Name: Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a cuantificar componentes celulares y extracelulares de biofilms en tres dimensiones mediante microscopía confocal láser y análisis estadístico. Este protocolo permite evaluar efectos de agentes antibacterianos en estructuras microbianas.

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La financiación para este estudio fue proporcionada por la subvención 1R15DE019566-01A1 de los Institutos Nacionales de Salud/NIDCR. Jim Henthorn (Laboratorio de Citometría de Flujo e Imagen de OUHSC) es reconocido por brindar asistencia técnica con microscopía de escaneo láser confocal. Se reconoce al Dr. Fernando Esteban Florez (Departamento de Materiales Odontológicos) por brindar asistencia técnica durante la filmación de este video.

1. Preparación de medios y reactivos
<ol>
	<li>Prepare 300 ml de medio de cultivo nocturno (THY; caldo Todd Hewitt al 3%, preparado según las instrucciones del fabricante, suplementado con extracto de levadura al 0,3% en agua ultrapura) y esterilice en autoclave. Almacene a temperatura ambiente hasta por 2 meses.</li>
	<li>Prepare 1 L de agar THY (caldo Todd Hewitt al 3%, extracto de levadura al 0,3% y agar al 1,5% en agua ultrapura), esterilice en autoclave y enfríe hasta 60 °C antes de verter en placas de Petri. Almacene a 4 °C hasta por 3 meses.</li>
	<li>Prepare 150 ml de medio de crecimiento de biopelícula (TY 0,5X suplementado con sacarosa 10 mM; triptona al 1,5%, extracto de levadura al 0,5% y sacarosa 10 mM en agua ultrapura) y esterilice por filtración. Almacene a temperatura ambiente hasta por 1 mes.</li>
	<li>Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfatos (PBS; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 en agua ultrapura) y esterilice en autoclave. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.</li>
	<li>Prepare 600 ml de tampón Tris-HCl 10 mM, suplementado con CaCl2 10 mM en agua ultrapura (tampón TC; pH 7,2) y esterilice en autoclave. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.</li>
	<li>Esterilice en autoclave 1 L de agua ultrapura. Almacene a temperatura ambiente durante varios meses.</li>
</ol>
2. Fabricación de la muestra
<ol>
	<li>Elabore especímenes en forma de disco de los composites dentales de resina Point 4 (PF) y TPH3 (TP) en un molde personalizado de acero inoxidable en dos incrementos. Cada incremento se polimeriza con luz durante 40 s utilizando una unidad de polimerización con luz LED. Los dos productos tienen composiciones y niveles de relleno ligeramente diferentes, y por lo tanto producen topografías superficiales distintas sobre las cuales se desarrollarán los biofilms.
	<ol>
		<li>Los especímenes de los sustratos relevantes podrían elaborarse utilizando protocolos establecidos de otras disciplinas en lugar del paso 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Termine y pula los especímenes hasta obtener un acabado superficial final aceptable, por ejemplo, utilizando una politriz-lija semiautomática. Enjuague los especímenes pulidos con agua ultrapura y séquelos con aire comprimido.</li>
	<li>Sterilice los especímenes utilizando gas de óxido de etileno o un método de esterilización alternativo.</li>
</ol>
3. Crecimiento del biofilm
<ol>
	<li>Inocular una colonia individual de S. mutans en 4 ml de medio de cultivo nocturno (paso 1.1). Incubar durante la noche a 37 °C durante 16-18 h. La densidad óptica (OD600) del cultivo debe ser ≥0,9.
	<ol>
		<li>Es preferible utilizar una colonia procedente de cultivos en placa que hayan sido pasados dos veces a partir de un stock original, ya que esto da lugar a un crecimiento de biofilm más consistente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparar una dilución 1:100 utilizando el cultivo nocturno (paso 1.1) en 10 ml de medio de crecimiento de biofilm (paso 1.3).</li>
	<li>Transferir especímenes estériles de composite resinoso (por ejemplo, PF, TP) a placas estériles de 12 pocillos.</li>
	<li>Añadir 2,5 ml de medio de cultivo diluido (paso 3.2) a los pocillos destinados a los grupos de tratamiento (enjuague bucal) y control. Añadir 2,5 ml de medio de crecimiento de biofilm estéril sin inocular a los pocillos de control de esterilidad.</li>
	<li>Crecer los biofilms en condiciones microaerófilas. Colocar las placas en un agitador a 100 rpm dentro de un incubador a 37 °C durante 24 h.</li>
	<li>Tras 24 h, aspirar asépticamente el medio de todos los pocillos y lavar dos veces con PBS estéril (paso 1.4; 2,5 ml/pocillo), aspirando el PBS tras cada lavado. Reponer 2,5 ml de medio fresco de crecimiento de biofilm en cada pocillo e incubar durante 24 h adicionales en condiciones idénticas a las del paso anterior, para un tiempo total de crecimiento del biofilm de 48 h.</li>
	<li>En lugar de los pasos anteriores, se podrían cultivar biofilms de otras especies sobre sustratos utilizando protocolos establecidos.</li>
</ol>
4. Tratamientos antibacterianos/enjuagues bucales
<ol>
	<li>Aspire el medio una vez completado el crecimiento del biofilm.</li>
	<li>Añada 2,5 ml de enjuague bucal Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), u otra modalidad de tratamiento, en los pocillos para los grupos de tratamiento, y añada 2,5 ml de agua estéril ultrapura en el pocillo del grupo control. Sumerja los especímenes durante 60 segundos, según las instrucciones del fabricante, agitando las placas en un agitador orbital a 150 rpm. Inmediatamente aspire tanto el enjuague bucal como el agua ultrapura de los pocillos.</li>
	<li>Lave los especímenes 5 veces durante 15 segundos por lavado con agua estéril ultrapura en el agitador orbital a 150 rpm, aspirando el agua después de cada paso de lavado.</li>
	<li>En lugar de los pasos anteriores, se podrían probar otros agentes antibacterianos utilizando protocolos establecidos.</li>
</ol>
5. Tinción
<ol>
	<li>Preparar las diluciones de colorantes para el análisis de biopelículas.
	<ol>
		<li>Preparar una solución stock de 5 mg/ml de Concanavalina A, conjugado con Alexa Fluor 647 (AF) en bicarbonato de sodio 0,1 M pH 8,3. Almacenar a -20 °C en alícuotas de un solo uso durante varios meses, ya que se desaconseja el congelado y descongelado repetido. Usando esta solución stock de AF, preparar una dilución de 250 μg/ml en tampón TC.</li>
		<li>Preparar una dilución de 10 μM utilizando la solución stock de Syto 9 5 mM (SY), tal como se proporciona por el fabricante, en tampón TC. Almacenar la solución stock de SY restante a -20 °C durante varios meses.</li>
		<li>Preparar una dilución 10x utilizando la solución stock de Sypro Red 5.000x (SR), tal como se proporciona por el fabricante, en agua estéril ultrapura. Almacenar la solución stock de SR restante a -20 °C durante varios meses.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lavar todas las biopelículas 2 veces con tampón TC (2,5 ml/pocillo) mediante un movimiento giratorio manual, dejando el segundo lavado en la placa durante 30 min a temperatura ambiente. Aspirar.</li>
	<li>Colocar una gota de 50 μl del colorante AF sobre cada muestra de biopelícula. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 2 veces con tampón TC (2,5 ml/pocillo), aspirando tras cada lavado.</li>
	<li>Aplicar posteriormente una gota de 50 μl del colorante SY sobre cada muestra de biopelícula. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 2 veces con agua estéril ultrapura (2,5 ml/pocillo), aspirando tras cada lavado.</li>
	<li>Finalmente, colocar una gota de 50 μl del colorante SR sobre cada muestra de biopelícula. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar 3 veces con agua estéril ultrapura (2,5 ml/pocillo), aspirando tras cada lavado.</li>
	<li>Transferir las muestras a una placa de 6 pocillos, colocando una muestra por pocillo en 6 ml de agua estéril ultrapura para facilitar la microscopía confocal.</li>
</ol>
6. Imagen mediante microscopía confocal de barrido con láser
<ol>
	<li>Adquiera imágenes de cada componente (tinción) dentro de los biofilms de los grupos de tratamiento y control utilizando un microscopio confocal de barrido láser con los ajustes mostrados en la Tabla 1. En este estudio se utilizó un objetivo de inmersión de 63X con una apertura numérica de 0,9 y una distancia de trabajo de 2,2 mm. 
	<img alt="Cuadro de tinción de biofilms; longitudes de onda del láser (nm) y bandas de emisión (nm) para EPS, ácidos nucleicos y proteínas." fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabla 1"> 
	Tabla 1. Ajustes del microscopio confocal de barrido láser.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>Establezca el tamaño de escaneo en 250 μm x 250 μm y una resolución mínima de píxeles de 512 x 512 para adquirir imágenes de microscopía confocal (CLSM) con una resolución adecuada para análisis cuantitativo.</li>
	<li>Utilice la tinción SY para definir los puntos superior e inferior del conjunto de imágenes del biofilm, luego ajuste el paso en z para que sea adecuado para el análisis cuantitativo (0,6 μm en este estudio). Antes de recopilar un escaneo, optimice los parámetros de la imagen y de la tinción (es decir, voltaje y desplazamiento del PMT) utilizando la opción QLUT. Se utilizó una tabla de consulta de color para asignar pseudocolores a cada tinción (verde para SY, rojo para SR y azul para AF) con el fin de hacer que cada componente del biofilm sea más distinguible en la reconstrucción 3D.</li>
	<li>Recopile imágenes de CLSM a 400 Hz utilizando escaneo secuencial en el modo "entre pilas" para optimizar la captura de imágenes de múltiples tinciones dentro del mismo biofilm.</li>
</ol>
7. Análisis estructural de biopelículas
<ol>
	<li>Analice las imágenes de microscopía confocal (CLSM) recopiladas mediante software de análisis de imágenes para biofilms. Los siguientes pasos describen el uso del software ISA3D12 para calcular los parámetros estructurales de las imágenes de biofilm obtenidas.
	<ol>
		<li>Copie los archivos de imágenes CLSM de cada biofilm a la carpeta Imágenes, según se especifica en el manual del software. Asegúrese de seguir la convención de nomenclatura para los archivos CLSM exigida por el software. El software permite analizar archivos dentro de subcarpetas en modo por lotes, lo que facilita el análisis de biofilms de grupos de tratamiento y control en la misma ejecución.</li>
		<li>Introduzca las dimensiones de los ejes x, y y z de las imágenes CLSM en los campos dxy y dz del cuadro de diálogo principal. Seleccione la umbralización y la configuración de mapeo de distancias, como se describe en el manual del software (en este estudio se utilizaron Otsu y Euclídea cuasi, respectivamente). Ingrese un nombre adecuado para el archivo de resultados y luego ejecute el programa. Se generará un archivo de resultados en la carpeta ISA.</li>
		<li>Revise el archivo de resultados para obtener los valores de veinte parámetros estructurales tridimensionales12, como el biolumen y el espesor medio del biofilm (medidos en este estudio), que cuantifican la distribución tridimensional de cada componente (tinción) dentro del biofilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Visualización de la estructura del biofilm
<ol>
	<li>Cree una reconstrucción de los componentes superpuestos (tinciones) dentro de cada biopelícula utilizando software de análisis de imágenes. Los siguientes pasos describen el uso del software Volocity para crear reconstrucciones 3D.
	<ol>
		<li>Cree una biblioteca para cada biopelícula copiando los archivos de imágenes de microscopía confocal láser (CLSM) en el software, como se describe en el manual.</li>
		<li>Utilice la opción del menú Renderizador 3D para producir una imagen reconstruida en 3D a partir de las imágenes CLSM de cada biopelícula (en este estudio se utilizó el formato HR Opacity).</li>
		<li>Gire la imagen 3D para orientar todas las biopelículas de manera similar con respecto a los ejes coordenados x, y y z. Capture una instantánea de la reconstrucción de la biopelícula correctamente orientada y luego exporte la imagen en formato TIFF, JPEG u otro formato adecuado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Realice un análisis visual de la distribución simultánea de los componentes de EPS, proteínas y ácidos nucleicos dentro de las biopelículas en las imágenes reconstruidas.</li>
	<li>Utilice el coeficiente de correlación de Pearson y el coeficiente de superposición de Manders para realizar un análisis de colocalización de múltiples componentes de la biopelícula (en este estudio no se midió la colocalización).</li>
</ol>
9. Análisis estadístico
<ol>
	<li>Utilice análisis estadísticos separados de modelos mixtos para comparar los valores medios de los parámetros estructurales entre los grupos con enjuague bucal y el grupo control (α=0.05). Para este estudio, se utilizó el software SAS para realizar el análisis estadístico.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. La producción y el acceso gratuito a este artículo están patrocinados por Leica Microsystems.

La adquisición de imágenes CLSM debe realizarse en la forma y el formato necesarios para la cuantificación de biopelículas y para el análisis de colocalización, de modo que la distribución de la intensidad de la señal en cada imagen sea una representación confiable de la distribución de cada fluorocromo en la pila de biopelículas. La intensidad de la señal debe distinguirse del ruido y el fondo10,11, no verse afectada por la autofluorescencia del sustrato y tener un sangrado mínimo debido a la interferencia espectral entre los fluorocromos utilizados11. El ruido es una limitación inevitable de la microscopía de fluorescencia11, y la calidad de la imagen a veces puede verse limitada por razones técnicas o logísticas. La identificación de fluorocromos con una superposición espectral mínima es fundamental para el éxito de este método, pero puede ser complicada. Además, la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. Por lo tanto, no es sorprendente que muy pocas investigaciones hayan cuantificado con éxito la distribución concurrente de más de dos componentes dentro de las estructuras de las biopelículas.
El objetivo de este estudio fue reportar una metodología que consiste en pasos distintos pero interconectados para la cuantificación y comparación de las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares y extracelulares dentro de las biopelículas. El ensayo de crecimiento de biopelícula descrito permite el crecimiento de biopelículas en sustratos relevantes y produce estructuras de biopelículas que son reproducibles, como lo demuestran los resultados informados en la Tabla 1. La combinación de una nueva tinción simultánea de componentes de EPS, proteínas y ácidos nucleicos con la medición de parámetros estructurales de biopelículas 3D da como resultado distribuciones cuantificables de componentes dentro de las biopelículas. El análisis visual cualitativo de la distribución simultánea de EPS, proteínas y ácido nucleico dentro de las biopelículas es posible mediante la reconstrucción de tinciones superpuestas dentro de cada biopelícula. El software ISA3D12 contiene varios parámetros estructurales únicos, como la dimensión fractal, la homogeneidad y el coeficiente de rugosidad de la biopelícula, además de parámetros medidos tradicionalmente, como la porosidad y el espesor de la biopelícula, para mejorar la cuantificación de las estructuras 3D de las biopelículas. El análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula facilita comparaciones relevantes de las biopelículas en condiciones experimentales específicas, como la eficacia antibacteriana/antiincrustante (por ejemplo, después del tratamiento con enjuagues bucales) o a lo largo del tiempo (efectos temporales).
Esta metodología cuantificó y comparó de manera eficiente y exitosa las distribuciones 3D concurrentes de tres componentes principales dentro de las biopelículas de S. mutans que se cultivaron en sustratos relevantes, superando así dos desafíos para la evaluación simultánea de los componentes de la biopelícula. Este método también se puede utilizar para determinar la eficacia de los tratamientos antibacterianos o las medidas antiincrustantes contra múltiples componentes de biopelícula, como se muestra con enjuagues bucales en este estudio. Además, la mayoría de los protocolos descritos anteriormente pueden sustituirse por protocolos para la fabricación de sustratos relevantes y ensayos de crecimiento de biopelículas de microorganismos relevantes. Por lo tanto, este método tiene una amplia aplicación porque facilita la comparación de estructuras/arquitecturas 3D de biopelículas in vitro e in vivo en una variedad de disciplinas, incluidas las ciencias médicas, dentales, geológicas y marinas.

Las biopelículas son comunidades microbianas estructuradas que están encapsuladas en una matriz extracelular autoproducida y se adhieren a superficies biológicas o inertes1. Las biopelículas representan un estilo de vida común para muchas bacterias, y se forman mediante la transición en etapas de células que flotan libremente (planctónicas) a comunidades complejas de múltiples especies. La resistencia inherente de los biofilms a los agentes antimicrobianos está en la raíz de muchas infecciones bacterianas persistentes y crónicas1,2, como lo demuestran los biofilms orales (placa dental). Los microorganismos cariogénicos, como los estreptococos mutans, procesan la sacarosa y otros carbohidratos para producir una matriz extracelular y generar ácidos que pueden desmineralizar la estructura dental y causar caries dental. La mayoría de las matrices de biopelículas son biopolímeros que constan de componentes celulares y extracelulares como exopolisacáridos (EPS), proteínas y ácidos nucleicos3,4.
La microscopía de barrido láser confocal (CLSM), la técnica más utilizada para la obtención de imágenes de fluorescencia, ha transformado radicalmente la imagen óptica en biología porque tiene la capacidad de recoger imágenes 3D de estructuras biológicas hidratadas sin fijación5,6,7. Esta técnica no destructiva consiste en recolectar imágenes de secciones delgadas dentro de una región de interés en el espécimen de tal manera que se elimina la contribución de la luz desenfocada. La calidad y resolución de las imágenes capturadas por CLSM está más allá de lo que se puede lograr con microscopía de fluorescencia de campo amplio. Uno de los principales inconvenientes del CLSM es que el escaneo de imágenes se realiza a un ritmo más lento que con las técnicas de microscopía de campo amplio, en las que se recogen imágenes completas simultáneamente5. Sin embargo, con una selección cada vez más amplia de fluorocromos, láseres y filtros, el CLSM se ha convertido en una de las técnicas predominantes para la obtención de imágenes multiespectrales5,7.
Estudios previos han demostrado que CLSM es una herramienta útil para examinar la estructura o arquitectura de las biopelículas mediante el uso de una o dos etiquetas o tinciones fluorescentes para proporcionar una mejor comprensión de la distribución de EPS y células dentro de las biopelículas, y especialmente dentro de la matriz extracelular7,8. En teoría, la tinción/marcaje fluorescente de múltiples componentes es deseable para explorar la estructura detallada y la colocalización de componentes celulares y extracelulares dentro de las biopelículas. Sin embargo, el análisis simultáneo de varios componentes dentro de las biopelículas puede ser un desafío porque: 1) la selección de colorantes fluorescentes que tienen una superposición espectral mínima es complicada, y 2) la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. La colocalización con múltiples fluorocromos requiere el uso de tinciones altamente específicas con una interferencia espectral mínima para evitar cualquier efecto de sangrado, que ocurre cuando dos fluorocromos tienen una superposición significativa en su pico espectral, lo que hace que uno se excite más fuertemente que el otro9. Idealmente, los fluorocromos que tienen espectros de excitación que no se superponen proporcionarían los mejores resultados, sin embargo, es muy difícil encontrar tinciones que cumplan con este criterio. En su lugar, la selección de las tinciones se optimiza eligiendo fluorocromos cuyos espectros de emisión tienen una superposición mínima, lo que permite ver las tinciones una por una dentro de una banda de longitud de onda de observación limitada9.
La superposición de imágenes de fluorescencia es probablemente el método más utilizado para evaluar la distribución concurrente de fluorocromos. La colocalización de los diversos componentes aparece como una superposición de diferentes colores a través de múltiples canales creados por los fluorocromos que se están examinando10. Las herramientas para mostrar imágenes de fluorescencia multicanal como imágenes en color combinadas están disponibles en la mayoría de los programas CLSM y de análisis de imágenes biológicas. Aunque la superposición de imágenes es útil para la evaluación espacial de la colocalización, las imágenes solo pueden examinarse cualitativamente mediante análisis visual. Esto proporciona una cantidad limitada de información, ya que estas representaciones generalmente no son útiles para cuantificar la colocalización en diferentes condiciones experimentales ni determinan si la colocalización excede la coincidencia aleatoria11. Hasta ahora, muy pocas investigaciones han utilizado métodos cuantitativos para analizar la estructura tridimensional de las biopelículas y sus componentes, y aún menos han cuantificado el efecto de los tratamientos antibacterianos o las medidas antiincrustantes en los componentes de las biopelículas.
El objetivo de este estudio fue reportar una metodología para la cuantificación y comparación de las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares y extracelulares de biofilms. El método consta de pasos distintos pero interconectados que involucran el crecimiento de la biopelícula, la tinción, la obtención de imágenes CLSM de las biopelículas, el análisis y la visualización estructural de la biopelícula y el análisis estadístico de los parámetros estructurales. El ensayo de crecimiento de biopelícula permite el crecimiento de biopelícula en sustratos relevantes y produce estructuras de biopelícula que son reproducibles. La combinación de la novedosa tinción simultánea de componentes de EPS, proteínas y ácidos nucleicos con la medición de los parámetros estructurales de la biopelícula en 3D da como resultado distribuciones cuantificables de los componentes dentro de las biopelículas. El análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula facilita la evaluación de las biopelículas en condiciones experimentales específicas (por ejemplo, después del tratamiento con enjuagues bucales), como se describirá en la siguiente sección.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Todd Hewitt Caldo</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura, granulado</td><td>EMD Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Sacarosa</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, reactivo ACS, 99.0-100.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico, &ge; 99.0%, ACS reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, monobásico, monohidrato</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano, 99.8+%, reactivo ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647</td><td>Convitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 o S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave; ne PBF Enjuague Bucal</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Listerine Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) es una poderosa herramienta para la investigación de biopelículas. Muy pocas investigaciones han cuantificado con éxito la distribución concurrente de más de dos componentes dentro de las biopelículas porque: 1) la selección de colorantes fluorescentes que tienen una superposición espectral mínima es complicada, y 2) la cuantificación de múltiples fluorocromos plantea un problema multifactorial. Objetivos: Informar sobre una metodología para cuantificar y comparar distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes celulares/extracelulares de biopelículas cultivadas en sustratos relevantes. métodos: El método consta de pasos distintos e interconectados que involucran el crecimiento de la biopelícula, la tinción, las imágenes CLSM, el análisis y la visualización estructural de la biopelícula y el análisis estadístico de los parámetros estructurales. Las biopelículas de Streptococcus mutans (cepa UA159) se cultivaron durante 48 horas en muestras estériles de compuestos de resina Point 4 y TPH3. Posteriormente, las muestras se sumergieron durante 60 segundos en enjuagues bucales Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), o en agua (grupo de control; n = 5/grupo). Las biopelículas se tiñeron con fluorocromos para sustancias poliméricas extracelulares, proteínas y ácidos nucleicos antes de obtener imágenes con CLSM. Los parámetros estructurales de la biopelícula calculados con el software de análisis de imágenes ISA3D fueron el biovolumen y el espesor medio de la biopelícula. Los análisis estadísticos de modelos mixtos compararon los parámetros estructurales entre los grupos de enjuague bucal y control (software SAS; α=0,05). El software Volocity permitió la visualización de distribuciones 3D de componentes de biopelícula superpuestos (fluorocromos). Resultados: El enjuague bucal BIO produjo estructuras de biofilm que difirieron significativamente del control (p<0.05) en ambos compuestos de resina, mientras que LTO no produjo diferencias (p>0.05) en ninguno de los productos. Conclusiones: Esta metodología cuantificó y comparó de manera eficiente y exitosa las distribuciones 3D concurrentes de tres componentes principales dentro de las biopelículas de S. mutans en sustratos relevantes, superando así dos desafíos para la evaluación simultánea de los componentes de la biopelícula. Este método también se puede utilizar para determinar la eficacia de los agentes antibacterianos/antiincrustantes contra múltiples componentes de la biopelícula, como se muestra mediante enjuagues bucales. Además, este método tiene una amplia aplicación porque facilita la comparación de las estructuras/arquitectura 3D de las biopelículas en una variedad de disciplinas.

Los resultados representativos de los tratamientos (enjuagues bucales) y del grupo control sin tratar se muestran en la Tabla 2 y en las Figuras 1 y 2. La Tabla 2 muestra los valores medios y las desviaciones estándar de los parámetros estructurales del biofilm: biovolumen (μm3) y espesor medio del biofilm (μm), calculados mediante el software ISA3D. Los parámetros estructurales de los biofilms tratados con enjuague bucal que difirieron significativamente de los del grupo control (p&lt;0,05) tienen sus valores medios y desviaciones estándar resaltados en rojo. Los resultados de los análisis estadísticos mediante modelos mixtos demostraron que el enjuague bucal BIO produjo estructuras de biofilm que difirieron significativamente del control (p&lt;0,05) en ambos compuestos de resina, mientras que el enjuague bucal LTO no produjo diferencias significativas (p&gt;0,05) en ninguno de los compuestos de resina. Los resultados muestran claramente que los componentes celulares y extracelulares del biofilm restantes tras los dos tratamientos con enjuague bucal fueron diferentes. También debe señalarse que los biofilms de S. mutans cultivados sobre los dos sustratos (PF y TP) presentaron diferencias en su estructura tridimensional, aunque se cultivaron en condiciones similares y ambos sustratos se pulieron con abrasivos semejantes.
La distribución simultánea de EPS, proteínas y ácidos nucleicos dentro de los biofilms puede visualizarse mediante reconstrucciones 3D generadas usando el software Volocity. Figuras 1 y 2 muestran reconstrucciones representativas de biofilms del grupo control cultivados sobre composites de resina PF y TP, respectivamente. La tinción azul representa EPS dentro de los biofilms de S. mutans, la tinción verde demuestra ácidos nucleicos, y la tinción roja muestra proteínas. El espacio intermedio puede estar ocupado por agua u otros componentes del biofilm no marcados con fluorescencia.
<img alt="Gráfico de dispersión 3D, visualización dinámica de datos, gráfica, herramienta interactiva de investigación, pantalla de análisis." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Una reconstrucción tridimensional representativa del biofilm de S. mutans cultivado sobre composite resinoso PF en el grupo control (no tratado con enjuague bucal). La superposición simultánea de los tres colorantes dentro de un único biofilm permite la visualización simultánea de los componentes de EPS (tinción azul), ácido nucleico (tinción verde) y proteína (tinción roja) en los biofilms de S. mutans. (1 Unidad = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura en tamaño ampliado</a>.
<img alt="visualización de estructura celular 3D, microscopía de fluorescencia, análisis de datos espaciales, gráfico científico." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Una reconstrucción tridimensional representativa del biofilm de S. mutans cultivado sobre composite resinoso TP en el grupo control (no tratado con enjuague bucal). La superposición simultánea de los tres colorantes dentro de un único biofilm permite la visualización conjunta de los componentes de EPS (tinción azul), ácidos nucleicos (tinción verde) y proteínas (tinción roja) en los biofilms de S. mutans. (1 Unidad = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura ampliada</a>.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compuesto de resina</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Point 4</td>
			<td colspan="2">TPH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enjuague bucal</td>
			<td>Componente</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotène PBF</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>279,517±53,291</td>
			<td>9,32±2,80</td>
			<td>195,033±42,014</td>
			<td>7,45±3,70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>344,902±56,386</td>
			<td>35,22±17,19</td>
			<td>197,840±62,351</td>
			<td>9,83±7,26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>298,796±62,868</td>
			<td>54,21±21,65</td>
			<td>216,033±66,654</td>
			<td>24,33±39,64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listerine Total Care</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>355,707±110,444</td>
			<td>26,45±14,21</td>
			<td>273,296±47,323</td>
			<td>13,43±2,89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>494,099±180,592</td>
			<td>64,90±26,68</td>
			<td>329,150±47,145</td>
			<td>34,35±30,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>348,416±161,316</td>
			<td>58,68±47,28</td>
			<td>303,150±54,705</td>
			<td>34,18±41,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control (sin tratar)</td>
			<td>Ácidos nucleicos</td>
			<td>388,375±42,152</td>
			<td>51,15±40,66</td>
			<td>327,809±39,400</td>
			<td>17,08±1,65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>660,448±173,197</td>
			<td>91,37±74,84</td>
			<td>363,850±67,612</td>
			<td>28,33±15,07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Proteínas</td>
			<td>517,274±119,475</td>
			<td>127,96±73,84</td>
			<td>353,161±56,518</td>
			<td>21,17±4,41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Valores de media y desviación estándar del Biovolumen (BV) y del Grosor medio del biofilm (MT) de biofilms tratados con BIO o LTO, o dejados sin tratar (grupo control). Los parámetros estructurales de los biofilms tratados con enjuagues bucales que difirieron significativamente de los biofilms del grupo control (p&lt;0,05) tienen los valores de media y desviación estándar resaltados en rojo.

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar y comparar las distribuciones tridimensionales concurrentes de tres componentes de biopelículas celulares y extracelulares después del tratamiento con agentes antibacterianos. Esto se logra fabricando primero y luego puliendo muestras de compuesto de resina. En el segundo paso, las biopelículas de interés se cultivan en las muestras y luego se tratan con agentes antibacterianos.A continuación, las biopelículas se tiñen con fluorocromos para sustancias poliméricas extracelulares, ácidos nucleicos y proteínas, y luego se obtienen imágenes mediante microscopía de barrido láser confocal. En el paso final, se reconstruyen las imágenes tridimensionales de los fluorocromos superpuestos para facilitar la visualización simultánea de los componentes de la biopelícula y se calculan los parámetros estructurales a partir de las imágenes de la biopelícula. En última instancia, se puede realizar un análisis estadístico de los parámetros estructurales de la biopelícula, como el volumen biológico y el espesor medio de la biopelícula, para comparar las diferencias entre los grupos de tratamiento y control.La principal ventaja de este procedimiento sobre los métodos existentes es que utiliza técnicas distintas pero interconectadas para caracterizar la distribución de múltiples componentes dentro de la estructura de las biopelículas cultivadas en condiciones específicas, lo que demostrará el procedimiento será el Dr. Fernando Flores, un becario de investigación postdoctoral, y la Sra. Kristen Smart, asistente de investigación de mi laboratorio Para crear las muestras comience colocando un incremento de 0.4 o TPH tres compuesto de resina dental en Fabricación de moldes de acero inoxidable. A continuación, polimerice el primer incremento con una unidad de fotopolimerización LED durante 40 segundos. Después de repetir el procedimiento para el segundo incremento, use una pulidora amoladora semiautomática para pulir las muestras curadas hasta obtener un acabado superficial final aceptable.Finalmente, esterilice las muestras para que crezca la biopelícula. Primero, inocular una sola colonia de S. mutans en cuatro mililitros de medio de cultivo durante la noche, y luego incubar el cultivo a 37 grados Celsius durante 16 a 18 horas para lograr una densidad óptica de al menos 0,9. A continuación, diluya el cultivo en una proporción de uno a 100 en 10 mililitros de crecimiento de biopelícula.Transfiera asépticamente las muestras compuestas de resina estériles a placas estériles de 12 pocillos y luego agregue 2,5 mililitros del cultivo diluido a cada uno de los pocillos. Para el tratamiento con enjuague bucal y los grupos de control, agregue 2.5 mililitros de biofilm estéril no inoculado de crecimiento de biopelícula, medio a los pocillos de control de esterilidad, y luego haga crecer las biopelículas a 37 grados Celsius en condiciones micro parafílicas en un agitador a 100 RPM. Después de 24 horas, aspire asépticamente el medio de todos los pocillos y lave cada pocillo dos veces con 2,5 mililitros de PBS estéril aspirando la solución salina después de cada lavado, luego reponga cada pocillo con 2,5 mililitros de medio de crecimiento de biopelícula fresco e incube la placa durante 24 horas adicionales como se acaba de demostrar para un crecimiento total de la biopelícula Duración de 48 horas después de que se complete el crecimiento de la biopelícula, Aspire el medio de crecimiento y luego dispense 2,5 mililitros de enjuague bucal en cada pozo del grupo de tratamiento y 2,5 mililitros de agua ultrapura estéril en el grupo de control.Agite bien las placas en un agitador orbital a 150 RPM, y luego, después de 60 segundos, aspire tanto el enjuague bucal como el agua ultrapura de los pozos para manchar el componente exo polisacárido de las biopelículas. Incubar cada biofilm con 50 microlitros de conjugado LOR durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. A continuación, lavar las muestras dos veces con 2,5 mililitros de tampón TC aspirando después de cada lavado y teñir los ácidos nucleicos de cada biofilm con una gota de 50 microlitros de cyto nine durante 30 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz.Después de lavar las muestras dos veces, tiña los componentes proteicos de cada biofilm con 50 microlitros de Cipro rojo durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Después de lavar las muestras tres veces, transfiéralas a pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contiene seis mililitros de agua ultrapura estéril por pocillo para facilitar su visualización por microscopía confocal para adquirir imágenes de cada una de las tinciones componentes dentro de las biopelículas de los grupos de tratamiento y control. Ajuste los láseres de un microscopio de barrido láser confocal a los siguientes ajustes para la detección de exo polisacáridos mediante tinción conjugada Exor, utilice un láser de 633 nanómetros y una banda de emisión de 659 a 749 nanómetros para la detección de ácidos nucleicos mediante tinción de citonueve.Utilice un láser de 488 nanómetros y una banda de emisión de 495 a 500 nanómetros, y para la detección de proteínas mediante tinción roja de Cipro, utilice un láser de 543 nanómetros y una banda de emisión de 615 a 651 nanómetros. A continuación, utilice una lente de inmersión de 63x con una apertura numérica de 0,9 y una distancia de trabajo de 2,2 milímetros. Recopile imágenes de microscopía de escaneo láser confocal a 400 hercios mediante el escaneo secuencial en el modo entre pilas para optimizar la captura de imágenes de múltiples tinciones dentro de la misma biopelícula.Después de analizar las imágenes de microscopía de escaneo láser confocal, utilice la opción de menú del renderizador 3D en el software de análisis de imágenes de velocidad para crear una imagen 3D reconstruida de las manchas de los componentes superpuestos dentro de cada biopelícula. A continuación, gire la imagen 3D para obtener una vista óptima de la biopelícula. A continuación, capture una instantánea de la reconstrucción de la biopelícula y exporte la instantánea en un formato de archivo de imagen adecuado.Por último, se realiza un análisis visual de la distribución concurrente de los componentes del ácido nucleico y las proteínas del exo polisacárido dentro de las biopelículas. En las imágenes reconstruidas, calcule los parámetros estructurales de la biopelícula, como el volumen de la biopelícula y el espesor medio de la biopelícula, utilizando el software ISA 3D en esta tabla, se muestran los valores medios y de desviación estándar de los parámetros estructurales de la biopelícula calculados mediante el software de análisis estadístico. Los valores medios y de desviación estándar de los parámetros estructurales de las biopelículas tratadas con enjuague bucal que diferían significativamente de los de las biopelículas del grupo control se destacan en modelos mixtos rojos.Los análisis estadísticos demostraron que el enjuague bucal Biotene PBF produjo estructuras de biopelícula que diferían significativamente del grupo de control en ambos compuestos de resina, mientras que el enjuague bucal Listerine total care no produjo diferencias significativas en ninguno de los compuestos de resina, lo que indica claramente diferencias en los componentes de la biopelícula celular y extracelular que quedan después de los dos tratamientos de enjuague bucal. La distribución concurrente de exo polisacáridos, ácidos nucleicos y proteínas dentro de las biopelículas se puede visualizar a través de reconstrucciones 3D generadas utilizando software de velocidad. En esta figura, se muestra una reconstrucción representativa de las biopelículas del grupo control cultivadas en 0.4 donde se asignó el color azul al exo polisacárido.Dentro de las biopelículas de S. mutans, el color verde se asignó a los ácidos nucleicos y el color rojo a las proteínas. El espacio intermedio puede estar ocupado por agua u otros componentes de la biopelícula que no han sido marcados con fluorescencia. En esta figura, se muestra una reconstrucción representativa de biopelículas del grupo de control cultivadas en tres compuestos de resina TPH con los colores que representan los mismos componentes que la figura anterior.Este procedimiento se ha aplicado en una variedad de disciplinas, como las ciencias médicas, dentales, geológicas y marinas. Ya que muchos sustratos y biopelículas pueden ser sustituidos por los utilizados aquí.

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