente, incubar la membrana con un anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche. El anticuerpo primario reconoce el epítopo en la región constitutiva del recubrimiento del exón y detecta las isoformas de corte simultáneamente en función de sus diferentes tamaños de proteína.Al mismo tiempo, controle la EMT mediante inmunotransferencia. Para marcadores EMT. Utilice eec, ahern, gamma catenina y ocludina como marcadores epiteliales y fibronectina n cadherina y mentón como marcadores mesenquimales.Al día siguiente, lave la membrana tres veces con TBST en intervalos de cinco minutos. A continuación, incubar la membrana con un anticuerpo secundario conjugado HRP en una dilución de 1 a 10.000 durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, lave la membrana tres veces con TBST a intervalos de cinco minutos.Finalmente, visualice las proteínas con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponga la membrana a una película de autorradiografía. La EMT inducida por torsión se caracterizó por una transición de un fenotipo epitelial similar a un adoquín a un fenotipo fibroblástico alargado, mostrando la ausencia de marcadores epiteliales, e cadherina, gamma catenina y ocludina, y la regulación positiva de los marcadores mesenquimales, fibronectina n cadherina y vimentina. Además, la EMT se evaluó por la pérdida de la localización de la cadherina EC en las uniones celulares descritas.Estos son los diseños de cebadores para la detección de isoformas de empalme CD 44. Las ubicaciones de los cebadores se indican mediante flechas de diferentes colores. Los resultados de los análisis Q-R-T-P-C-R indican una disminución significativa del ARNm de CD 44 V y un aumento del ARNm de CD 44 s después de 14 días de tratamiento con TAM.Por el contrario, la transcripción total de CD 44 permaneció sin cambios durante la EMT de acuerdo con los resultados de Q-R-T-P-C-R, el nivel de proteína de CD 44 V disminuyó notablemente, mientras que la expresión de la proteína CD 44 s se reguló en gran medida mientras se asistía a este procedimiento. Es importante recordar que la inducción exitosa de la otorrinolaringología es muy crucial. Por lo tanto, la ORL debe confirmarse cuidadosamente con varios métodos, como la detección de cambios en la morfología celular, la expresión de marcadores ORL y la localización de RIN en la superficie celular.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de gestión de reporteros de empalme, para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo afectan estos elementos actuantes y los factores de transacción a la regulación alternativa del empalme después de su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN, la biología del desarrollo y la biología del cáncer exploraran la regulación alternativa del empalme en los procesos de EMT durante el desarrollo normal y la metástasis del cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

Se describen métodos para investigar TGF-β2 inducida por EndMT en células endoteliales mediante la observación de los cambios en la morfología celular y el examen de la expresión endMT relacionados con los cambios de marcador utilizando la tinción de inmunofluorescencia. La edición del gen CRISPR/Cas9 fue descrita y utilizada para agotar el gen que codifica el caracol para investigar su papel en endMT inducido por TGF-β2.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

La prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados sobre cómo realizar la prueba.

Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Aprende a detectar splicing alternativo durante la transición epitelial-mesenquimal utilizando un modelo inducible con células epiteliales mamarias humanas. Este método combina RT-PCR cuantitativa e inmunoblot para analizar isoformas.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

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