Name: Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprende a visualizar marcadores de microglía/macrófagos en isquemia cerebral mediante inmunofluorescencia e imagen confocal tridimensional en ratón. Este método mejora la resolución espacial y permite asignar correctamente la expresión de marcadores a compartimentos celulares específicos.

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Stefano Fumagalli es miembro de la Fundación Monzino.

1. Inmunofluorescencia El siguiente protocolo se realiza en secciones criogénicas cerebrales coronales obtenidas de ratones perfundidos transcardialmente (20 ml de PBS, 0,1 moles / litro, pH 7,4, seguido de 50 ml de paraformaldehído al 4% enfriado en PBS). Después de la perfusión, los cerebros se retiran y se transfieren a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante la noche para crioprotección cuidadosamente. Los cerebros se congelan rápidamente por inmersión en isopentano a - 45 ° C durante 3 min antes de ser sellado en viales y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso. Criosecciones cerebrales coronales (20 m) se cortan en serie y se sometieron a protocolo de inmunofluorescencia 11, 6. Llevar todos reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de su uso. Por favor, tenga en cuenta que los presentados diluciones de trabajo de anticuerpos en suero y el resultado de las pruebas realizadas con el fin de obtener el mejor rendimiento. Cuando se utilizan diferentes anticuerpos y el suero, el protocolo debe ser validado. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota que debido a anticuerpos primarios tanto anti-CD11b y anti-CD68 se hacen, en la rata, para evitar la señal de cruce por anti-rata Alexa 546, se utilizó una alta dilución de anticuerpos anti-CD11b seguido de amplificación de la señal fluorescente con kit TSA (Cy5 tiramida). Hemos puesto en marcha la dilución de trabajo óptima para el anti-CD11b realizando el protocolo descrito excepto el paso 1.17 y el uso de por lo menos 7 diferentes diluciones de anti-CD11b como se informa en la Tabla 1. Como resultado, 1:30.000 ha sido elegido ser el único dilución lograr: 1) la señal visible con Cy5 a una excitación de longitud de onda 646 nm; 2) no hay señal con Alexa 546 en la longitud de onda de excitación de 532 nm. De esta manera, Alexa 546 señal fluorescente se asocia selectivamente con la expresión de CD68. Las diluciones óptimas para los anticuerpos anti-CD68 anti-CD11b y pueden variar dependiendo del tipo de tejido y debe ser definido antes de iniciar el protocolo de co-etiquetado. <ol><li> Lave cryosections cerebro dos veces con PBS. </li><li> Encryosections Cubate durante 5 minutos en PBS que contenía 1% de H 2 O 2 (paso necesario ya que la amplificación fluorescente necesita incubación con peroxidasa de rábano picante, estreptavidina-HRP, consulte el paso 1.12). </li><li> Cryosections Lave 2X con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,3% Tritón. </li><li> Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD11b [1:30.000], 10% de NGS y 0,3% de Triton. </li><li> Lavado cryosections 2x (5 min) con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contengan biotina secundario anti-Rata Ab [1:200] y 1% de NGS. </li><li> Cryosections Lave 2X con PBS. </li><li> Lavar criosecciones con TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,05% de Tween 20). </li><li> Incubar criosecciones durante 1,5 h en TNB (tampón Tris-HCl-NaCl-Bloqueo: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,5% de reactivo de bloqueo del kit apropiado (véase la tabla de reactivos)). </li><li> Lave criosecciones 3x veces con TNT. </li><li> Incubar criosecciones en TNB que contienen estreptavidina-HRP [1:100]. </li><li> Cryosections Lave 3x con TNT. </li><li> Incubar cryosections durante 8 minutos en la amplificación de diluyente que contiene Cyanine 5 tiramida [1:300]. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,1% Tritón. </li><li> Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD68 [1:200], 3% de NGS y 0,3% de Triton. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar cryosections durante 60 minutos en PBS que contenía fluorconjugated secundaria Ab Alexa 546 anti-rata [1:500] y 1% de NGS. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar criosecciones durante 10 min en PBS que contiene Hoechst 1 g / ml. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Montar cryosections en Prolong oro. </li></ol> 2. La adquisición de imágenes tridimensionales por microscopía confocal <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; El microscopio usado aquí fue un microscopio IX81 equipado con una unidad de digitalización FV500 confocal con 3 líneas de láser: Ar-Kr (488nm), rojo de He-Ne (646nm) y He-Ne verde (532 nm) y un diodo UV. <ol><li> Seleccione los láseres de excitación en función de las longitudes de onda de los tintes fluorescentes para ser excitados (rojo He-Ne para Cy5, CD11b, He-Ne verde para Alexa546, CD68 y el diodo UV para Hoechst, núcleos). </li><li> Seleccione la mejor combinación espejo dicroico para la recolección de señal luminosa. </li><li> Configure la resolución de imagen en un mínimo de 800 x 600 píxeles. </li><li> Identifique un área de interés mediante el uso de epi-fluorescencia y aumentar progresivamente la ampliación con el objetivo de 40X. </li><li> Cambie a Láser Scanning Microscopy (LSM) modalidad. </li><li> Ejecutar exploraciones repetitivas para ajustar el fotomultiplicador (PMT) y la ganancia para cada canal. Los láseres pueden ser activados individualmente para facilitar la puesta en marcha. Mantener el aumento de lo más bajo posible para evitar señales no específicas no deseadas. </li><li> Con repetitive ejecución del análisis, mover el control de enfoque para definir los extremos inferior y superior de el eje z (longitud total del eje z = 10 micras). </li><li> Detener exploración repetitiva. </li><li> Definir el tamaño de paso. Debe ser lo más cerca posible de tamaño de píxel (0,225 m) para obtener una relación de tamaño 1:01 estándar sobre el eje z. </li><li> Activar filtro de Kalman por lo menos 2 veces. </li><li> Activar el modo de exploración secuencial para evitar efectos sangrar a través. </li><li> Ir a mitad de camino a lo largo del eje z y ejecutar un análisis secuencial xy. Compruebe la configuración de PMT y la ganancia (buena relación señal / ruido). Si no es satisfactoria, repita el paso 2.6. </li><li> Ejecute adquisición xyz. </li><li> Exportar datos como archivo multitiff. Cada archivo multitiff normalmente contiene 3 canales de color (azul, verde y rojo) y 44 planos focales. </li></ol> 3. Vista tridimensional de Adquisiciones confocal y de representación tridimensional Subir archivos multitiff al software Imaris y procesarlos como sigue: <ol><li>El software libre. </li><li> Seleccione la vista de superar. </li><li> Cargue el archivo multitiff. </li><li> Seleccione el color deseado para cada canal. </li><li> Eliminar el ruido de fondo, aumentando el valor mínimo en el panel de ajuste de pantalla. Ajuste cada canal individualmente. </li><li> Vaya a la vista de sección. Mover a lo largo del eje z en busca de co-localización (píxeles amarillos). </li><li> Haga clic en un área amarilla para ver si la colocalización está presente a lo largo del eje z (es decir, pertenece a un objeto sólido). Proyecciones del eje Z son visibles en la parte derecha y la parte inferior de la figura. </li><li> Tomar una instantánea. </li><li> Volver a superar la vista. </li><li> Recortar 3D para aislar una célula o un grupo de células. </li><li> Seleccione un canal en el panel de ajuste de pantalla. </li><li> Seleccione la superarán / superficies algoritmo constructor. Pasos del algoritmo: <ol><li> Seleccione el canal. </li><li> Definir umbral (utilizar el mismo valor mínimo de tse muestra el panel de ajuste). </li><li> Definir el cambio de tamaño. </li><li> Definir suavizado (mejor = 0,200). </li><li> Definir la apariencia del color. </li><li> Fin algoritmo. </li></ol></li><li> Repita paso 3,12 para cada canal. </li><li> Anule la selección de canales de fluorescencia en el panel de ajuste de la pantalla y seleccionar todas las tres superficies. </li><li> Mueva el volumen para encontrar la mejor vista. </li><li> Tomar una instantánea. </li></ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
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<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
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<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos aquí protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar la localización y coexpresión de marcadores de fenotipo M / M en el área isquémica (para un análisis más detallado, consulte la referencia 6). Este método combina la tinción específica del marcador relevante de activación M/M con imágenes confocales tridimensionales. El ajuste fino de anticuerpos, suero y diluciones de trabajo fluorconjugadas permite una relación seña...

Después de una lesión cerebral aguda, microglia se activan rápidamente y se someten morfológica dramática y fenotípica cambios 1-3. Esta respuesta intrínseca está asociada a la contratación de los macrófagos de origen sanguíneo que migran en el 4,5 parénquima cerebral lesionado. El papel de los macrófagos y microglia que antigénicamente no son distinguibles (en adelante el M / M) en el daño cerebral es todavía debatido. Un número creciente de estudios indican que, de manera similar a lo descrito para los macrófagos periféricos, la microglía y los macrófagos reclutados cerebro pueden asumir diferentes fenotipos cuyos extremos corresponden a classic pro-inflamatoria tóxica (M1) o de protección (M2) fenotipo antiinflamatorio. Los diferentes estados de activación, incluyendo la secreción de factores pro-o anti-inflamatorias, la liberación de moléculas neurotróficas y la actividad lisosomal se caracterizan por un patrón específico de marcadores fenotípicos, cuya expresión depende de lo temporalevolución del entorno circundante. La caracterización de estos fenotipos M / M en el cerebro lesionado es todavía escasa. Se utilizó un modelo murino bien establecida de pMCAo para analizar la expresión M / M y la evolución después del accidente cerebrovascular. Protocolos de inmunofluorescencia con base aquí presentados tienen como objetivo conseguir una idea de la apariencia de los marcadores específicos de M / M fenotipo, su localización y celular co-expresión en el área isquémica. Investigamos unas pocas moléculas asociadas a diferentes estado de activación o fenotipo, es decir, CD11b, un marcador de superficie expresada por los leucocitos y un marcador ampliamente utilizado de M / M de activación / contratación 6-8, CD68 un marcador de lisosomas 6,7 y YM1 un secretora proteína expresada por activados alternativamente (M2) y los macrófagos asociados a la recuperación y restauración de la función 9-10. Cuando dos marcadores son expresados ​​por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, colocalización por sí sola no puede ser mucho informative. En este caso, el análisis de coexpresión se puede realizar mediante el uso de una sola vista en planta y por las representaciones tridimensionales. Estamos aquí describir un protocolo para obtener un análisis tridimensional completo de coexpresión del marcador.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>Rat Anti-ratón CD11b</td><td>Amablemente proporcionado por el Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milán, Italia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anti-ratón Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Núcleos antineuronales de ratón (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-rata de cabra biotinilado</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratas alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Vectores de Suero de Cabra Normal</td><td>Laboratorios</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución Salina Tamponada de Fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Microscopio</td> confocal Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 </td><td>Software Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paquetes de software GraphPad Prism versión 4.0</td><td>Software GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en experimental brain injury

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Después de ictus cerebral microglia / macrófagos (M / M) se someten a una activación rápida con cambios morfológicos y fenotípicos dramáticos que incluyen la expresión de antígenos de superficie y producción de nuevos mediadores que construyen y mantienen la respuesta inflamatoria. Nuevas pruebas indican que M / M son células altamente plástico que pueden asumir anti-inflamatorio de activación clásica pro-inflamatoria (M1) o alternativa (M2) después de la lesión cerebral aguda. Sin embargo, una caracterización completa de M / M marcador expresión fenotipo, su colocalización y evolución temporal en el cerebro lesionado sigue desaparecido. Protocolos de tinción de inmunofluorescencia específicamente marcadores pertinentes de la activación M / M se pueden realizar en el cerebro isquémico. Aquí presentamos protocolos basados ​​en inmunofluorescencia seguido por análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar el patrón de localización y co-expresión de marcadores de fenotipo M / M, tales comoCD11b, CD68, Ym1, en modelo de ratón de isquemia focal inducida por la oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO). Análisis bidimensional de la zona manchada revela que cada marcador se asocia a una morfología M / M definido y tiene una localización dada en la lesión isquémica. Patrones de M / M marcador de fenotipo co-expresión puede evaluarse de imagen confocal tridimensional en la zona isquémica. Las imágenes pueden ser adquiridas en un volumen definido (10 micras Z-eje y un tamaño de 0,23 micras paso, que corresponde a un volumen de 180 x 135 x 10 micras) con un modo de escaneo secuencial para minimizar los efectos de sangrado a través de la longitud de onda y evitar la superposición. Las imágenes se procesaron a continuación para obtener representaciones en tres dimensiones por medio de un software Imaris. Vista sólido de tres representaciones tridimensionales permite la definición de la expresión del marcador en grupos de células. Se demuestra que M / M tienen la capacidad de diferenciarse hacia una multitud de fenotipos, dependiendo de la localización en el sitio de la lesión y Timí después de la lesión.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando se realizan protocolos de marcado y adquisiciones confocales en la región isquémica se ilustra en las Figuras 1A y 1B. Una vista bidimensional de las imágenes adquiridas muestra que, a las veinticuatro horas tras la isquemia (A), el marcador lisosomal CD68 (verde) se expresa en células ameboides hipertrofiadas CD11b (rojo) presentes en el núcleo isquémico. En la zona de borde (B), las células positivas para C...

Se presenta una forma de obtener nuevos conocimientos sobre la complejidad de la respuesta inflamatoria cerebral. Describimos protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional para investigar el patrón de coexpresión de marcadores fenotípicos de microglía/macrófagos en un modelo murino de isquemia focal.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la expresión y la localización celular de los marcadores del fenotipo de macrófagos microgliales tras una isquemia cerebral. Primero, se tiñen secciones criostáticas de cerebros isquémicos de ratón para identificar marcadores de activación de macrófagos microgliales. Las secciones teñidas se someten a imágenes confocales tridimensionales.Las imágenes resultantes se procesan luego para generar representaciones tridimensionales, y se realiza un análisis de imagen para localizar la expresión de marcadores en grupos de células. Los datos resultantes demuestran la eficacia del análisis confocal tridimensional para asignar correctamente la expresión de marcadores a un cuerpo celular específico. Cuando dos marcadores son expresados por la misma célula, pero en compartimentos subcelulares diferentes, la colocalización por sí sola puede no ser muy informativa. El uso del análisis tridimensional, como demostraremos aquí, permite una mejor resolución y precisión.Aunque este método puede proporcionar información sobre la complejidad de la respuesta cerebral a la lesión isquémica, también puede aplicarse a otras condiciones agudas o cr

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Neurociencia

Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Los astrocitos en el SNC cambian sus propiedades funcionales y estructurales en respuesta a estímulos dañinos. Este informe presenta un protocolo para la evaluación de la morfología tridimensional de los astrocitos en condiciones de enfermedad o después de intervenciones terapéuticas.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

El accidente cerebrovascular es un problema global con opciones de tratamiento mínimas y sin terapia clínica actual para regenerar el tejido cerebral perdido. Aquí describimos métodos para crear un accidente cerebrovascular fototrombótico preciso en la corteza motora de roedores y la posterior inyección de biomateriales de hidrogel para estudiar sus efectos sobre la regeneración de tejidos después del accidente cerebrovascular.

Inyección de andamios de biomaterial de hidrogel en el cerebro después de un accidente cerebrovascular

Este protocolo presenta métodos para caracterizar la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática leve e integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando regresión parcial de mínimos cuadrados.

Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Este método permite un examen detallado de las interacciones neuroinmunes y puede adaptarse para el estudio de otras enfermedades neurodegenerativas, mejorando nuestra comprensión de las respuestas inmunes en la patología del ictus.

Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y...

Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Aprende a visualizar marcadores de microglía/macrófagos en isquemia cerebral mediante inmunofluorescencia e imagen confocal tridimensional en ratón. Este método mejora la resolución espacial y permite asignar correctamente la expresión de marcadores a compartimentos celulares específicos.

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