Name: Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a caracterizar interacciones entre aptámeros de ADN y moléculas pequeñas mediante MicroScale Thermophoresis. Este método cuantifica afinidad y estoquimetría independientemente del tamaño molecular.

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1. Preparación del aptámero de Trabajo de la <ol><li> Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia 18) en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM. </li><li> Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM, Tween 20 al 0,01%). </li><li> Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación de la serie de diluciones de ligandos <ol><li> Para cada ligando (adenosina trifosfato (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), y S-adenosil metionina (SAM) ; 10 mM cada uno), preparar una diluti serie de 16 pasosen en 200 l tubos de reacción Micro. NOTA: La centrifugación de las poblaciones de ligando durante 5 min a 14.000 xg puede ayudar a eliminar los agregados. Bajo volumen, se recomienda a los tubos de reacción de unión bajas para evitar la adsorción de moléculas a las paredes del tubo. </li><li> Comienza con una concentración máxima de al menos 50 veces mayor que la afinidad estimada y reducir la concentración de ligando en un 50% en cada etapa de dilución. NOTA: La herramienta de búsqueda de concentración llevada a cabo en el software de control simula los datos de unión y ayuda a encontrar el rango de concentración adecuado para la serie de dilución. </li><li> Llenar 20 l de ligando de stock (10 mM) en el tubo 1. Añadir 10 l de tampón de unión de aptámeros en tubos de reacción micro 2-16. </li><li> Transferencia de 10 l de tubo 1 al tubo 2 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir 10 l al siguiente tubo y repetir esta dilución para los tubos restantes. </li><li> Descartar el exceso de 10 l del último tubo. B evitar cualquierUffer efectos de dilución. El tampón en el tubo 1 y en los tubos de 2-16 debe ser idéntica. </li></ol> 3. Preparación de la mezcla final de reacción <ol><li> Preparar las reacciones de unión individuales con un volumen de 20 l (10 l de solución de trabajo de aptámero + 10 l de la dilución ligando respectivo) para minimizar los errores de pipeteado. Un volumen de sólo 4 l es su fi ciente para llenar el capilar. </li><li> Añadir 10 l de la solución de trabajo 200 nM de aptámero a 10 l de cada dilución ligando y mezclar adecuadamente pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Se incuban las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y fi ll las muestras en tubos capilares estándar por inmersión de los capilares en la muestra. tiempos de incubación más largos pueden ser necesarios para algunas interacciones; sin embargo, 5 min es adecuada para la mayoría. Toca los capilares sólo en los lados, no en la parte media, donde se toma la medición óptica. </li><li> Colocar los capilares a la sabandeja de correo capilar e iniciar el dispositivo MST. </li></ol> 4. Puesta en marcha del dispositivo MST NOTA: El dispositivo ofrece dos paquetes de software pre-instalado, el &quot;software para la configuración técnica de las condiciones experimentales y el control &#39;&#39; análisis&quot; &#39;software para la interpretación de los datos producidos. <ol><li> Antes de colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST, inicie el software de control y ajuste la temperatura global deseada seleccionando &#39;&#39; permitir el control manual de temperatura &quot;en el &#39;&#39; control de la temperatura&quot; menú desplegable. Ajustar la temperatura a 25 ° C de esta manera. NOTA: Los instrumentos MST pueden ser de temperatura controlada 22 a 45 ° C. </li><li> Espere a que la temperatura alcance el nivel esperado y luego colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST. </li><li> Ajuste el canal de LED para &#39;&#39; roja &quot;para los colorantes Cy5 y ajustar la potencia de LED para obtener una fl uorescence señal de 300 a 1000 unidades de fluorescencia en el dispositivo MST con un sensor estándar. de energía del LED 25% se utiliza en este estudio. NOTA: Se recomienda a entre 6.000 y 18.000 unidades de fluorescencia para el MST con un sensor de alta sensibilidad. </li></ol> 5. capilar Scan <ol><li> Realizar un análisis capilar para comprobar aspectos diferentes de calidad de la muestra por la elección de la posición capilar sobre el software de &quot;control&quot; y hacer clic en &quot;iniciar la exploración de tope&quot; antes de iniciar la medición MST. </li><li> Inspeccionar el análisis capilar para la mejora de la fluorescencia / temple y efectos que se pegan (en forma de U o aplanado picos) en el software. NOTA: Más detalles sobre la detección y manejo de fluorescencia y se pegan efectos se pueden encontrar en la discusión. </li></ol> 6. Medición MST NOTA: Antes de iniciar la medición MST, asegúrese de excluir a pegarse efectos, el realce / efectos de temple, olos errores de pipeteo, y asegurar que la exploración capilar indica que la señal de fluorescencia es su fi ciente. Para más detalles, véase la discusión. <ol><li> Asignar las concentraciones de ligando de la serie de diluciones a la posición respectiva en el capilar software &#39;&#39; de control de &quot;Considere la etapa de dilución de la mezcla del aptámero y el ligando. (1: 1). </li><li> Introduce la mayor concentración de ligando (5 mM) durante capilar # 1, seleccione el tipo de dilución correcta (en este caso, 1: 1), haga clic en la concentración máxima, y ​​utilizar la función de arrastrar para asignar automáticamente las concentraciones restantes en los capilares # 2- dieciséis. La concentración más baja es de 152,6 nm. </li><li> Introduzca la concentración del aptámero fluorescente fl (aquí, 100 nM) en la sección respectiva del software de control. </li><li> Utilice la configuración predeterminada, que detectan la fluorescencia durante 5 segundos, el MST grabar durante 30 segundos, y registrar la fluorescencia de 5 segundos más después de la inactivación del láser t<html> o controlar la difusión posterior de las moléculas. </li><li> Ajustar la potencia del láser a 20% en la sección respectiva del software de control. NOTA: Para poder recibir la mejor relación señal-ruido y para evitar efectos no específicos, se recomienda una potencia de láser de 20-40%. En casos específicos, una mayor potencia del láser puede ser necesaria para obtener una buena separación de las moléculas no unidas y unidos. </li><li> Guarde el experimento después de seleccionar la carpeta de destino y comenzar la medición MST pulsando el botón &#39;&#39; Iniciar la medición MST &quot;. NOTA: El archivo .ntp se generará en la carpeta de destino. Con esta instalación, una medición tiene una duración de 10-15 minutos. </li><li> Repetir el procedimiento experimental al menos dos veces para una determinación más precisa del valor CE 50. NOTA: Con el fin de probar la reproducibilidad técnica, los mismos capilares se pueden escanear varias veces (repeticiones técnicas). </li></ol> 7. Análisis de datos MST nt &quot;&gt; NOTA: El software de análisis permite el análisis de los datos de la mosca durante la medición El software de análisis de traza las huellas del tiempo del MST y los cambios en la normalizado de fluorescencia (norma F) frente a la concentración de ligando 37.. <ol><li> Iniciar el software de análisis de MST (Análisis MO.Affinity) y cargar el archivo .ntp de la carpeta de destino. Seleccione &quot;MST&quot; como el tipo de análisis en el menú de selección de datos. NOTA: En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, la fluorescencia inicial se puede elegir para su análisis. </li><li> Añadir la respectiva carrera (s) técnica o biológica a un nuevo análisis de arrastrar y soltar o presionando el botón &quot;+&quot; por debajo de la respectiva prueba experimental. </li><li> Presione el botón de información por debajo de la respectiva prueba experimental para obtener información sobre las propiedades del experimento, los rastros del MST, escaneo capilar, forma capilar, fluorescencia inicial y la tasa de blanqueo. Nota: Estos datos en bruto puede colpor lo que ser inspeccionados en las etapas posteriores del análisis. </li><li> una inspección visual de los restos del MST para la agregación y precipitación efectos visibles, como golpes y picos. NOTA: Para obtener más información sobre la detección y manejo de los efectos de agregación, leer la discusión. </li><li> Inspeccione visualmente el análisis capilar y la superposición de forma capilar para efectos de adsorción, visible como picos aplanados o en forma de U. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la fluorescencia inicial para efectos de fluorescencia. una inspección visual de la tasa de blanqueo para efectos photobleaching. </li><li> Cambiar al modo dosis-respuesta y cambiar la configuración de análisis para el modo &quot;experto&quot; pulsando el botón correspondiente. Seleccionar &quot;T-Jump&quot;, como la estrategia de evaluación del MST. </li><li> Seleccione el modelo de &quot;Colina&quot; para la curva fi tting. se calculará automáticamente los parámetros de unión. Normalizar los datos mediante la elección del tipo respectivo de la normalización en el menú de &quot;comparación de resultados&quot;. exportar eldatos, ya sea como un archivo .xls o .pdf. NOTA: La tabla debajo del gráfico de unión se resumen los parámetros de unión calculados. </li></ol>

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Los controles de calidad: adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la configurac...

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de competición, y los experimentos de unión con múltiples parejas de unión 1-8. En general, MST permite el estudio de los parámetros de unión clásicos, tales como la afinidad de unión (pM ​​a mM), estequiometría, y la termodinámica, de cualquier tipo de interacción molecular. Una gran ventaja de MST es la capacidad para estudiar eventos de unión independientes del tamaño de las parejas de interacción. incluso chalinteracciones lenging entre pequeños aptámeros de ácido nucleico (15-30 nt) y objetivos tales como moléculas pequeñas, fármacos, antibióticos, o metabolitos pueden ser cuantificados. Las tecnologías actuales del estado de la técnica para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo son ya sea en laboratorio intensa y de gran complejidad o no se cuantifica aptámero-molécula pequeña Interacciones de 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) a base de ensayos colorimétricos 11,12 y enfoques verdaderamente libre de marca, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) 13-15, elución isocrática 16, el equilibrio filtración 17,18, el sondeo en línea 19, de gel cambiar ensayos, stopped- flujo espectroscopía de fluorescencia 20,21, anisotropía de fluorescencia (FA) 22,23, de una sola molécula de fluorescencia de imagen 24,25, y Bio-capa de interferometría (BLI) 26 también son bien imprecisa o incompatible con la molécula del aptámero microcítico interacciones. otros principal problemas de estos métodos son de baja sensibilidad, alto consumo de ejemplo, la inmovilización, las limitaciones de transporte de masa en las superficies, y / o restricciones de amortiguamiento. Sólo unas pocas de estas tecnologías proporcionan controles integrados para la agregación y adsorción efectos. MST representa una poderosa herramienta para los científicos para superar esta limitación para estudiar las interacciones entre los aptámeros y moléculas pequeñas 27-29, así como otros objetivos, tales como proteínas 30-33. La tecnología se basa en el movimiento de moléculas a través de gradientes de temperatura. Este movimiento dirigido, llamado &quot;termoforesis,&quot; depende del tamaño, la carga, y la capa de hidratación de la molécula 34,35. La unión de un ligando a la molécula alterará directamente al menos uno de estos parámetros, lo que resulta en una movilidad termoforético cambiado. Ligandos con tamaños pequeños pueden no tener un impacto considerable en términos de cambio de tamaño de la independiente al estado ligado, pero pueden tener dr<html> Amatic efectos sobre la capa de hidratación y / o carga. Los cambios en el movimiento termoforético de moléculas después de la interacción con la pareja de unión permite la cuantificación de los parámetros de unión básicas 2,7,34,36,37. Como se muestra en la Figura 1A, el dispositivo MST consta de un láser infrarrojo enfocado sobre la muestra dentro de los capilares de vidrio utilizando la misma óptica como para la detección de fluorescencia. El movimiento termoforético de las proteínas a través de la fluorescencia intrínseca de triptófanos 6 o de un 3,8 pareja de interacción marcado con fluorescencia se puede monitorizar mientras el láser se establece un gradiente de temperatura (? T de 2-6 ° C). La diferencia de temperatura resultante en el espacio,? T, conduce al agotamiento o la acumulación de moléculas en el área de temperatura elevada, que se puede cuantificar por el Soret coeficiente (S T): g &quot;/&gt; c caliente representa la concentración en la región calentada, y c es la concentración de frío en la región en frío inicial. Como se muestra en la Figura 1B, un típico experimento MST produce un perfil de movimiento MST (traza el tiempo), que consta de diferentes fases, que pueden separarse por sus respectivas escalas de tiempo. La fluorescencia inicial se mide en los primeros 5 s en ausencia del gradiente de temperatura para definir la fluorescencia a partir preciso y para comprobar si hay photobleaching o photoenhancement. El salto de temperatura (T-Jump) representa la fase en la que los cambios de fluorescencia antes del movimiento termoforético. Esta disminución inicial de la fluorescencia depende de cambios dependientes de calor de fluoróforo rendimiento cuántico. La fase termoforesis sigue, en el que se alcanza la disminución de fluorescencia (o aumenta) debido al movimiento de las moléculas termoforético hasta la distribución en el estado estacionario.El TJump inversa y retrodifusión concomitante de moléculas fluorescentes fl se pueden observar como se indica en la figura 1B después de que el láser está apagado. Con el fin de acceder a los parámetros básicos de unión, diferentes relaciones molares de los compañeros de interacción son analizados y comparados. Típicamente, 16 relaciones diferentes se estudian en un experimento MST, mientras que la molécula visible óptico se mantiene constante y se suministra con una cantidad creciente de ligando no marcado. La interacción entre las dos parejas de unión induce cambios en la termoforesis, y así en la fluorescencia normalizada, F norma, que se calcula de la siguiente manera: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F caliente y fría F representan un promedio de intensidades de fluorescencia en puntos de tiempo de fi nido de las huellas del MST. Las afinidades de unión (Kd o valores de EC50) se pueden calcular por curve apropiado (Figura 1C). En general, el MST es una poderosa herramienta para estudiar las interacciones moleculares de ningún tipo. Este manuscrito ofrece un protocolo para caracterizar la interacción entre el reto pequeña molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) y el 25-nt corto ssDNA aptámero DH25.42 (7,9 kDa). En el transcurso del manuscrito, el sitio de unión del aptámero en la molécula de ATP se mapea hasta el grupo adenina del ATP.

<table><tbody><tr><td>Tampón de unión a aptámeros</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20</td></tr><tr><td>Aptámero ATP marcado con fluorescencia</td><td>IDT, Lovaina, Bélgica</td><td></td><td>secuencia: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania&nbsp;</td><td>A2383</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & grados; C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania&nbsp;</td><td>A2754</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania &nbsp;</td><td>A2252</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Alemania &nbsp;</td><td>A8626</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Alemania&nbsp;</td><td>A7007</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM de soluciones madre almacenadas a - 20 & °C C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania &nbsp;</td><td>C1506</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Alemania &nbsp;</td><td>G8877</td><td>Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 &° </td></tr><tr><td>C Monolito NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania</td><td>MO-G008</td><td>Canal Azul/Rojo Dispositivo MST con detector estándar, Monolith NT115 pico es un dispositivo MST con detector de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Capilares Monolith NT.115 Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR Eppendorf</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Software de control Monolith. 2.1.33, preinstalado en el dispositivo</td><td>NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.análisis de afinidad v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapear el sitio de unión de un aptámero de atp utilizando microscale termoforesis

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

La caracterización de las interacciones moleculares en términos de parámetros básicos de unión como la afinidad de unión, la estequiometría y la termodinámica es un paso esencial en la ciencia básica y aplicada. La termoforesis a microescala (MST) es un método biofísico sensible para obtener esta importante información. Basándose en un efecto físico llamado termoforesis, que describe el movimiento de las moléculas a través de gradientes de temperatura, esta tecnología permite la determinación rápida y precisa de los parámetros de unión en solución y permite la libre elección de las condiciones del tampón (desde el tampón hasta los lisados/sueros). MST utiliza el hecho de que una molécula no unida muestra un movimiento termoforético diferente al de una molécula que está en complejo con un socio de unión. El movimiento termoforético se altera en el momento de la interacción molecular debido a cambios en el tamaño, la carga y la capa de hidratación. Al comparar los perfiles de movimiento de diferentes proporciones moleculares de los dos socios de unión, se puede determinar información cuantitativa como la afinidad de unión (pM a mM). Incluso las interacciones desafiantes entre moléculas de tamaños pequeños, como aptámeros y compuestos pequeños, pueden ser estudiadas por MST. Utilizando el modelo de interacción bien estudiado entre el aptámero de ADN DH25.42 y el ATP, este manuscrito proporciona un protocolo para caracterizar las interacciones entre el aptámero y las moléculas pequeñas. Este estudio demuestra que MST es altamente sensible y permite el mapeo del sitio de unión del aptámero de ADN de 7,9 kDa a la adenina del ATP.

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 18 en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos 38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 &#39; . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, todas diferen...

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar las interacciones entre aptámeros de ADN y moléculas pequeñas, incluyendo la localización del sitio de unión, mediante termoforesis a escala microscópica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los parámetros básicos de unión de las interacciones moleculares. La principal ventaja de esta tecnología es que es independiente del tamaño del socio de interacción, lo que permite obtener datos de control de calidad de interacciones difíciles entre aptámeros y moléculas pequeñas.Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre aptámeros y moléculas pequeñas, también puede aplicarse a otras interacciones moleculares, como interacciones fármaco-diana o antígeno/anticuerpo. Para comenzar el procedimiento, prepare una solución stock de 100 micromolar del aptámero de ADN DH25.42 marcado con Cy5 en agua destilada. Luego, diluya la solución stock del aptámero a 200 nanomolar con tampón de unión.Incube la solución de trabajo del aptámero durante dos minutos a 90 grados Celsius. Enfríe la solución hasta temperatura ambiente sobre hielo. A continuación, etiquete y prepare tubos microcentrífugos de baja unión de 200 microlitros para una dilución seriada de 16 pasos del ligando que se va a probar.Aspire 20 microlitros de una solución stock de 10 milimolar del ligando y tampón de unión en el tubo 1. Aspire 10 microlitros de tampón de unión en los tubos del 2 al 16. Luego transfiera 10 microlitros de la solución stock del ligando del tubo 1 al tubo 2 y mezcle bien con la pipeta.Transfiera 10 microlitros de la mezcla diluida al tubo 3 y mezcle bien. Continúe la dilución en serie de esta manera, corrigiendo los efectos de dilución del tampón si es necesario, y deseche los 10 microlitros en exceso del tubo 16 al finalizar. Añada 10 microlitros de la solución de trabajo del aptámero a cada dilución y mezcle bien con la pipeta.Incube las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire cada mezcla en un capilar estándar limpio, asegurándose de tocar el capilar únicamente en los extremos. Coloque los capilares en el portamuestras en orden descendente de concentración.Inicie el dispositivo de MST y abra el software de control del instrumento. Habilite el control de temperatura manual y ajuste la temperatura del instrumento a 25 grados Celsius. Una vez que el instrumento alcance la temperatura correcta, inserte la bandeja de capilares.Configure el canal LED en rojo para el aptámero marcado con Cy5. Ajuste la potencia del LED para obtener una señal de fluorescencia de 500 unidades. Luego, realice un escaneo capilar para obtener las posiciones capilares y verificar la calidad de la muestra.Si los picos resultantes tienen forma de U o están aplanados, prepare nuevas muestras en capilares codificados para minimizar los efectos de adherencia. En el software del instrumento de MST, complete la concentración del ligando y el tipo de dilución para el primer capilar. Haga clic y arrastre para completar las concentraciones y diluciones de los capilares restantes.Introduzca la concentración del aptámero en la mezcla final. Asegúrese de que el método del experimento esté configurado para detectar la fluorescencia durante cinco segundos, registrar la MST durante 30 segundos y luego registrar la fluorescencia durante cinco segundos después de apagar el láser. Establezca la potencia del láser al 20 %. Establezca la ruta del archivo y guarde el archivo del experimento.Luego inicie la medición de MST. Obtenga al menos tres mediciones de esta manera. Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis de MST y cargue el archivo del experimento.Seleccione MST como tipo de análisis. El software de análisis permite comparar repeticiones técnicas en las que todas las mediciones se realizaron en el mismo conjunto de capilares. También pueden agregarse al análisis repeticiones biológicas provenientes de un conjunto diferente de capilares.Haga clic en el botón de información debajo de la primera medición. Inspeccione las trazas de MST en busca de irregularidades o picos que indiquen efectos de agregación o precipitación. A continuación, revise el escaneo del capilar y la superposición de la forma del capilar en busca de picos aplanados o en forma de U que indiquen efectos de adherencia o absorción.Dado que los efectos de agregación y absorción son rápidamente detectables en MST, el método permite una optimización rápida y eficiente del montaje técnico para garantizar una calidad óptima de los datos. Verifique los efectos de atenuación o aumento de la fluorescencia dependientes del ligando en el análisis del capilar y en la fluorescencia inicial. Inspeccione el cambio de fluorescencia a lo largo del tiempo en busca de signos de fotodescomposición o fotoaumento.Una vez que se haya verificado la calidad de los datos, cambie al modo de respuesta a la dosis. Seleccione la configuración de análisis experto en la estrategia de evaluación de MST con salto térmico (T Jump). Luego, seleccione el modelo de Hill para el ajuste de curva y calcular automáticamente los parámetros de unión.En el menú de comparación de resultados, seleccione un tipo de normalización. Exporte los datos normalizados como una hoja de cálculo o un archivo PDF. En este procedimiento, se utilizó la MST para investigar las interacciones de unión de un aptámero de ADN de cadena sencilla con una selección de ligandos de moléculas pequeñas.Las curvas de MST se ajustaron con la ecuación de Hill y se determinaron los valores de concentración efectiva media máxima. En cinco mediciones biológicas independientes repetidas del aptamero con ATP, la interacción entre el aptamero y el ATP mostró una amplitud de unión negativa de 6 a 13 unidades y un valor promedio de EC50 de aproximadamente 52,3 micromolar. Los datos de cada ligando se normalizaron a la fracción de moléculas unidas y luego se compararon.Los valores de CE50 para ADP, AMP y SAM en comparación con ATP sugieren que el número de grupos fosfato tiene como máximo una influencia menor sobre el comportamiento de unión del aptamero. La eliminación del grupo hidroxilo en C2 de ribosa también mostró solo un efecto menor sobre la afinidad de unión del aptamero. El aptamero no se unió en ausencia de un grupo de emparejamiento o si el grupo de emparejamiento se cambió a guanina.El aptámero sí se unió a la adenina sola, lo que indica además que el grupo de adenina es el sitio principal de unión para el aptámero. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar información esencial sobre los parámetros básicos de unión en minutos a horas si se realiza adecuadamente.

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Investigación

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Bioquímica

SELEX protocolos comprenden múltiples rondas de selección, cada uno de los cuales requieren la regeneración de ligandos unidos, que a su vez requieren secuencias fijas de imprimación que flanquean las regiones de la biblioteca al azar. Estas secuencias de los cebadores fija puede interferir con el proceso de selección (falsos positivos y negativos). Aquí presentamos una cartilla sin protocolo.

Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

Este video muestra la termoforesis a microescala para estudiar la interacción proteína-lípido. El ensayo detecta la interacción entre moléculas cuantificando el movimiento termoforético de las proteínas marcadas con fluorescencia en respuesta a un gradiente de temperatura. La molécula fluorescente se mezcla con diferentes concentraciones de moléculas lipídicas no fluorescentes, y la mezcla de moléculas en la solución se carga en capilares. Se aplica un gradiente de temperatura a las muestras en...

Termoforesis a microescala para estudiar las interacciones proteína-lípidos en solución

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Se proporciona un protocolo para seleccionar aptámeros de conmutación de estructura para objetivos de moléculas pequeñas basado en un método de selección de perlas magnéticas de rigurosidad sintonizable. Los aptámeros seleccionados con propiedades de cambio de estructura son beneficiosos para los ensayos que requieren un cambio conformacional para señalar la presencia de un objetivo, como el ensayo de nanopartículas de oro descrito.

Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

Se presenta un protocolo para la selección en vitro y caracterización del ácido ftálico de grupo específico éster enlace DNA aptámeros. También se incluye la aplicación de los aptámeros seleccionados en un aptasensor electroquímico.

Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico

La termoforesis a microescala obtiene constantes de unión rápidamente a bajo costo de material. La termoforesis a microescala etiquetada o sin etiqueta está disponible comercialmente; sin embargo, la termoforesis sin etiquetas no es capaz de la diversidad de mediciones de interacción que se pueden realizar utilizando etiquetas fluorescentes. Proporcionamos un protocolo para mediciones de termoforesis etiquetadas.

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Este protocolo describe el diseño de sondas de hibridación dividida que utilizan el aptámero de luz fluorescente DAP-10-42 como reportero de señal y su aplicación para la detección y diferenciación de ácidos nucleicos entre objetivos con sustituciones de un solo nucleótido.

Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

Aprende a caracterizar interacciones entre aptámeros de ADN y moléculas pequeñas mediante MicroScale Thermophoresis. Este método cuantifica afinidad y estoquimetría independientemente del tamaño molecular.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

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