Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la expresión y la localización celular de los marcadores de fenotipo de microglía y macrófagos después de la isquemia cerebral. En primer lugar, se tiñen secciones criogénicas de cerebros de ratones isquémicos para identificar marcadores de activación de microglia y macrófagos. Las secciones teñidas se someten a imágenes confocales tridimensionales.

A continuación, las imágenes resultantes se procesan para generar representaciones tridimensionales y se realiza un análisis de imágenes para localizar la expresión de marcadores en grupos de células. Los datos resultantes demuestran la eficacia del análisis confocal tridimensional para asignar correctamente la expresión de marcadores a un cuerpo celular específico. Cuando dos marcadores son expresados por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, la colocalización por sí sola puede no ser muy informativa. El uso del análisis tridimensional, como demostraremos aquí, permite una mejor resolución y precisión.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la complejidad de la respuesta cerebral a la lesión isquémica, también se puede aplicar a otras afecciones agudas o crónicas en las que se ha propuesto un doble papel de los macrófagos de la microglía en la lesión y la reparación. O en aquellos casos en los que las señales deban localizarse selectivamente en diferentes planos especiales, Carlo Perigo y Stefan de Magali le guiarán a través de los diferentes pasos del procedimiento. El siguiente protocolo utiliza tejido cerebral de ratón en el que la isquemia fue inducida por oclusión permanente de la arteria cerebral media.

Use un criostato para recolectar secciones coronales seriadas de 20 micras del cerebro en gelatina. Los portaobjetos cubiertos llevan todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de su uso. Tenga en cuenta que la dilución de trabajo de los anticuerpos y el suero enumerados en su documento complementario es el resultado de los ensayos realizados para obtener el mejor rendimiento cuando se utilizan diferentes anticuerpos y suero.

El protocolo debe ser validado. Comience por rodear las secciones del portaobjetos con un bolígrafo bloqueador de líquidos para minimizar la cantidad de reactivos necesarios. A continuación, coloque las secciones de cerebro en una cámara húmeda con una pipeta de un mililitro.

Agregue PBS a temperatura ambiente a las secciones e incube durante cinco minutos para lavarlas. A continuación, con una jeringa desechable de un mililitro con aguja, retire la solución y repita el lavado una vez más. Después de eliminar el segundo lavado, proceda a teñir las muestras con una pipeta de un mililitro y una jeringa desechable para todos los intercambios de solución. El procedimiento de tinción debe realizarse como se resume. Aquí.

Consulte el texto adjunto para obtener más detalles, incluidos los pasos de lavado. Primero, las células se incuban con peróxido de hidrógeno al 1% después de bloquearlas con suero de cabra normal. Se incuban con un anticuerpo primario contra CD 11 B. A continuación, los portaobjetos se incuban con un anticuerpo secundario apropiado seguido de triss, tampón de interpolación NACL o TNT, luego triss, H-C-L-N-A-C-L, tampón de bloqueo o TNB después de la incubación con TNB.

Los portaobjetos se incuban con estreptavidina HRP seguido de un diluyente de amplificación que contiene cianuro cinco tirom, que amplificará la señal inmunofluorescente. A continuación, los portaobjetos se incuban con NGS para bloquear los sitios de unión no específicos. Luego se incuban con un anticuerpo primario contra el CD 68.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, las células se incuban en el anticuerpo secundario conjugado con flúor apropiado, seguido de un microgramo por mililitro de ganchos para marcar el ADN. Una vez finalizada la tinción, monte las secciones criogénicas utilizando oro prolongado al montar las secciones, evite generar burbujas de aire. Guarde las secciones a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que se analicen.

La adquisición de la señal fluorescente debe realizarse en el plazo de una semana. Este protocolo utiliza un microscopio IX 81 equipado con una unidad de escaneo confocal FV 500 con tres líneas láser: argón criptón a 488 nanómetros, helio neón rojo a 646 nanómetros y helio neón verde a 532 nanómetros, más un diodo UV en el software flu of U 500. Seleccione los láseres de excitación y los espejos dicroicos adecuados.

Configure también la resolución de la imagen en un mínimo de 800 x 600 píxeles. A continuación, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y, utilizando la epifluorescencia, identifique un área de interés, aumente progresivamente el aumento hasta el objetivo de 40x. A continuación, cambie a la modalidad de microscopía de escaneo láser y ejecute exploraciones repetitivas mientras ajusta el nivel de potencia del fotomultiplicador y la ganancia para cada canal.

Esto reducirá la superposición de señales causada por la excitación contemporánea en diferentes longitudes de onda. Mantenga la ganancia lo más baja posible para evitar señales inespecíficas no deseadas. Continuando con el escaneo repetitivo, ajuste el enfoque y defina los extremos inferior y superior del eje Z con una longitud total del eje Z de 10 micras.

A continuación, detenga el análisis repetitivo. A continuación, introduzca el tamaño del paso. Debe estar lo más cerca posible del tamaño del píxel, que es de 0,225 micras.

Esto dará una relación de tamaño estándar de uno a uno sobre el eje Z en el software Activate kalman filter al menos dos veces. El algoritmo de Kalman es una función iterativa que elimina la señal aleatoria, como los vóxeles positivos individuales que pertenecen al ruido de fondo, mejorando así la relación señal-ruido. Ahora active el modo de escaneo secuencial para evitar efectos de sangrado.

Muévase al punto medio del eje Z y ejecute un escaneo secuencial XY. Compruebe la configuración de PMT y la ganancia para garantizar una relación señal/ruido satisfactoria. Ejecute la adquisición XY, Z después de la adquisición.

Exporte los datos como un archivo multi TIF. Cada archivo TIF múltiple suele contener tres canales de color y 44 planos focales para el procesamiento. Comience abriendo el software imas.

En primer lugar, seleccione la vista de sobrepaso y, a continuación, cargue el archivo TIF múltiple. A continuación, en el panel de ajuste de la pantalla, seleccione el color deseado para cada canal Aquí. El rojo representa el CD 11 B. El verde representa el CD 68 y el azul representa la tinción de ADN de los ganchos para eliminar el ruido del fondo, aumentar el valor mínimo en el panel de ajuste de la pantalla para cada canal.

A continuación, vaya a la vista en sección para visualizar un único plano focal XY con proyecciones ortogonales de los ejes x, Z e YZ. Desplácese a lo largo del eje Z en busca de colocalización, que aparece como píxeles amarillos. Haga clic en un área amarilla para ver si la colocalización está presente a lo largo del eje Z, lo que indica que pertenece a un objeto sólido del eje Z.

Las proyecciones son visibles en la parte derecha e inferior de la figura. Tome una instantánea y, a continuación, vuelva a la vista de superación. A continuación, en el menú desplegable de edición, seleccione recortar 3D y delinee una región de interés para aislar una celda o un grupo de celdas.

A continuación, en el panel de ajuste de la pantalla, seleccione un canal. Seleccione el generador de algoritmos de superación de superficies. Luego, para configurar el algoritmo, primero, seleccione un canal.

A continuación, defina el umbral como el mismo valor mínimo establecido en el panel de ajuste de la pantalla y defina el cambio de tamaño si es necesario. A continuación, defina el suavizado como 0,200. Seleccione el panel de color y cambie la apariencia según sea necesario.

Repita la configuración para el generador de algoritmos de superficies de repaso para cada canal. A continuación, en el panel de ajuste de la pantalla, anule la selección de los canales de fluorescencia y seleccione las tres superficies. Por último, mueva el volumen para encontrar la mejor vista y tome una instantánea para determinar el patrón de coexpresión de los marcadores MM.

Los protocolos de inmunofluorescencia y adquisición confocal descritos en este vídeo se llevaron a cabo en un modelo murino de isquemia focal inducida por oclusión permanente de la arteria cerebral media. Una vista bidimensional de las imágenes adquiridas muestra que a las 24 horas después de la isquemia, los marcadores lisosomales CD 68, que se muestran en verde, se expresan en las células B positivas para CD 11 en medio de las hipertróficas, que se ven en rojo presentes en el núcleo isquémico. La proyección del eje Z que se muestra en la parte inferior derecha demuestra que la distribución de marcadores documentada en la vista de plano único también está presente a lo largo del eje Z en la zona de borde.

Las células CD 11 B positivas muestran cuerpos celulares hipertróficos con procesos altamente positivos para CD 68, lo que sugiere que los fagosomas están unidos a la membrana celular. Esto indica el comportamiento ácido PHA activo de las células microgliales para evaluar la coexpresión de CD 68 y YM uno, un marcador de M dos polarizado. Mm.Las imágenes fluorescentes se sometieron a una representación tridimensional.

La vista tridimensional de las imágenes adquiridas que se muestran aquí indica la presencia de células CD 68 positivas en verde y células positivas YM one en vóxeles fluorescentes rojos. Colocada en paralelo, la vista del observador puede producir una señal colocalizada que se ve como amarilla, que puede no estar relacionada con la distancia real entre los marcadores. Para definir la colocalización.

Se debe generar una vista de un solo plano con proyecciones del eje Z moviéndose a lo largo del eje Z. Buscando la colocalización. La proyección del eje Z se obtiene como se ve en la parte derecha e inferior de esta imagen.

Los vóxeles fluorescentes se pueden convertir en objetos sólidos mediante la representación tridimensional con la asignación de expresión de marcadores a un cuerpo celular específico. Después de un gran aumento y renderizado en 3D, los dos marcadores parecen pertenecer a diferentes celdas que están muy próximas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de inmunofluorescencia con múltiples marcadores y colorantes, y cómo adquirir y visualizar correctamente imágenes tridimensionales mediante microscopía confocal.

Además, el análisis de post-procesado descrito puede ser aprovechado fructíferamente para analizar cualquier co-expresión o colocalización a nivel celular, o en aquellos casos en los que las señales necesiten ser localizadas selectivamente en diferentes planos espaciales.