Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

El objetivo general de este procedimiento es estimar la constante de disociación para la interacción de un ligando de proteína. Esto se logra preparando primero mezclas de la proteína con diferentes concentraciones del ligando junto con un colorante indicador. El segundo paso es calentar estas muestras mientras se registra la fluorescencia del indicador para monitorear el despliegue de la proteína.

A continuación, las curvas de despliegue de la proteína se convierten en una serie de temperaturas de fusión. El paso final es ajustar estos datos a un modelo apropiado para estimar la constante de disociación. En última instancia, la fluorometría diferencial de barrido se utiliza para comprender mejor la interacción de una proteína con sus ligandos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la isotermia, la valoración, la calorimetría y la resonancia plasmática de superficie es que este método se puede completar en unas pocas horas utilizando solo cantidades moderadas de muestra en un instrumento que ya está disponible en la mayoría de los institutos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la química de proteínas, como la afinidad de los ligandos por las proteínas y la fuerza relativa de las interacciones. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque la elección de las muestras a utilizar y el análisis de los datos pueden ser difíciles.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare las siguientes soluciones. Una mezcla que contiene los reactivos detallados en esta tabla y las existencias del ligando de interés a la concentración más alta disponible, así como diluciones seis veces diez de esta concentración. Si se conoce una constante de disociación aproximada a partir de datos anteriores, prepare al menos dos concentraciones por encima y por debajo de kd.

Aquí se muestra una tabla de ejemplo. Alícuota 18 microlitros de la mezcla en cada uno de los ocho pocillos. En la placa A-Q-P-C-R, agregue dos microlitros de solvente al primer pocillo a cada uno de los siete pocillos restantes, agregue dos microlitros de cada miembro de la serie de dilución del ligando.

Coloque el sello A-Q-P-C-R sobre la placa para lograr un buen sellado de la placa. Coloque un aplicador manual en el centro del plato, alise el sello hacia un lado y luego repita en la otra mitad del plato. Centrifugar la placa a 500 veces G durante dos minutos para eliminar las burbujas de aire.

A continuación, coloque la placa en un instrumento QPCR de paso uno. Seleccione la opción de curva de fusión que filtra las rocas y elija la velocidad de rampa rápida. Ejecute una desnaturalización térmica al final de la ejecución del instrumento.

Haga clic en el botón analizar en la pantalla. Guarde el archivo de resultados. Abra el software de cambio térmico de proteínas.

Cree un nuevo estudio en la pestaña de propiedades, asígnele un nombre y, en la pestaña de condiciones, detalle los ligandos. Vaya a la pestaña Archivos del experimento e importe el archivo de resultados guardado.

Establezca el contenido de cada uno. Bueno, vaya a la pestaña de análisis y presione el botón analizar para analizar los resultados. Compruebe que la proteína, en presencia de disolvente por sí sola, da un resultado similar al que se muestra en esta figura.

A continuación, examine las temperaturas de fusión observadas en los resultados en el dolor replicado. Asegúrese de que esto muestre un claro aumento en la temperatura de fusión con el aumento de la concentración de ligando. Estos datos se utilizarán para proporcionar un valor aproximado de la constante de disociación, tal como se describe en el documento adjunto.

Estas soluciones son necesarias para el procedimiento de determinación de la constante de disociación, la mezcla maestra A como se detalla en esta tabla y las existencias del ligando a 15 concentraciones diferentes, que se diluirán diez veces. En el experimento final. Lo ideal es incluir las concentraciones de ligandos, al menos dos órdenes de magnitud por encima y por debajo del kd estimado, y centrar las concentraciones en el kd estimado.

Aquí se muestra un ejemplo de serie de dilución. Concéntrese en siete de los puntos dentro de un orden de magnitud del KD estimado con otros cuatro puntos a cada lado de este. Si hay una opción, incluya más puntos en los valores que están saturados.

Agregue 120 microlitros de la mezcla maestra a cada uno de los ocho pocillos en una placa de 96 pocillos con fondo en U para que actúe como depósito para una dispensación conveniente de la mezcla maestra. A continuación, utilice una pipeta de ocho canales para dispensar 18 microlitros de la mezcla maestra en una columna de una placa de PCR. Repita por otras cinco columnas para dar un total de 48 pozos llenos en un patrón de seis por ocho en la placa.

A continuación, añada 20 microlitros de los tallos de ligando o del disolvente a cada uno de los ocho pocillos. En otra placa de 96 pocillos con fondo en U Utilizando una pipeta de ocho canales, aspire dos microlitros de ocho materiales de ligandos o disolventes diferentes, y agréguelos a una columna de la placa de PCR que se llenó con la mezcla maestra. Repita con los mismos ocho lindos o solventes.

Para dos columnas más, aspire dos microlitros de las ocho cepas de ligando o disolvente restantes y agréguelas a una cuarta columna en la placa. Repita esto para otras dos columnas. Esto dará muestras triplicadas para las 16 muestras de ligando y solvente.

Coloque el sello A-Q-P-C-R sobre la placa. Centrifugar la placa a 500 veces G durante dos minutos. Coloque la placa en el instrumento QPCR y ejecute una desnaturalización térmica utilizando los parámetros especificados anteriormente al final de la ejecución del instrumento.

Haga clic en el botón analizar en la pantalla. Guarde el archivo de resultados. Abra el software de cambio térmico de proteínas.

Cree un nuevo estudio en la pestaña de propiedades, asígnele un nombre y en la pestaña de condiciones, detalle los ligandos. Vaya a la pestaña de archivos de experimento, importe el archivo de resultados guardado y establezca el contenido de cada uno.

Bueno, vaya a la pestaña de análisis y presione el botón analizar. Elija la pestaña réplicas en el menú del lado izquierdo de la pantalla para mostrar los resultados. Por triplicado.

Evalúe la fiabilidad de los datos en función de lo ajustados que sean los triplicados. En caso de que los triplicados muestren poca reproducibilidad. Examine los datos brutos de cerca.

Analice los datos utilizando tanto el método boltman como el método derivado. Para evaluar la temperatura de fusión, seleccione la pestaña de resultados de replicación y, en la gráfica de resultados replicados, alterne la gráfica por botón entre tm, boltzmann y derivado TM. Seleccione el método que proporcione la mayor reproducibilidad de la muestra.

Para las muestras que muestran múltiples transiciones, casi siempre es mejor usar el método derivado en el modo de fusión múltiple. Exporte los resultados para una investigación más detallada con Excel utilizando la pestaña de exportación. Comience este análisis creando una tabla en Excel de las concentraciones de ligando y la temperatura de fusión.

Abra el software de prisma GraphPad y cree una tabla XY. Introduzca los datos utilizando la columna X para las concentraciones de ligando y la columna Y para los resultados de la temperatura de fusión. En la pestaña análisis, seleccione la opción de ajuste de curva de regresión no lineal.

Para introducir el modelo correcto, seleccione nuevo y cree una nueva ecuación. Inserte la ecuación apropiada como unión de ligando de un solo sitio. Seleccione el cuadro reglas para los valores iniciales y escriba las reglas para los valores iniciales.

Restrinja el parámetro P como constante igual para ingresar a la concentración final de proteína. Seleccione analizar para realizar el análisis, análisis adicional para ajustar los datos a un modelo cooperativo o para ajustar los datos a las curvas. Los cambios binarios en la temperatura de fusión se describen en el texto del protocolo adjunto.

Este método se utilizó para medir la interacción de la hexoquinasa con la glucosa. Un cribado inicial sugiere una probable KD de 0,2 a 1,7 milimolares. Los resultados de una pantalla más grande muestran un buen ajuste al modelo para un solo evento de unión con un KD de 1,2 más o menos 0,1 milimolar, el putativo HETO SQUA L transferasa WCBM muestra un fuerte cambio térmico en la unión a GTP.

Un examen inicial sugirió una KD de 200 a 500 micromolares. Un experimento detallado sugiere un KD aparente de 120 más o menos 20 micromolares. Sin embargo, cuando se utiliza una escala logarítmica para el eje X, existe una discrepancia significativa entre el modelo y el análisis de datos de los mismos datos con un modelo cooperativo muestra un excelente ajuste a los datos, lo que implica que WCBM es anticooperativo en su unión a GTPA se observa un resultado bastante inusual con el PIB putativo 60, oxy Beta D mano, Heur two oh, ACE WCBI.

Sin ligando, y a altas concentraciones de ligando, se observa un patrón de fusión monofásico simple. Sin embargo, a concentraciones intermedias de ligando, se observan dos picos de fusión distintos. La transición entre los dos conjuntos de picos depende de la dosis en todo el rango de concentraciones que modelan la fusión bifásica.

Como suma de una proporción del ligando, los resultados libres y altos de ligando dan un buen ajuste a los datos. Este ajuste se mejora extrapolando el resultado observado para una alta concentración de ligando a la ocupación completa. Los datos obtenidos para la proporción de WCBI unido al ligando muestran un excelente ajuste a un modelo de unión simple.

Con un KD de 58 más o menos dos micromolares una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco horas, incluyendo repeticiones si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la fluorescencia de la vena superior y la calorimetría de titulación isotérmica, para responder a preguntas adicionales como la dependencia de la temperatura y la geometría STA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar una estimación de la constante de disociación de una interacción utilizando la gripe de barrido diferencial.