Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

El objetivo general del siguiente experimento es detectar cambios en el empalme alternativo durante la EMT. Esto se logra mediante la utilización de un modelo EMT inducible en el que la expresión de la proteína de fusión retorcido er. En las células epiteliales mamarias humanas, las células se someten a EMT tras el tratamiento con tamoxifeno como segundo paso.

La expresión de las isoformas de empalme se analiza mediante R-T-P-C-R cuantitativo utilizando conjuntos de cebadores específicos de isoformas, lo que revela cambios de empalme alternativos a nivel de ARN. A continuación, se determina la abundancia de proteína correspondiente a cada isoforma mediante inmuno transferencia con el fin de confirmar la expresión de isoformas de empalme a nivel de proteína, se obtienen resultados que muestran cambios en el splicing alternativo en genes de interés durante la EMT, basados en análisis cuantitativos de R-T-P-C-R e inmuno transferencia, Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del empalme alternativo de RN y EMT, por ejemplo, cómo se regula el empalme alternativo durante la EMT y cómo esta regulación afecta a la EMT y a los procesos patológicos relacionados con la EMT. Las implicaciones de esta técnica son favorables a la terapia del cáncer, ya que la EMT desempeña un papel importante en la promoción de la invasión tumoral y la metástasis.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el empalme alternativo durante EMT. El método para la detección de MRA específico de isoformas también se puede aplicar en otros sistemas, como el estudio del splicing alternativo en la diferenciación de neuronas y el programa de muertes celulares. El primer paso es colocar las células que expresan la semilla de la proteína de fusión ER de torsión en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros por duplicado, a continuación, preparar y proteger la luz de la solución de tamoxifeno para inducir la transición mesenquimal epitelial o tratar las células EMT con 20 medios que contienen tamoxifeno nanomolar para un grupo de control no tratado con tamoxifeno, agregar etanol al 0,01% a un conjunto adicional de células dos días después de la incubación.

Tome fotografías bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x para registrar cualquier cambio morfológico. A continuación, lave las celdas con PBS frío. Raspe las células de una mitad de la placa en un tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en 100 microlitros de tampón de ripa helado para el análisis de proteínas, pase las células de ambos grupos como se muestra anteriormente y trate continuamente con tamoxifeno de 20 nanomolares o vehículo.

Repita estos pasos cada dos días hasta el día 14, momento en el que las células RE retorcidas tratadas con tamoxifeno deben mostrar una morfología mesenquimal en forma de huso. Mientras que los controles tratados con vehículos deben mantener la morfología epitelial similar a la de los adoquines. Aquí se utiliza un NNA prem de cuatro exones como ejemplo para la detección de la inclusión de exones.

Diseñe un cebador directo dentro del exón variable tres y un cebador inverso dentro del exón cuatro constitutivo cercano. Permitiendo la amplificación específica de la variable exón incluido isoforma para amplificar específicamente los eventos de omisión de exón. Diseñe cebadores que abarquen la unión del exón constitutivo dos y el exón cuatro que, de otro modo, se destruirían cuando se incluye el exón variable tres.

Diseñe el otro cebador dentro del exón constitutivo cuatro para detectar las transcripciones totales del gen y evite los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o cebadores de prem NA.Design dentro de dos exones constitutivos cuando esté listo. Sigue los procedimientos estándar de extracción de ARN para aislar el ARN de las muestras celulares recolectadas anteriormente. Determinar la concentración y calidad del ARN por absorción UV para sintetizar la primera hebra de CD NA configurada para reacciones de transcriptasa inversa en un volumen final de 20 microlitros.

Realice reacciones RT a 42 grados centígrados durante una hora, seguidas de incubación a 70 grados centígrados durante cinco minutos. Para inactivar la enzima RT en tiempo real. PCR configuró 20 reacciones de microlitros que consisten en 10 microlitros de mezcla maestra de verde cibernético, 0.1 a 1.0 microlitros de plantilla de CD NA y cinco cebadores de picomoles hacia adelante y hacia atrás.

Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos por triplicado. Verifique las curvas de disociación y asegúrese de que se observe un solo pico para cada conjunto de cebadores. Obtener los valores del ciclo de cuantificación calculando los valores de la segunda derivada de las curvas de amplificación.

Calcule la cantidad relativa de ARNm objetivo en muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida utilizando el método CQ delta delta como se muestra en esta fórmula. Deje las células recolectadas para el análisis de proteínas en hielo durante aproximadamente 10 minutos antes de centrifugar y recolectar el sobrenadante. Después de determinar la concentración de proteínas, diluya las muestras en SDS cargando, tamponando y cargue de 20 a 40 microgramos de proteínas en geles de página de SDS al 10%.

Ejecute los geles de página SDS a 20 miliamperios durante 1,5 horas. Después de este tiempo, transfiera las proteínas a las membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a cuatro grados centígrados durante tres horas a 85 voltios. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas objetivo.

A continuación, bloquee la membrana en leche descremada al 5% durante 30 minutos a una hora. A temperatura ambiente, incubar la membrana con un anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche. El anticuerpo primario reconoce el epítopo en la región constitutiva del recubrimiento del exón y detecta las isoformas de corte simultáneamente en función de sus diferentes tamaños de proteína.

Al mismo tiempo, controle la EMT mediante inmunotransferencia. Para marcadores EMT. Utilice eec, ahern, gamma catenina y ocludina como marcadores epiteliales y fibronectina n cadherina y mentón como marcadores mesenquimales.

Al día siguiente, lave la membrana tres veces con TBST en intervalos de cinco minutos. A continuación, incubar la membrana con un anticuerpo secundario conjugado HRP en una dilución de 1 a 10.000 durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, lave la membrana tres veces con TBST a intervalos de cinco minutos.

Finalmente, visualice las proteínas con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponga la membrana a una película de autorradiografía. La EMT inducida por torsión se caracterizó por una transición de un fenotipo epitelial similar a un adoquín a un fenotipo fibroblástico alargado, mostrando la ausencia de marcadores epiteliales, e cadherina, gamma catenina y ocludina, y la regulación positiva de los marcadores mesenquimales, fibronectina n cadherina y vimentina. Además, la EMT se evaluó por la pérdida de la localización de la cadherina EC en las uniones celulares descritas.

Estos son los diseños de cebadores para la detección de isoformas de empalme CD 44. Las ubicaciones de los cebadores se indican mediante flechas de diferentes colores. Los resultados de los análisis Q-R-T-P-C-R indican una disminución significativa del ARNm de CD 44 V y un aumento del ARNm de CD 44 s después de 14 días de tratamiento con TAM.

Por el contrario, la transcripción total de CD 44 permaneció sin cambios durante la EMT de acuerdo con los resultados de Q-R-T-P-C-R, el nivel de proteína de CD 44 V disminuyó notablemente, mientras que la expresión de la proteína CD 44 s se reguló en gran medida mientras se asistía a este procedimiento. Es importante recordar que la inducción exitosa de la otorrinolaringología es muy crucial. Por lo tanto, la ORL debe confirmarse cuidadosamente con varios métodos, como la detección de cambios en la morfología celular, la expresión de marcadores ORL y la localización de RIN en la superficie celular.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo de gestión de reporteros de empalme, para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo afectan estos elementos actuantes y los factores de transacción a la regulación alternativa del empalme después de su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN, la biología del desarrollo y la biología del cáncer exploraran la regulación alternativa del empalme en los procesos de EMT durante el desarrollo normal y la metástasis del cáncer.