Name: Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprende a visualizar marcadores de microglía/macrófagos en isquemia cerebral mediante inmunofluorescencia e imagen confocal tridimensional en ratón. Este método mejora la resolución espacial y permite asignar correctamente la expresión de marcadores a compartimentos celulares específicos.

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Stefano Fumagalli es miembro de la Fundación Monzino.

1. Inmunofluorescencia El siguiente protocolo se realiza en secciones criogénicas cerebrales coronales obtenidas de ratones perfundidos transcardialmente (20 ml de PBS, 0,1 moles / litro, pH 7,4, seguido de 50 ml de paraformaldehído al 4% enfriado en PBS). Después de la perfusión, los cerebros se retiran y se transfieren a 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante la noche para crioprotección cuidadosamente. Los cerebros se congelan rápidamente por inmersión en isopentano a - 45 ° C durante 3 min antes de ser sellado en viales y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso. Criosecciones cerebrales coronales (20 m) se cortan en serie y se sometieron a protocolo de inmunofluorescencia 11, 6. Llevar todos reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de su uso. Por favor, tenga en cuenta que los presentados diluciones de trabajo de anticuerpos en suero y el resultado de las pruebas realizadas con el fin de obtener el mejor rendimiento. Cuando se utilizan diferentes anticuerpos y el suero, el protocolo debe ser validado. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota que debido a anticuerpos primarios tanto anti-CD11b y anti-CD68 se hacen, en la rata, para evitar la señal de cruce por anti-rata Alexa 546, se utilizó una alta dilución de anticuerpos anti-CD11b seguido de amplificación de la señal fluorescente con kit TSA (Cy5 tiramida). Hemos puesto en marcha la dilución de trabajo óptima para el anti-CD11b realizando el protocolo descrito excepto el paso 1.17 y el uso de por lo menos 7 diferentes diluciones de anti-CD11b como se informa en la Tabla 1. Como resultado, 1:30.000 ha sido elegido ser el único dilución lograr: 1) la señal visible con Cy5 a una excitación de longitud de onda 646 nm; 2) no hay señal con Alexa 546 en la longitud de onda de excitación de 532 nm. De esta manera, Alexa 546 señal fluorescente se asocia selectivamente con la expresión de CD68. Las diluciones óptimas para los anticuerpos anti-CD68 anti-CD11b y pueden variar dependiendo del tipo de tejido y debe ser definido antes de iniciar el protocolo de co-etiquetado. <ol><li> Lave cryosections cerebro dos veces con PBS. </li><li> Encryosections Cubate durante 5 minutos en PBS que contenía 1% de H 2 O 2 (paso necesario ya que la amplificación fluorescente necesita incubación con peroxidasa de rábano picante, estreptavidina-HRP, consulte el paso 1.12). </li><li> Cryosections Lave 2X con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,3% Tritón. </li><li> Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD11b [1:30.000], 10% de NGS y 0,3% de Triton. </li><li> Lavado cryosections 2x (5 min) con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contengan biotina secundario anti-Rata Ab [1:200] y 1% de NGS. </li><li> Cryosections Lave 2X con PBS. </li><li> Lavar criosecciones con TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,05% de Tween 20). </li><li> Incubar criosecciones durante 1,5 h en TNB (tampón Tris-HCl-NaCl-Bloqueo: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,5% de reactivo de bloqueo del kit apropiado (véase la tabla de reactivos)). </li><li> Lave criosecciones 3x veces con TNT. </li><li> Incubar criosecciones en TNB que contienen estreptavidina-HRP [1:100]. </li><li> Cryosections Lave 3x con TNT. </li><li> Incubar cryosections durante 8 minutos en la amplificación de diluyente que contiene Cyanine 5 tiramida [1:300]. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar durante 60 min cryosections en PBS que contenía 10% de NGS y 0,1% Tritón. </li><li> Incubar criosecciones a 4 ° C durante la noche en PBS que contenía primaria Ab de rata anti-CD68 [1:200], 3% de NGS y 0,3% de Triton. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar cryosections durante 60 minutos en PBS que contenía fluorconjugated secundaria Ab Alexa 546 anti-rata [1:500] y 1% de NGS. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Incubar criosecciones durante 10 min en PBS que contiene Hoechst 1 g / ml. </li><li> Cryosections Lave 3 veces con PBS. </li><li> Montar cryosections en Prolong oro. </li></ol> 2. La adquisición de imágenes tridimensionales por microscopía confocal <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; El microscopio usado aquí fue un microscopio IX81 equipado con una unidad de digitalización FV500 confocal con 3 líneas de láser: Ar-Kr (488nm), rojo de He-Ne (646nm) y He-Ne verde (532 nm) y un diodo UV. <ol><li> Seleccione los láseres de excitación en función de las longitudes de onda de los tintes fluorescentes para ser excitados (rojo He-Ne para Cy5, CD11b, He-Ne verde para Alexa546, CD68 y el diodo UV para Hoechst, núcleos). </li><li> Seleccione la mejor combinación espejo dicroico para la recolección de señal luminosa. </li><li> Configure la resolución de imagen en un mínimo de 800 x 600 píxeles. </li><li> Identifique un área de interés mediante el uso de epi-fluorescencia y aumentar progresivamente la ampliación con el objetivo de 40X. </li><li> Cambie a Láser Scanning Microscopy (LSM) modalidad. </li><li> Ejecutar exploraciones repetitivas para ajustar el fotomultiplicador (PMT) y la ganancia para cada canal. Los láseres pueden ser activados individualmente para facilitar la puesta en marcha. Mantener el aumento de lo más bajo posible para evitar señales no específicas no deseadas. </li><li> Con repetitive ejecución del análisis, mover el control de enfoque para definir los extremos inferior y superior de el eje z (longitud total del eje z = 10 micras). </li><li> Detener exploración repetitiva. </li><li> Definir el tamaño de paso. Debe ser lo más cerca posible de tamaño de píxel (0,225 m) para obtener una relación de tamaño 1:01 estándar sobre el eje z. </li><li> Activar filtro de Kalman por lo menos 2 veces. </li><li> Activar el modo de exploración secuencial para evitar efectos sangrar a través. </li><li> Ir a mitad de camino a lo largo del eje z y ejecutar un análisis secuencial xy. Compruebe la configuración de PMT y la ganancia (buena relación señal / ruido). Si no es satisfactoria, repita el paso 2.6. </li><li> Ejecute adquisición xyz. </li><li> Exportar datos como archivo multitiff. Cada archivo multitiff normalmente contiene 3 canales de color (azul, verde y rojo) y 44 planos focales. </li></ol> 3. Vista tridimensional de Adquisiciones confocal y de representación tridimensional Subir archivos multitiff al software Imaris y procesarlos como sigue: <ol><li>El software libre. </li><li> Seleccione la vista de superar. </li><li> Cargue el archivo multitiff. </li><li> Seleccione el color deseado para cada canal. </li><li> Eliminar el ruido de fondo, aumentando el valor mínimo en el panel de ajuste de pantalla. Ajuste cada canal individualmente. </li><li> Vaya a la vista de sección. Mover a lo largo del eje z en busca de co-localización (píxeles amarillos). </li><li> Haga clic en un área amarilla para ver si la colocalización está presente a lo largo del eje z (es decir, pertenece a un objeto sólido). Proyecciones del eje Z son visibles en la parte derecha y la parte inferior de la figura. </li><li> Tomar una instantánea. </li><li> Volver a superar la vista. </li><li> Recortar 3D para aislar una célula o un grupo de células. </li><li> Seleccione un canal en el panel de ajuste de pantalla. </li><li> Seleccione la superarán / superficies algoritmo constructor. Pasos del algoritmo: <ol><li> Seleccione el canal. </li><li> Definir umbral (utilizar el mismo valor mínimo de tse muestra el panel de ajuste). </li><li> Definir el cambio de tamaño. </li><li> Definir suavizado (mejor = 0,200). </li><li> Definir la apariencia del color. </li><li> Fin algoritmo. </li></ol></li><li> Repita paso 3,12 para cada canal. </li><li> Anule la selección de canales de fluorescencia en el panel de ajuste de la pantalla y seleccionar todas las tres superficies. </li><li> Mueva el volumen para encontrar la mejor vista. </li><li> Tomar una instantánea. </li></ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
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<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
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<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos aquí protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar la localización y coexpresión de marcadores de fenotipo M / M en el área isquémica (para un análisis más detallado, consulte la referencia 6). Este método combina la tinción específica del marcador relevante de activación M/M con imágenes confocales tridimensionales. El ajuste fino de anticuerpos, suero y diluciones de trabajo fluorconjugadas permite una relación seña...

Después de una lesión cerebral aguda, microglia se activan rápidamente y se someten morfológica dramática y fenotípica cambios 1-3. Esta respuesta intrínseca está asociada a la contratación de los macrófagos de origen sanguíneo que migran en el 4,5 parénquima cerebral lesionado. El papel de los macrófagos y microglia que antigénicamente no son distinguibles (en adelante el M / M) en el daño cerebral es todavía debatido. Un número creciente de estudios indican que, de manera similar a lo descrito para los macrófagos periféricos, la microglía y los macrófagos reclutados cerebro pueden asumir diferentes fenotipos cuyos extremos corresponden a classic pro-inflamatoria tóxica (M1) o de protección (M2) fenotipo antiinflamatorio. Los diferentes estados de activación, incluyendo la secreción de factores pro-o anti-inflamatorias, la liberación de moléculas neurotróficas y la actividad lisosomal se caracterizan por un patrón específico de marcadores fenotípicos, cuya expresión depende de lo temporalevolución del entorno circundante. La caracterización de estos fenotipos M / M en el cerebro lesionado es todavía escasa. Se utilizó un modelo murino bien establecida de pMCAo para analizar la expresión M / M y la evolución después del accidente cerebrovascular. Protocolos de inmunofluorescencia con base aquí presentados tienen como objetivo conseguir una idea de la apariencia de los marcadores específicos de M / M fenotipo, su localización y celular co-expresión en el área isquémica. Investigamos unas pocas moléculas asociadas a diferentes estado de activación o fenotipo, es decir, CD11b, un marcador de superficie expresada por los leucocitos y un marcador ampliamente utilizado de M / M de activación / contratación 6-8, CD68 un marcador de lisosomas 6,7 y YM1 un secretora proteína expresada por activados alternativamente (M2) y los macrófagos asociados a la recuperación y restauración de la función 9-10. Cuando dos marcadores son expresados ​​por la misma célula, pero en diferentes compartimentos subcelulares, colocalización por sí sola no puede ser mucho informative. En este caso, el análisis de coexpresión se puede realizar mediante el uso de una sola vista en planta y por las representaciones tridimensionales. Estamos aquí describir un protocolo para obtener un análisis tridimensional completo de coexpresión del marcador.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales</td></tr><tr><td>Rat Anti-ratón CD11b</td><td>Amablemente proporcionado por el Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milán, Italia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anti-ratón Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Núcleos antineuronales de ratón (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-rata de cabra biotinilado</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratas alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Vectores de Suero de Cabra Normal</td><td>Laboratorios</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución Salina Tamponada de Fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Microscopio</td> confocal Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 </td><td>Software Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paquetes de software GraphPad Prism versión 4.0</td><td>Software GraphPad Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en experimental brain injury

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Después de ictus cerebral microglia / macrófagos (M / M) se someten a una activación rápida con cambios morfológicos y fenotípicos dramáticos que incluyen la expresión de antígenos de superficie y producción de nuevos mediadores que construyen y mantienen la respuesta inflamatoria. Nuevas pruebas indican que M / M son células altamente plástico que pueden asumir anti-inflamatorio de activación clásica pro-inflamatoria (M1) o alternativa (M2) después de la lesión cerebral aguda. Sin embargo, una caracterización completa de M / M marcador expresión fenotipo, su colocalización y evolución temporal en el cerebro lesionado sigue desaparecido. Protocolos de tinción de inmunofluorescencia específicamente marcadores pertinentes de la activación M / M se pueden realizar en el cerebro isquémico. Aquí presentamos protocolos basados ​​en inmunofluorescencia seguido por análisis confocal tridimensional como un enfoque poderoso para investigar el patrón de localización y co-expresión de marcadores de fenotipo M / M, tales comoCD11b, CD68, Ym1, en modelo de ratón de isquemia focal inducida por la oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO). Análisis bidimensional de la zona manchada revela que cada marcador se asocia a una morfología M / M definido y tiene una localización dada en la lesión isquémica. Patrones de M / M marcador de fenotipo co-expresión puede evaluarse de imagen confocal tridimensional en la zona isquémica. Las imágenes pueden ser adquiridas en un volumen definido (10 micras Z-eje y un tamaño de 0,23 micras paso, que corresponde a un volumen de 180 x 135 x 10 micras) con un modo de escaneo secuencial para minimizar los efectos de sangrado a través de la longitud de onda y evitar la superposición. Las imágenes se procesaron a continuación para obtener representaciones en tres dimensiones por medio de un software Imaris. Vista sólido de tres representaciones tridimensionales permite la definición de la expresión del marcador en grupos de células. Se demuestra que M / M tienen la capacidad de diferenciarse hacia una multitud de fenotipos, dependiendo de la localización en el sitio de la lesión y Timí después de la lesión.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando se realizan protocolos de marcado y adquisiciones confocales en la región isquémica se ilustra en las Figuras 1A y 1B. Una vista bidimensional de las imágenes adquiridas muestra que, a las veinticuatro horas tras la isquemia (A), el marcador lisosomal CD68 (verde) se expresa en células ameboides hipertrofiadas CD11b (rojo) presentes en el núcleo isquémico. En la zona de borde (B), las células positivas para C...

Se presenta una forma de obtener nuevos conocimientos sobre la complejidad de la respuesta inflamatoria cerebral. Describimos protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional para investigar el patrón de coexpresión de marcadores fenotípicos de microglía/macrófagos en un modelo murino de isquemia focal.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la expresión y la localización celular de los marcadores del fenotipo de macrófagos microgliales tras una isquemia cerebral. Primero, se tiñen secciones criostáticas de cerebros isquémicos de ratón para identificar marcadores de activación de macrófagos microgliales. Las secciones teñidas se someten a imágenes confocales tridimensionales.Las imágenes resultantes se procesan luego para generar representaciones tridimensionales, y se realiza un análisis de imagen para localizar la expresión de marcadores en grupos de células. Los datos resultantes demuestran la eficacia del análisis confocal tridimensional para asignar correctamente la expresión de marcadores a un cuerpo celular específico. Cuando dos marcadores son expresados por la misma célula, pero en compartimentos subcelulares diferentes, la colocalización por sí sola puede no ser muy informativa. El uso del análisis tridimensional, como demostraremos aquí, permite una mejor resolución y precisión.Aunque este método puede proporcionar información sobre la complejidad de la respuesta cerebral a la lesión isquémica, también puede aplicarse a otras condiciones agudas o crónicas en las que se ha propuesto un papel dual de las microglías y macrófagos en la lesión y la reparación. O en aquellos casos en los que sea necesario localizar selectivamente las señales en diferentes planos espaciales, Carlo Perigo y Stefan de Magali le guiarán a través de los distintos pasos del procedimiento. El siguiente protocolo utiliza tejido cerebral de ratón en el que la isquemia se indujo mediante la oclusión permanente de la arteria cerebral media.Utilice un criostato para recoger secciones coronales seriadas de 20 micrones del cerebro sobre gelatina. Lleve las laminillas cubiertas y todas las muestras y reactivos a temperatura ambiente antes de su uso. Tenga en cuenta que la dilución de trabajo de los anticuerpos y sueros indicada en su documento complementario resultó de ensayos realizados para obtener el mejor rendimiento al emplear diferentes anticuerpos y sueros.El protocolo debe ser validado. Comience rodeando las secciones en la laminilla con un bolígrafo bloqueador de líquidos para minimizar la cantidad de reactivos necesarios. A continuación, coloque las secciones cerebrales en una cámara húmeda utilizando una pipeta de un mililitro.Añada PBS a temperatura ambiente a las secciones e incube durante cinco minutos para lavarlas. Luego, utilizando una jeringa desechable de un mililitro con aguja, retire la solución y repita el lavado una vez más. Después de eliminar el segundo lavado, continúe con la tinción de las muestras utilizando una pipeta de un mililitro y una jeringa desechable para todos los intercambios de solución. El procedimiento de tinción debe realizarse según se resume aquí.Consulte el texto adjunto para obtener más detalles, incluidos los pasos de lavado. Primero, las células se incuban con peróxido de hidrógeno al 1% tras bloquearlas con suero de cabra normal. Luego, se incuban con un anticuerpo primario contra CD11B. A continuación, las muestras se incuban con un anticuerpo secundario apropiado, seguido de tampón triss, NACL tween o TNT, y después triss, H-C-L-N-A-C-L, tampón de bloqueo o TNB, tras la incubación con TNB.Las láminas se incuban con estreptavidina HRP seguido de un diluyente de amplificación que contiene cianuro cinco tirom, el cual amplificará la señal inmunofluorescente. A continuación, las láminas se incuban con NGS para bloquear los sitios de unión no específicos. Luego, se incuban con un anticuerpo primario contra CD 68.Después de la incubación con el anticuerpo primario, las células se incuban luego con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo adecuado, seguido de un microgramo por mililitro de colorante para etiquetar el ADN. Una vez completada la tinción, monte secciones criostáticas utilizando prolongated gold; al montar las secciones, evite generar burbujas de aire. Almacene las secciones a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que sean analizadas.La adquisición de la señal fluorescente debe realizarse dentro de una semana. Este protocolo utiliza un microscopio IX 81 equipado con una unidad de escaneo confocal FV 500 con tres líneas láser: argón criptón a 488 nanómetros, helio neón rojo a 646 nanómetros y helio neón verde a 532 nanómetros, además de un diodo UV en el flujo del software U 500. Seleccione los láseres de excitación y los espejos dicróicos adecuados.Asimismo, configure la resolución de la imagen con un mínimo de 800 por 600 píxeles. A continuación, coloque el portaobjetos sobre la platina del microscopio y, utilizando fluorescencia episcópica, identifique un área de interés, aumentando progresivamente el aumento hasta el objetivo de 40 x. Luego cambie al modo de microscopía de barrido con láser y realice escaneos repetitivos mientras ajusta el nivel de potencia del fotomultiplicador y la ganancia para cada canal.Esto reducirá la superposición de señales causada por la excitación simultánea a diferentes longitudes de onda. Mantenga la ganancia lo más baja posible para evitar señales inespecíficas no deseadas. Al continuar el escaneo repetitivo, ajuste el enfoque y defina los extremos inferior y superior del eje Z con una longitud total del eje Z de 10 micrones.Luego detenga el escaneo repetitivo. A continuación, introduzca el tamaño de paso. Debe ser lo más cercano posible al tamaño del píxel, que es de 0,225 micrones.Esto dará una relación de tamaño estándar uno a uno sobre el eje Z en el software. Active el filtro kalman al menos dos veces. El algoritmo kalman es una función iterativa que elimina señales aleatorias, como vóxeles positivos individuales pertenecientes al ruido de fondo, mejorando así la relación señal-ruido. Ahora active el modo de escaneo secuencial para evitar efectos de solapamiento.Mueva al punto medio del eje Z y realice un escaneo secuencial XY. Verifique la configuración del PMT y la ganancia para asegurar una relación señal-ruido satisfactoria. Realice la adquisición XY, Z siguiendo la adquisición.Exporte los datos como un archivo TIF múltiple. Cada archivo TIF múltiple contiene típicamente tres canales de color y 44 planos focales para su procesamiento. Comience abriendo el software imas.Primero, seleccione la vista surpass y luego cargue el archivo múltiple TIF. A continuación, en el panel de ajuste de visualización, seleccione el color deseado para cada canal aquí. El rojo representa CD11B, el verde representa CD68 y el azul representa la tinción de ADN con hoechst. Para eliminar el ruido de fondo, aumente el valor mínimo en el panel de ajuste de visualización para cada canal.Luego, vaya a la vista de sección para visualizar un único plano focal XY con proyecciones ortogonales de los ejes XZ y YZ. Muévase a lo largo del eje Z buscando la colocalización, que aparece como píxeles amarillos. Haga clic en un área amarilla para ver si la colocalización está presente a lo largo del eje Z, lo que indica que pertenece a un objeto sólido en el eje Z.Las proyecciones son visibles en la parte derecha e inferior de la figura. Tome una captura de pantalla, luego regrese a la vista surpass. A continuación, en el menú desplegable editar, seleccione recortar 3D y delimite una región de interés para aislar una célula o un grupo de células.Luego, en el panel de ajuste de visualización, seleccione un canal. Seleccione el generador de algoritmos de superficies superiores. A continuación, para configurar el algoritmo, primero seleccione un canal.Luego defina el umbral como el mismo valor mínimo establecido en el panel de ajuste de visualización y defina el cambio de tamaño si es necesario. A continuación, defina el suavizado como 0,200. Seleccione el panel de color y cambie la apariencia según sea necesario.Repita la configuración del generador de algoritmos para superficies sobresalientes para cada canal. Luego, en el panel de ajuste de visualización, desactive los canales de fluorescencia y seleccione las tres superficies. Finalmente, mueva el volumen para encontrar la mejor vista y tome una instantánea para determinar el patrón de coexpresión de los marcadores de MM.Los protocolos de inmunofluorescencia y adquisición confocal descritos en este video se llevaron a cabo en un modelo murino de isquemia focal inducida por la oclusión permanente de la arteria cerebral media. Una vista bidimensional de las imágenes adquiridas muestra que, a las 24 horas tras la isquemia, los marcadores lisosomales CD68, que aparecen en verde, se expresan en células hipertrofiantes positivas para CD11b, que se observan en rojo, presentes en el núcleo isquémico. La proyección del eje Z mostrada en la esquina inferior derecha demuestra que la distribución de los marcadores documentada en la vista de un solo plano también está presente a lo largo del eje Z en la zona fronteriza.Las células positivas para CD11B muestran cuerpos celulares hipertrofiados con prolongaciones altamente positivas para CD68, lo que sugiere que los fagocitos están unidos a la membrana celular. Esto indica un comportamiento ácido activo de los fagocitos en las células microgliales para evaluar la coexpresión de CD68 y YM1, un marcador de polarización M2. Mm. Las imágenes fluorescentes fueron sometidas a una reconstrucción tridimensional.La vista tridimensional de las imágenes adquiridas mostrada aquí indica la presencia de células positivas para CD68, mostradas en verde, y células positivas para YM1, mostradas en rojo en los vóxeles fluorescentes. Al estar dispuestas en paralelo, la vista del observador puede producir una señal colocalizada que aparece en amarillo, lo cual podría no estar relacionado con la distancia real entre los marcadores. Para definir la colocalización.Debe generarse una vista de un solo plano con proyecciones del eje Z moviéndose a lo largo del eje Z. Buscando colocalización. La proyección del eje Z se obtiene como se observa en la parte derecha e inferior de esta imagen.Los vóxeles fluorescentes pueden transformarse en objetos sólidos mediante una representación tridimensional que asigne la expresión del marcador a un cuerpo celular específico. Tras una ampliación elevada y una representación 3D, los dos marcadores parecen pertenecer a células diferentes que se encuentran en estrecha proximidad. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de inmunofluorescencia con múltiples marcadores y colorantes, y de cómo adquirir y visualizar adecuadamente imágenes tridimensionales mediante microscopía confocal.Además, el análisis de postprocesamiento descrito puede aprovecharse fructíferamente para analizar cualquier coexpresión o colocalización a nivel celular, o en aquellos casos en los que las señales necesiten localizarse selectivamente en diferentes planos espaciales.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.

Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión

Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

Este protocolo presenta métodos para caracterizar la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática leve e integrar estos datos como parte de un análisis de sistemas multivariante utilizando regresión parcial de mínimos cuadrados.

Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

El protocolo describe una lesión cerebral traumática leve en un modelo de ratón. En particular, se explica completamente un protocolo paso a paso para inducir una lesión leve en la cabeza cerrada en la línea media y la caracterización del modelo animal.

Modelo electromagnético controlado de cabeza cerrada de lesión cerebral traumática leve en ratones

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Este método permite un examen detallado de las interacciones neuroinmunes y puede adaptarse para el estudio de otras enfermedades neurodegenerativas, mejorando nuestra comprensión de las respuestas inmunes en la patología del ictus.

Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y...

Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Aprende a visualizar marcadores de microglía/macrófagos en isquemia cerebral mediante inmunofluorescencia e imagen confocal tridimensional en ratón. Este método mejora la resolución espacial y permite asignar correctamente la expresión de marcadores a compartimentos celulares específicos.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

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