Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un modelo de cultivo neuronal humano, identificar marcadores neuronales y aislar una población pura de neuronas para el análisis de la expresión génica. Esto se logra expandiendo primero las células neuroprogenitoras humanas para crear un suministro continuo de células progenitoras. Como segundo paso, las células neuroprogenitoras se cultivan en presencia de suplementos de diferenciación y factores de crecimiento neurotrófico en placas recubiertas con factores de unión.

A continuación, se realiza una tinción inmunofluorescente de marcadores neuronales para determinar el destino de las células neuroprogenitoras diferenciadas. Por último, se realiza una microdisección de captura láser de neuronas cultivadas en portaobjetos de membrana PEN para facilitar el análisis de la expresión génica específica de las neuronas. Se obtienen resultados que muestran que las células neuroprogenitoras diferenciadas son predominantemente de naturaleza neuronal.

Basado en tinción inmunofluorescente y captura de neuronas. Mediante la microdisección por captura láser, las células neuroprogenitoras humanas se pueden expandir y diferenciar en cultivos ricos en neuronas. Para estudios in vitro, como estos cultivos tienen algunas células gal, podemos utilizar la microdisección de captura láser para aislar una población pura de neuronas.

Para demostrar estos procedimientos, Ron Bouchard, investigador asociado sénior en nuestro centro de microscopios. Para comenzar este procedimiento, reviva un stock congelado de células neuroprogenitoras humanas aisladas del cerebro fetal calentándolas rápidamente a 37 grados Celsius y luego agregándolas a un T 75 que contiene 15 mililitros de medio neurobasal precalentado, suplementado con 10 nanogramos por mililitro, EG, F y FGF. Después de cultivar las células durante tres días, transfiera las neuroesferas a un tubo de 15 mililitros y péguelas por centrifugación a 1000 RPM durante cinco minutos después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, dejando atrás unos 100 microlitros de medio, y transfiera la célula en un tubo de einor.

Un pellet de celda de 100 microlitros es suficiente para dividirlo en dos matraces T 75. Si es menor, reduzca el número de frascos, ya que las células neuroprogenitoras no logran proliferar. Si se dividen delgadamente, rompa completamente las neuroesferas en una suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo 50 veces mientras mantiene la punta de 200 microlitros contra el fondo del tubo.

Comprobar visualmente el progreso con un microscopio para asegurar la disociación de las neurosferas. A continuación, divida la suspensión de la celda en partes iguales y añádala a dos matraces T 75. Uno para la expansión continua y otro para la diferenciación.

A continuación, incubar los frascos. Cambie el medio de las células neuroprogenitoras en el matraz marcado para la expansión por centrifugación. A continuación, descarte el medio antiguo y añada uno nuevo.

Cambie el medio cada cuatro o cinco días hasta que las neuroesferas alcancen su tamaño original de 300 a 500 micras. Para comenzar la diferenciación celular de los neuro progenitores en un cultivo rico en neuronas, coloque un solo cubrebocas en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cúbralo agregando 500 microlitros de 100 microgramos por mililitro de poli L lisina a cada uno. Incubar bien los platos durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego aspirar la solución de poliol lisina.

Enjuague la placa con agua estéril desionizada y aspire nuevamente. A continuación, cubra los pocillos de la placa con 500 microlitros de cinco microgramos por mililitro, laminina de ratón e incube durante 30 minutos después de la incubación, lave los pocillos con aspirado de PBS nuevamente y déjelos secar en la campana de cultivo de tejidos. Cuatro días después de dividir las células, transfiera las pequeñas neuroesferas del matraz marcado para la diferenciación a la placa recubierta de 24 pocillos.

Agregue una densidad de aproximadamente 500 neuroesferas por pocillo después de incubar durante seis horas cuando las neuroesferas se hayan adherido al plato, elimine el medio de proliferación y agregue diferenciación. Medio compuesto por medio neuro basal B 27 suplemento N-G-F-B-D-N-F-D-B-C y ácido retinoico. Devolver la placa a la incubadora después del cultivo de células neuroprogenitoras en un medio de diferenciación neuronal durante dos semanas, se obtiene un cultivo rico en neuronas.

Enjuague las neuronas una vez en PBS y luego fíjelas en aldehído de paraforma al 4% durante 30 minutos. Una vez fijas, enjuague las celdas tres veces con PBS. A continuación, prepare las células para la tinción inmunológica incubándolas con tampón permeable a temperatura ambiente durante 60 minutos.

A continuación, agregue anticuerpos policlonales y monoclonales en 3%BSA en PBS a los pocillos. Agregando un par de anticuerpos diferente a cada uno, incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador a la mañana siguiente. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS y luego incube con anticuerpos secundarios anti conejo P SI tres y anti-US fitzy a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 minutos después de la incubación.

Lave las fundas tres veces con PBS. A continuación, coloque 10 microlitros de medio de montaje en un portaobjetos de cristal. Extraiga el cubreobjetos de la placa de cultivo y colóquelo boca abajo en el medio de montaje.

Limpie suavemente cualquier exceso de medio de montaje y selle los bordes con esmalte de uñas. Para preparar primero las células para la microdisección, diferencie las células neuroprogenitoras en un cultivo rico en neuronas en la membrana PEN. Portaobjetos recubiertos con poli L lisina y laminina.

Realice todos los pasos posteriores en condiciones libres de ARN. A continuación, tiñe los cultivos utilizando la tinción del gen histo para visualizar las células que tiñen el gen histo de color púrpura y el citoplasma, de un rosa claro, lo que facilita la diferenciación de las neuronas y las células gliales por sus distintas morfologías. Coloque el portaobjetos en etanol al 75% y agua estéril desionizada durante 30 segundos.

A continuación, coloque el portaobjetos sobre una toallita Kim. Agregue 200 microlitros del gen histo y espere 20 segundos. A continuación, coloque el portaobjetos secuencialmente durante 30 segundos cada uno en agua estéril desionizada, 75% de etanol, 95% de etanol y 100% de etanol.

Luego colóquelo en xileno durante cinco minutos y seque en una toallita Kim durante cinco minutos. A continuación, coloque un portaobjetos de membrana PEN sobre el portaobjetos normal y colóquelos en el sistema de microdisección de captura láser de Veritas o LCM utilizando el software. Tome una imagen de mapa de ruta para encontrar las áreas de poblaciones neuronales puras desprovistas de astrocitos.

Marque estas neuronas con las herramientas de dibujo. A continuación, realice la captura láser de estas áreas utilizando precisión y automatización controladas por computadora en un proceso de dos pasos. En primer lugar, el infrarrojo se dispara en múltiples puntos con un ajuste de potencia láser de 70 milivatios y un pulso de 2.500 microsegundos para unir la membrana a la tapa.

A continuación, el área marcada se extirpa con una herramienta de corte UV a un ajuste de nivel bajo de 10 milivoltios. La combinación de estos procesos captura selectivamente las áreas marcadas en las tapas macro de LCM de captura. Cuando se haya capturado un mínimo de 100 neuronas, use un microscopio para quitar la membrana de la tapa y colóquela en un tubo.

Aísle el ARN total de las muestras de LCM utilizando un kit de aislamiento de ARN P OPU y trátelo con ADN. A continuación, amplifique el ARN aislado utilizando el kit de amplificación de ARN ribo amp siguiendo las instrucciones del kit. Por último, realice análisis R-T-P-C-R en tiempo real utilizando sondas TAC MAN para detectar la cadena pesada de neurofilamentos humanos.

Un cultivo rico en neuronas se obtiene mediante la diferenciación de neuroesferas de cuatro días de edad utilizando poli L lisina y superficies recubiertas de laminado en combinación con factores de crecimiento específicos de diferenciación. Después de dos semanas, se obtiene un cultivo rico en neuronas que se muestra aquí en áreas de baja densidad. Las células pueden diferenciarse en astrocitos como los que se ven aquí.

La diferenciación de astrocitos también se puede dirigir mediante el uso del factor de crecimiento CNTF en lugar de los utilizados para la diferenciación de neuronas. La diferenciación neuronal se puede identificar utilizando anticuerpos contra los marcadores neuronales específicos, nuevo N y sinapsina, acetilcolinesterasa y sinaptofisina, y BDNF y GAAP 43 La tinción positiva es evidencia de que las células diferenciadas tienen características de neuronas primarias. Además, los astrocitos se pueden identificar a través de la tinción inmunológica GAP y stat three positiva.

La microdisección de neuronas por captura láser se realiza en células que se han diferenciado en una membrana PEN recubierta de poli L lisina y laminina. Para visualizar las células, las células de interés se pueden delinear con un láser, que derrite la membrana del PEN, haciendo que se pegue a la tapa de captura colocada sobre ella. Al final, se pueden delinear y capturar numerosas células en la misma tapa para el análisis de ADN o ARN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas mediante microdisección de captura láser.