Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

El objetivo general de este experimento es caracterizar las interacciones entre moléculas pequeñas y aptámeros de ADN, incluido el mapeo de sitios de unión, utilizando termoforesis a microescala. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los parámetros básicos de unión de las interacciones moleculares. La principal ventaja de esta tecnología es que es independiente del tamaño del socio de interacción, lo que permite obtener datos de control de calidad de interacciones desafiantes entre aptámeros y moléculas pequeñas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre las moléculas pequeñas de aptámeros, también se puede aplicar a otras interacciones moleculares, como las interacciones fármaco-diana o antígeno/anticuerpo. Para comenzar el procedimiento, prepare una solución madre de 100 micromolares del aptámero DH25.42 de ADN marcado con Cy5 en agua destilada. A continuación, diluya la solución madre de aptámero a 200 nanomolares con tampón aglutinante.

Incubar la solución de trabajo del aptámero durante dos minutos a 90 grados centígrados. Enfríe la solución a temperatura ambiente sobre hielo. A continuación, etiquete y coloque tubos de microcentrífuga de 200 microlitros de baja unión para una dilución en serie de 16 pasos del ligando que se va a probar.

Pipetear 20 microlitros de una solución madre de 10 milimolares de ligando y tampón de unión en el tubo 1. Pipetee 10 microlitros de tampón aglutinante en los tubos 2 a 16. A continuación, transfiera 10 microlitros de material de ligando del tubo 1 al tubo 2 y mezcle bien con la pipeta.

Transfiera 10 microlitros de la mezcla diluida al tubo 3 y mezcle bien. Continúe la dilución en serie de esta manera, corrigiendo los efectos de dilución del tampón si es necesario, y deseche los 10 microlitros adicionales del tubo 16 cuando termine. Añadir 10 microlitros de la solución de trabajo del aptámero a cada dilución y mezclar bien con la pipeta.

Incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, introduzca cada mezcla en un capilar estándar limpio, asegurándose de tocar sólo el capilar en los extremos. Coloque los capilares en el soporte de la bandeja en orden descendente de concentración.

Encienda el dispositivo MST y abra el software de control de instrumentos. Habilite el control manual de temperatura y ajuste la temperatura del instrumento a 25 grados centígrados. Una vez que el instrumento esté a la temperatura correcta, inserte la bandeja capilar.

Ajuste el canal LED a rojo para el aptámero etiquetado como Cy5. Configure la potencia del LED para alcanzar una señal de fluorescencia de 500 unidades. A continuación, realice un escaneo capilar para obtener las posiciones capilares y comprobar la calidad de la muestra.

Si los picos resultantes tienen forma de U o están aplanados, prepare las nuevas muestras en capilares codificados para minimizar los efectos de adherencia. En el software del instrumento MST, rellene la concentración de ligando y el tipo de dilución para el primer capilar. Haga clic y arrastre para rellenar las concentraciones y diluciones de los capilares restantes.

Introduzca la concentración del aptámero en la mezcla final. Asegúrese de que el método de experimento esté configurado para detectar la fluorescencia durante cinco segundos, registrar el MST durante 30 segundos y, a continuación, registrar la fluorescencia durante cinco segundos después de apagar el láser. Establezca la potencia del láser en 20%Establezca la ruta del archivo y guarde el archivo del experimento.

A continuación, inicie la medición del MST. Obtenga al menos tres mediciones de esta manera. Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis MST y cargue el archivo del experimento.

Seleccione MST para el tipo de análisis. El software de análisis permite comparar repeticiones técnicas en las que todas las mediciones fueron del mismo conjunto de capilares. También se pueden agregar al análisis repeticiones biológicas de un conjunto diferente de capilares.

Haga clic en el botón de información debajo de la primera medición. Inspeccione las trazas de MST en busca de protuberancias o picos que indiquen efectos de agregación o precipitación. A continuación, inspeccione el escaneo capilar y la superposición de la forma capilar en busca de picos aplanados o en forma de U que indiquen efectos de adherencia o absorción.

Dado que los agregados y los efectos de absorción son rápidamente detectables en MST, el método permite una optimización rápida y rápida de la configuración técnica para garantizar una calidad óptima de los datos. Compruebe los efectos de extinción o mejora de la fluorescencia dependientes del ligando en la exploración capilar y la fluorescencia inicial. Inspeccione el cambio de fluorescencia a lo largo del tiempo en busca de signos de fotoblanqueo o mejora fotográfica.

Una vez verificada la calidad de los datos, cambie al modo de respuesta a la dosis. Seleccione la configuración de análisis experto en la estrategia de evaluación T Jump MST. A continuación, seleccione el modelo de colina para el ajuste de curvas para calcular automáticamente los parámetros de fijación.

En el menú comparar resultados, seleccione un tipo de normalización. Exporte los datos normalizados como una hoja de cálculo o un archivo PDF. En este procedimiento, se utilizó MST para investigar las interacciones de unión de un aptámero de ADN de una sola cadena con una selección de ligandos de moléculas pequeñas.

Las curvas MST se ajustaron a la ecuación de Hill y se determinaron los valores de concentración efectiva máxima media. En cinco mediciones biológicas repetidas independientes del aptámero con ATP, la interacción del aptámero ATP mostró una amplitud de unión negativa de 6 a 13 unidades, y un valor promedio de EC50 de aproximadamente 52,3 micromolares. Los datos de cada ligando se normalizaron a la fracción de moléculas unidas y luego se compararon.

Los valores de EC50 para ADP, AMP y SAM en comparación con ATP sugieren que el número de grupos fosfato tiene, a lo sumo, una influencia menor en el comportamiento de unión del aptámero. La eliminación del grupo hidroxal robo C2 también mostró solo un efecto menor en la afinidad de unión del aptámero. El aptámero no se unió en ausencia de un grupo de emparejamiento o si el grupo de emparejamiento se cambió a guanina.

El aptámero se unió solo a la adenina, lo que indica aún más que el grupo adenina es el principal sitio de unión para el aptámero. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar información esencial sobre los parámetros básicos de enlace en minutos u horas si se realiza correctamente.