Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar y comparar las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes de biopelículas celulares y extracelulares después del tratamiento con agentes antibacterianos. Esto se logra fabricando primero y luego puliendo muestras de compuesto de resina. En el segundo paso, las biopelículas de interés se cultivan en las muestras y luego se tratan con agentes antibacterianos.

A continuación, las biopelículas se tiñen con fluorocromos para sustancias poliméricas extracelulares, ácidos nucleicos y proteínas, y luego se obtienen imágenes mediante microscopía de barrido láser confocal. En el paso final, se reconstruyen las imágenes tridimensionales de los fluorocromos superpuestos para facilitar la visualización simultánea de los componentes de la biopelícula y se calculan los parámetros estructurales a partir de las imágenes de la biopelícula. En última instancia, se puede realizar un análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula, como el volumen biológico y el espesor medio de la biopelícula, para comparar las diferencias entre los grupos de tratamiento y control.

La principal ventaja de este procedimiento sobre los métodos existentes es que utiliza técnicas distintas pero interconectadas para caracterizar la distribución de múltiples componentes dentro de la estructura de las biopelículas cultivadas en condiciones específicas, lo que demostrará el procedimiento será el Dr. Fernando Flores, un becario de investigación postdoctoral, y la Sra. Kristen Smart, asistente de investigación de mi laboratorio Para crear las muestras comience colocando un incremento de 0.4 o TPH tres compuesto de resina dental en Fabricación de moldes de acero inoxidable. A continuación, polimerice el primer incremento con una unidad de fotopolimerización LED durante 40 segundos. Después de repetir el procedimiento para el segundo incremento, use una pulidora amoladora semiautomática para pulir las muestras curadas hasta obtener un acabado superficial final aceptable.

Finalmente, esterilice las muestras para que crezca la biopelícula. Primero, inocular una sola colonia de S. mutans en cuatro mililitros de medio de cultivo durante la noche, y luego incubar el cultivo a 37 grados Celsius durante 16 a 18 horas para lograr una densidad óptica de al menos 0,9. A continuación, diluya el cultivo en una proporción de uno a 100 en 10 mililitros de crecimiento de biopelícula.

Transfiera asépticamente las muestras compuestas de resina estériles a placas estériles de 12 pocillos y luego agregue 2,5 mililitros del cultivo diluido a cada uno de los pocillos. Para el tratamiento con enjuague bucal y los grupos de control, agregue 2.5 mililitros de biofilm estéril no inoculado de crecimiento de biopelícula, medio a los pocillos de control de esterilidad, y luego haga crecer las biopelículas a 37 grados Celsius en condiciones micro parafílicas en un agitador a 100 RPM. Después de 24 horas, aspire asépticamente el medio de todos los pocillos y lave cada pocillo dos veces con 2,5 mililitros de PBS estéril aspirando la solución salina después de cada lavado, luego reponga cada pocillo con 2,5 mililitros de medio de crecimiento de biopelícula fresco e incube la placa durante 24 horas adicionales como se acaba de demostrar para un crecimiento total de la biopelícula Duración de 48 horas después de que se complete el crecimiento de la biopelícula, Aspire el medio de crecimiento y luego dispense 2,5 mililitros de enjuague bucal en cada pozo del grupo de tratamiento y 2,5 mililitros de agua ultrapura estéril en el grupo de control.

Agite bien las placas en un agitador orbital a 150 RPM, y luego, después de 60 segundos, aspire tanto el enjuague bucal como el agua ultrapura de los pozos para manchar el componente exo polisacárido de las biopelículas. Incubar cada biofilm con 50 microlitros de conjugado LOR durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. A continuación, lavar las muestras dos veces con 2,5 mililitros de tampón TC aspirando después de cada lavado y teñir los ácidos nucleicos de cada biofilm con una gota de 50 microlitros de cyto nine durante 30 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz.

Después de lavar las muestras dos veces, tiña los componentes proteicos de cada biofilm con 50 microlitros de Cipro rojo durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Después de lavar las muestras tres veces, transfiéralas a pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contiene seis mililitros de agua ultrapura estéril por pocillo para facilitar su visualización por microscopía confocal para adquirir imágenes de cada una de las tinciones componentes dentro de las biopelículas de los grupos de tratamiento y control. Ajuste los láseres de un microscopio de barrido láser confocal a los siguientes ajustes para la detección de exo polisacáridos mediante tinción conjugada Exor, utilice un láser de 633 nanómetros y una banda de emisión de 659 a 749 nanómetros para la detección de ácidos nucleicos mediante tinción de citonueve.

Utilice un láser de 488 nanómetros y una banda de emisión de 495 a 500 nanómetros, y para la detección de proteínas mediante tinción roja de Cipro, utilice un láser de 543 nanómetros y una banda de emisión de 615 a 651 nanómetros. A continuación, utilice una lente de inmersión de 63x con una apertura numérica de 0,9 y una distancia de trabajo de 2,2 milímetros. Recopile imágenes de microscopía de escaneo láser confocal a 400 hercios mediante el escaneo secuencial en el modo entre pilas para optimizar la captura de imágenes de múltiples tinciones dentro de la misma biopelícula.

Después de analizar las imágenes de microscopía de escaneo láser confocal, utilice la opción de menú del renderizador 3D en el software de análisis de imágenes de velocidad para crear una imagen 3D reconstruida de las manchas de los componentes superpuestos dentro de cada biopelícula. A continuación, gire la imagen 3D para obtener una vista óptima de la biopelícula. A continuación, capture una instantánea de la reconstrucción de la biopelícula y exporte la instantánea en un formato de archivo de imagen adecuado.

Por último, se realiza un análisis visual de la distribución concurrente de los componentes del ácido nucleico y las proteínas del exo polisacárido dentro de las biopelículas. En las imágenes reconstruidas, calcule los parámetros estructurales de la biopelícula, como el volumen de la biopelícula y el espesor medio de la biopelícula, utilizando el software ISA 3D en esta tabla, se muestran los valores medios y de desviación estándar de los parámetros estructurales de la biopelícula calculados mediante el software de análisis estadístico. Los valores medios y de desviación estándar de los parámetros estructurales de las biopelículas tratadas con enjuague bucal que diferían significativamente de los de las biopelículas del grupo control se destacan en modelos mixtos rojos.

Los análisis estadísticos demostraron que el enjuague bucal Biotene PBF produjo estructuras de biopelícula que diferían significativamente del grupo de control en ambos compuestos de resina, mientras que el enjuague bucal Listerine total care no produjo diferencias significativas en ninguno de los compuestos de resina, lo que indica claramente diferencias en los componentes de la biopelícula celular y extracelular que quedan después de los dos tratamientos de enjuague bucal. La distribución concurrente de exo polisacáridos, ácidos nucleicos y proteínas dentro de las biopelículas se puede visualizar a través de reconstrucciones 3D generadas utilizando software de velocidad. En esta figura, se muestra una reconstrucción representativa de las biopelículas del grupo control cultivadas en 0.4 donde se asignó el color azul al exo polisacárido.

Dentro de las biopelículas de S. mutans, el color verde se asignó a los ácidos nucleicos y el color rojo a las proteínas. El espacio intermedio puede estar ocupado por agua u otros componentes de la biopelícula que no han sido marcados con fluorescencia. En esta figura, se muestra una reconstrucción representativa de biopelículas del grupo de control cultivadas en tres compuestos de resina TPH con los colores que representan los mismos componentes que la figura anterior.

Este procedimiento se ha aplicado en una variedad de disciplinas, como las ciencias médicas, dentales, geológicas y marinas. Ya que muchos sustratos y biopelículas pueden ser sustituidos por los utilizados aquí.