Name: Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprende microdisección por láser de neuronas diferenciadas a partir de neuroprogenitoras humanas en cultivo. Este método permite aislar poblaciones puras de neuronas para análisis de expresión génica en estudios de neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por el subsidio Revisión Mérito (NEUD-004-07F) de la Administración de Veteranos (SP).

1. La expansión de los NPCs Humanos (Figura 1) <ol><li> Revive la madre congelada de NPCs humanos de cerebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) y el cultivo en suspensión en matraces T-75 como neuroesferas (Figura 1A) en medio neurobasal contienen suplementos proliferación, EGF (10 ng / ml) y FGF (10 ng / ml). </li><li> Después de 3 días en cultivo, transferir las neuroesferas a un tubo de 15 ml y centrifugar a 500 rpm durante 5 min. </li><li> Descartar el sobrenadante dejando tras de ~ 100 l medio por encima de la pastilla de células y transferir a un tubo Eppendorf. Un pelet de 100 l de células es suficiente para dividir en 2 matraces T-75. Si menos, reducir el número de frascos como células neuroprogenitoras fallan a proliferar si dividir delgada. </li><li> Se tritura el precipitado con una punta l 50x 200 mientras se mantiene la punta 200 l contra la parte inferior del tubo. Divida la suspensión de células por igual en dos partes y añadirlos a 2 T-75 frascos (1-2), una división de continuarla expansión y la otra para la diferenciación. </li><li> Continuar con el cultivo de las células neuroprogenitoras de expansión (primer matraz) cambiando el medio cada 4-5 días hasta que las neuroesferas alcanzan su tamaño original de 300-500 micras. Cambie medio por centrifugación (500 rpm, 5 min), se elimina el medio viejo y añadir nuevo medio. </li></ol> 2. La diferenciación de los NPCs humano en una cultura de la neurona-rica (Figura 2) <ol><li> Para la diferenciación de las células neuroprogenitoras en una rica cultura de la neurona, coloque un solo cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cubrir con 100 g / ml de poli-L-lisina mediante la adición de 500 l en cada pocillo. Incubar los platos durante 30 min a TA. </li><li> Aspirar la solución de poli-L-lisina y enjuagar la placa con agua estéril. </li><li> Después, cubra los pocillos de la placa con 500 l de 5 mg / ml de laminina de ratón y se incuba durante 30 min. Después de la incubación, lavar los pocillos con PBS. </li><li> 4 días después splittión de las células (paso 1.4), transfiera las pequeñas neuroesferas en el frasco etiquetado «para la diferenciación &#39;en las placas revestidas con una densidad de ~ 500 neuroesferas por pocillo de placas de 24 pocillos. </li><li> Después de 6 horas, cuando las neuroesferas se fijan a la placa, retire el medio de proliferación y se añade medio de diferenciación consiste en medio neurobasal, suplemento de B27, NGF (20 ng / ml), el BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), y ácido retinoico (2 M). </li></ol> 3. Inmunofluorescencia tinción de Diferenciados NPCs (Figura 3) <ol><li> Después del cultivo de las células neuroprogenitoras en medio de diferenciación neuronal durante dos semanas, se obtiene un cultivo de neuronas-rica. Enjuague las neuronas una vez en PBS y luego fijar en paraformaldehído al 4% durante 30 min. Una vez fijado, enjuagar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con tampón de permeabilización (5% de BSA y 0,2% de Triton X-100 en PBS) a TA durante 60 min. </li><li> Incubar los platos O / N a 4 ° C iagitador de NA con la siguiente combinación de anticuerpos policlonales y monoclonales en 3% de BSA en PBS: NeuN (1:250) y sinapsina (1:250); acetil colinesterasa (1:500) y sinaptofisina (1:250); BDNF (1 : 500) y GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) y GFAP (1:1000). </li><li> Lavar los cubreobjetos tres veces con PBS y luego se incuban con anticuerpos secundarios anti-ratón-FITC anti-conejo-Cy3 y a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min. Después de la incubación, los cubreobjetos lavar tres veces con PBS. </li><li> Ponga 10 l de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio, sacar el portaobjetos de la placa de cultivo con unas pinzas y colóquela boca abajo en el medio de montaje. Con cuidado, limpie el exceso de medio de montaje y sellar los bordes con esmalte de uñas. </li><li> Examine las neuronas inmunoteñidas en un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 4. Microdisección de captura por láser de neuronas (Figura 4) <ol><li> Diferenciar NPCs en un cultivo de neuronas ricas en PEN diapositiva membranas recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón siguiendo los procedimientos descritos para la Figura 2. </li><li> Realice todos los pasos subsiguientes en condiciones libres de RNasa. </li><li> Teñir las culturas utilizando HistoGene Stain (Arcturus) para visualizar las células. </li><li> Encuentra las áreas de poblaciones neuronales puras carentes de astrocitos utilizando la imagen del mapa de carreteras de toda la diapositiva con el sistema Veritas LCM. Marque las neuronas usando las herramientas de dibujo. </li><li> Realizar captura por láser de estas áreas utilizando precisión y la automatización controlada por ordenador en un proceso de dos pasos. En primer lugar, de IR (infrarrojos) se enciende en múltiples puntos con un ajuste de potencia de láser de 70 mW y un pulso de 2500 microsegundos para obtener la membrana se adhieren a la tapa. A continuación, el área marcada se extirpa mediante una herramienta de corte de UV en un ajuste bajo nivel de 10 mV. </li><li> La combinación de estos procesos de captura selectivamente las zonas marcadas de la membrana PEN en CapSure LCM macro tapas. Cuando se levanta la tapa, la membrana con el neurons se adhiere a la tapa. </li><li> Aislar ARN total de muestras LCM utilizando un kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus) y tratar con DNasa. </li><li> Amplificar el ARN aislado utilizando el kit de amplificación RiboAmp ARN siguiendo instrucciones del kit. </li><li> Realizar Análisis en tiempo real RT-PCR utilizando sondas TaqMan para detectar neurofilamento humana de cadena pesada (hNFHc). </li></ol> Abreviaturas: AD, la enfermedad de Alzheimer; BDNF, el factor neurotrófico derivado del cerebro; CREB, la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico; DBC, el AMP cíclico dibutiril; EGF, factor de crecimiento epidérmico; FGF, factor de crecimiento de fibroblastos; GFAP, proteína ácida glial fibrilar; LCM, laser capturar microdissection; NGF, factor de crecimiento nervioso; NPC, neuroprogenitoras celular; PEN, polietilennaftalato.

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<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que declarar.

Se describe en este estudio un modelo de cultivo celular de la neurona-rica por la diferenciación de las células neuroprogenitoras humanos auto-renovación y un método para aislar una población pura de las neuronas mediante láser captura microdissection. Hemos utilizado una combinación de NGF, BDNF, DBC y el ácido retinoico para la diferenciación neuronal de NPCs. DBC se utiliza para activar CREB, un factor de transcripción que mejora la neurogénesis 12. El ácido retinoico induce la salida del ciclo celular y ...

Neurogénesis largo de la vida se sabe que se producen en la zona subventricular de los ventrículos laterales y en la capa de subgranular del giro dentado del cerebro adulto de mamíferos 1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originan en estas regiones son células pluripotentes que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos 2. NPC han generado interés debido a su potencial para ser trasplantadas en pacientes con diversos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, accidente cerebrovascular y enfermedad de Alzheimer (EA) 3. Los estudios con NPCs han centrado generalmente en este ángulo el trasplante, pero el potencial de las neuronas derivadas de la APN como un modelo de cultivo celular para determinar el mecanismo de neurodegeneración no se ha explotado plenamente. Estudios previos han utilizado generalmente las neuronas post-mitóticas aisladas de tejidos cerebrales de roedores que necesitan ser aislados para cada experimento, ya que no sonauto-renovación. Aunque las líneas celulares de neuroblastoma humano incluyendo las células SK-N-MC SH-SY5Y y se pueden ampliar, que no tienen las características de las neuronas primarias. NPC Humanos, por otro lado, ofrecen tanto ventajas porque pueden ser expandido para múltiples pasajes y se pueden diferenciar para generar una población de células con las características de las neuronas primarias de 4,5. En el presente estudio, se describe un nuevo protocolo de diferenciación para obtener una población de neuronas ricas consistente de NPCs disponibles comercialmente aisladas de cerebro fetal humano. Debido a que estos cultivos contienen un pequeño porcentaje de las células gliales, que necesitamos métodos adicionales para aislar una población pura de las neuronas para la caracterización molecular. Microdisección de captura por láser (LCM) es una nueva técnica por la que una población homogénea de células de una sección de tejido puede ser capturado de forma selectiva para el análisis de la expresión génica 6. El cerebro es un tejido heterogéneo que consta de neuronas, glía y otras células Types. LCM se ha utilizado para determinar la expresión génica específica de las neuronas análisis 7-10. Hemos realizado anteriormente mcm de las neuronas del hipocampo de AD (Tg2576) secciones de cerebro de ratón para mostrar disminución de la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a AMP cíclico (CREB) y BDNF específicamente en las neuronas del hipocampo 11. En el presente estudio, se describe los procedimientos para la expansión de los NPCs humanos, la diferenciación neuronal, la tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales y LCM para el aislamiento de las neuronas cultivadas en portaobjetos de membrana PEN.

<table><tbody><tr><td>Células neuroprogenitoras (NPCs) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A medio basal humano</td><td>Tecnología de células madre</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Suplemento de proliferación</td><td>Tecnología de células madre</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Suplemento de diferenciación</td><td>Tecnología de células madre</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano</td><td>Tecnología de células madre</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro </td><td>Señalización celular</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento nervioso </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutiril cíclico AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de ratón </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo STAT3</td><td>Señalización celular</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFAP</td><td>Señalización celular</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GAP43</td><td>Laboratorios de transducción</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo BDNF</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo acetilcolinesterasa </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo sinaptofisina</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo NeuN</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo sinapsina</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratorios</td><td></td><td></td>de Investigación</tr><tr><td>Anti Conejo Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratorios de Investigación</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (cubreobjetos circulares grandes)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje (Prolong Gold)</td>Membrana de pluma <td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosystems aplicados</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de sección congelada Histogene LCM</td><td>Biosystems aplicados KIT0401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp Kit de amplificación de ARN</td><td>Biosystems aplicados</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN Picopure</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro Tapas LCM</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Células neuroprogenitoras (NPC) aislados a partir de cerebro fetal humano se ampliaron en condiciones proliferativas en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para proporcionar un suministro abundante de células. NPC fueron diferenciadas en la presencia de una nueva combinación de factor de crecimiento nervioso (NGF), derivado del cerebro factor neurotrófico (BDNF), dbAMPc (DBC) y ácido retinoico en platos recubiertos con poli-L-lisina y laminina de ratón para obtener neurona ricas culturas. NPC también se diferenciaron en ausencia de las neurotrofinas, DBC y ácido retinoico y en presencia de factor neurotrófico ciliar (CNTF) para producir cultivos de astrocitos-rica. NPC diferenciadas se caracterizan por la tinción de inmunofluorescencia para un panel de marcadores neuronales incluyendo NeuN, sinapsina, la acetilcolinesterasa, sinaptofisina y GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y STAT3, marcadores de astrocitos, se detectaron en el 10-15% de los NPCs diferenciadas. Para facilitartipo de célula caracterización molecular específica, se realizó la captura de microdisección láser para aislar las neuronas cultivadas en polietilennaftalato (PEN) se desliza de membrana. Los métodos descritos en este estudio proporcionan valiosas herramientas para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la neurodegeneración.

Expansión de NPCs (Figura 1) Cuando neuroesferas se descomponen a una única suspensión de células por trituración, la punta de la pipeta tiene que tocar la parte inferior del tubo de modo que haya algo de resistencia cuando la suspensión se pipetea arriba y abajo. El número de veces de la trituración varía entre los individuos y debe ser decidido por ensayo y error mediante el examen de la suspensión celular resultante con un microscopio. Es crítico para proporcionar suficiente...

Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un modelo de cultivo neuronal humano, identificar marcadores neuronales y aislar una población pura de neuronas para el análisis de expresión génica. Esto se logra primero expandiendo células progenitoras neurales humanas para crear un suministro continuo de células progenitoras. Como segundo paso, las células progenitoras neurales se cultivan en presencia de suplementos de diferenciación y factores neurotróficos de crecimiento en placas recubiertas con factores de adhesión. A continuación, se realiza una tinción inmunofluorescente para marcadores neuronales con el fin de determinar el destino de las células progenitoras neurales diferenciadas. Finalmente, se lleva a cabo la microdisección láser por captura de neuronas cultivadas en portaobjetos con membrana PEN para facilitar el análisis de la expresión génica específica de neuronas. Se obtienen resultados que muestran que las células progenitoras neurales diferenciadas son predominantemente de naturaleza neuronal.Basado en la tinción por inmunofluorescencia y captura de neuronas. Mediante microdisección láser, las células progenitoras neuronales humanas pueden amplifica

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Este video describe la manipulación de cultivos de neuronas con pinzas láser in vitro.

Utilizando pinzas láser para manipular neuronas aisladas in vitro

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Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Fuente: Palma-Tortosa, S., et.al. Cultivos organotípicos de corteza humana adulta como modelo ex vivo para el trasplante y validación de células madre humanas. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el trasplante de células progenitoras neuronales derivadas de células madre en cortes de tejido cortical humano. El procedimiento consiste en aislar y resuspender las células progenitoras en una matriz de membrana basal, seguido de su inyección en un corte cortical colocado en un conjunto de...

Trasplante de progenitores neuronales derivados de células madre en cortes corticales humanos

Este video muestra un método para diferenciar células progenitoras neuronales humanas (NPCs) en neuronas. Las NPC se introducen en un cocultivo establecido de neuronas corticales de astrocitos de ratón y rata, lo que promueve la diferenciación de las NPC en neuronas. La diferenciación se confirma mediante la visualización de las células bajo un microscopio confocal.

Una técnica de cocultivo para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas

Este video describe un método para preparar cubreobjetos de vidrio recubiertos con poliornitina y laminina para mejorar la adhesión y el crecimiento de las células madre neurales. La técnica implica incubaciones y lavados secuenciales, lo que facilita la formación de una matriz de soporte que promueve el crecimiento y la diferenciación de las células neuronales, imitando las estructuras que se encuentran en las neuronas.

Generación de neuronas piramidales corticales a partir de células madre neurales humanas

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

El aislamiento de las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral con inmunohistoquímica directa o indirecta se demuestra utilizando láser captura microdissection. Se discuten los parámetros para el aislamiento de tejido de un portaobjetos de vidrio usando un láser de infrarrojos y a partir de diapositivas membrana utilizando la combinación de un láser infrarrojo y ultravioleta.

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Este protocolo demuestra el uso de chips microfluídicos compartimentados, moldeados por inyección en un copolímero de olefina cíclico a neuronas cultivadas diferenciadas de las células madre humanas. Estos chips son premontados y más fáciles de usar que los dispositivos tradicionales de poli(dimetilsiloxano) compartimentados. Aquí se describen múltiples paradigmas experimentales comunes, como el etiquetado viral, el aislamiento fluido, la axotomía y la inmunomancha.

Compartmentalización de las neuronas derivadas de células madre humanas dentro de chips microfluídicos plásticos preensamblados

Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Aprende microdisección por láser de neuronas diferenciadas a partir de neuroprogenitoras humanas en cultivo. Este método permite aislar poblaciones puras de neuronas para análisis de expresión génica en estudios de neurociencia.

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

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