Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un modelo de cultivo neuronal humano, identificar marcadores neuronales y aislar una población pura de neuronas para el análisis de expresión génica. Esto se logra primero expandiendo células progenitoras neurales humanas para crear un suministro continuo de células progenitoras. Como segundo paso, las células progenitoras neurales se cultivan en presencia de suplementos de diferenciación y factores neurotróficos de crecimiento en placas recubiertas con factores de adhesión.

A continuación, se realiza una tinción inmunofluorescente para marcadores neuronales con el fin de determinar el destino de las células progenitoras neurales diferenciadas. Finalmente, se lleva a cabo la microdisección láser por captura de neuronas cultivadas en portaobjetos con membrana PEN para facilitar el análisis de la expresión génica específica de neuronas. Se obtienen resultados que muestran que las células progenitoras neurales diferenciadas son predominantemente de naturaleza neuronal.

Basado en la tinción por inmunofluorescencia y captura de neuronas. Mediante microdisección láser, las células progenitoras neuronales humanas pueden amplificarse y diferenciarse en cultivos ricos en neuronas. Para estudios in vitro, dado que estos cultivos contienen algunas células gal, podemos utilizar la microdisección láser para aislar una población pura de neuronas.

Quien demostrará estos procedimientos será Ron Bouchard, un asociado sénior de investigación en nuestra instalación central de microscopía. Para comenzar este procedimiento, reactive una muestra congelada de células progenitoras neuronales humanas aisladas del cerebro fetal calentándolas rápidamente a 37 grados Celsius, y luego añádalas a un frasco T75 que contenga 15 mililitros de medio neurobasal precalentado, suplementado con 10 nanogramos por mililitro de EG, F y FGF. Después de cultivar las células durante tres días, transfiera los neuroesferoides a un tubo de 15 mililitros y haga un pellet por centrifugación a 1000 RPM durante cinco minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 microlitros de medio, y transfiera el pellet celular a un tubo eppendorf.

Un pellet de células de 100 microlitros es suficiente para dividirlo entre dos matraces T 75. Si hay menos cantidad, reduzca el número de matraces, ya que las células progenitoras neuronales no logran proliferar. Si la división es escasa, desintegre completamente las neuroesferas en una suspensión de células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 50 veces, manteniendo la punta de 200 microlitros en contacto con el fondo del tubo.

Verifique visualmente el progreso utilizando un microscopio para asegurar la disociación de las neuroesferas. A continuación, divida la suspensión celular en partes iguales y añádala a dos frascos T 75. Uno para la expansión continua y otro para la diferenciación.

Luego, incubar los frascos. Cambiar el medio de las células progenitoras neuronales en el frasco marcado para expansión mediante centrifugación. A continuación, desechar el medio antiguo y añadir medio nuevo.

Cambie el medio cada cuatro o cinco días hasta que las neuroesferas alcancen su tamaño original de 300 a 500 micrones. Para iniciar la diferenciación de células progenitoras neurales hacia un cultivo rico en neuronas, coloque un portaobjetos individual en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y recubra añadiendo 500 microlitros de poli-L-lisina al 100 microgramos por mililitro en cada uno. Incube los pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego aspire la solución de poli-L-lisina.

Lave la placa con agua estéril desionizada y aspire nuevamente. A continuación, recubra los pocillos de la placa con 500 microlitros de laminina de ratón a cinco microgramos por mililitro e incube durante 30 minutos; tras la incubación, lave los pocillos con PBS, aspire de nuevo y déjelos secar en la cabina de cultivo celular. Cuatro días después de dividir las células, transfiera los neuroesferas pequeñas del matraz etiquetado para diferenciación al placa de 24 pocillos recubierta.

Agregue una densidad de aproximadamente 500 neuroesferas por pocillo tras incubar durante seis horas; cuando las neuroesferas se hayan adherido al recipiente, retire el medio de proliferación y agregue el medio de diferenciación. El medio compuesto por medio neurobasal, suplemento B-27, NGF, BDNF, GDNF y ácido retinoico. Devuelva la placa al incubador; tras cultivar las células progenitoras neurales en medio de diferenciación neuronal durante dos semanas, se obtiene un cultivo rico en neuronas.

Lave los neuronas una vez con PBS y luego fíjelos con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Una vez fijadas, lave las células tres veces con PBS. A continuación, prepare las células para la inmunotinción incubándolas con tampón permeabilizante a temperatura ambiente durante 60 minutos.

A continuación, agregue anticuerpos policlonales y monoclonales en PBS con 3% de BSA a los pocillos. Agregue un par diferente de anticuerpos a cada pocillo e incube toda la noche a cuatro grados Celsius en un agitador. A la mañana siguiente, lave las laminillas tres veces con PBS e incube luego con anticuerpos secundarios anti-conejo P SI tres y anti-US fitzy a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 90 minutos tras la incubación.

Lave las laminillas tres veces con PBS. A continuación, coloque 10 microlitros de medio de montaje sobre un portaobjetos. Saque la laminilla del recipiente de cultivo y colóquela boca abajo sobre el medio de montaje.

Elimine suavemente cualquier medio de montaje en exceso y selle los bordes con esmalte de uñas. Para preparar las células para la microdisección, primero diferencie las células progenitoras neurales en un cultivo rico en neuronas sobre una membrana PEN. Portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina y laminina.

Realice todos los pasos siguientes en condiciones libres de ARN. A continuación, tiña los cultivos utilizando el tinte histo gene para visualizar las células; el tinte histo gene colorea los núcleos de color púrpura y el citoplasma de un rosa claro, lo que facilita la diferenciación de neuronas y células gliales por sus morfologías distintas. Coloque el portaobjetos en etanol al 75 % y agua estéril desionizada durante 30 segundos.

Luego, coloque el portaobjetos sobre una toallita Kim. Añada 200 microlitros de histo gene y espere 20 segundos. A continuación, coloque el portaobjetos secuencialmente durante 30 segundos cada uno en agua estéril desionizada, etanol al 75%, etanol al 95% y etanol al 100%.

Luego coloque en xileno durante cinco minutos y seque en una toalla Kim durante cinco minutos. A continuación, coloque una lámina con membrana PEN sobre la lámina normal y coloque ambas en el sistema de microdisección por captura láser Veritas o LCM utilizando el software. Obtenga una imagen de referencia para localizar las áreas con poblaciones neuronales puras desprovistas de astrocitos.

Marque estas neuronas utilizando las herramientas de dibujo. A continuación, realice la captura láser de estas áreas utilizando precisión y automatización controladas por computadora en un proceso de dos pasos. Primero, se dispara IR en múltiples puntos con una configuración de potencia del láser de 70 milivatios y un pulso de 2.500 microsegundos para adherir la membrana a la tapa.

A continuación, se extrae el área marcada utilizando una herramienta de corte UV con un ajuste bajo de 10 milivoltios. La combinación de estos procesos captura selectivamente las áreas marcadas en las cubiertas macro LCM. Cuando se han capturado al menos 100 neuronas, utilice un microscopio para retirar la membrana de la cubierta y colóquela en un tubo.

Aísle el ARN total de las muestras de MAC utilizando un kit de aislamiento de ARN P OPU y trátelo con ADNasas. Luego, amplifique el ARN aislado utilizando un kit de amplificación de ARN ribo amp siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, realice un análisis de R-T-P-C-R en tiempo real utilizando sondas TAC MAN para detectar la cadena pesada del neurofilamento humano.

Se obtiene un cultivo rico en neuronas mediante la diferenciación de neuroesferas de cuatro días de edad, utilizando superficies recubiertas con poli-L-lisina y laminina, en combinación con factores de crecimiento específicos para la diferenciación. Después de dos semanas, se obtiene un cultivo rico en neuronas, como el que se muestra aquí, en áreas de baja densidad. Las células pueden diferenciarse en astrocitos, como los que se observan aquí.

La diferenciación de astrocitos también puede dirigirse utilizando el factor de crecimiento CNTF en lugar de los utilizados para la diferenciación neuronal. La diferenciación neuronal puede identificarse mediante el uso de anticuerpos frente a marcadores neuronales específicos, como new N y sinapsina, acetilcolinesterasa y sinaptofisina, y BDNF y GAAP 43. La tinción positiva es evidencia de que las células diferenciadas poseen características de neuronas primarias. Además, los astrocitos pueden identificarse mediante tinción inmunológica positiva para stat tres y GAP.

La microdisección por captura láser de neuronas se realiza en células que se han diferenciado sobre portaobjetos con membrana de PEN recubierta con poli-L-lisina y laminina. Aquí se muestran neuronas teñidas con tinción histológica. Para visualizar las células, las células de interés pueden delimitarse entonces mediante un láser, que derrite la membrana de PEN, haciendo que esta se adhiera a la tapa de captura colocada encima. Al final, se pueden delimitar y capturar numerosas células sobre la misma tapa para análisis de ADN o ARN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas utilizando microdisección con láser.