Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar las distintas subpoblaciones de células especializadas que se diferencian en biopelículas del organismo modelo, bacillus subtles. Esto se logra insertando primero reporteros transcripcionales en el cromosoma de los sutiles B. Estos reporteros se expresarán exclusivamente en la subpoblación de células objeto de estudio.

El siguiente paso es promover el desarrollo de una biopelícula mediante el cultivo de sutiles B en el medio inductor de la biopelícula, Sra. GG gg. Después de la formación de la biopelícula, las células de la biopelícula se dispersan y se fijan con paraformaldehído. El paso final del procedimiento es detectar la señal de fluorescencia emitida por células individuales de la comunidad microbiana mediante fluorescencia, microscopía y citometría de flujo.

En última instancia, los resultados muestran cómo las células se especializaron para producir y secretar. Las matrices extracelulares que constituyen el biofilm son una subpoblación diferente a las células que segregan surfactante, la molécula señalizadora responsable de la diferenciación de la subpoblación de productores de matriz. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la cuantificación de la expresión de la transcripción mediante ensayos de Vita Ities o análisis de microrrayos, es que nos permite monitorizar la expresión génica a nivel de una sola célula y visualizar poblaciones de células particularmente pequeñas de células especializadas para expresar un gen específico.

Estas expresiones génicas no se detectarán al analizar la población general. Los plásmidos integrativos se utilizan para marcar sutiles B y aquí se muestra un ejemplo. PTAA, el promotor de los genes responsables de la producción de tass.

Una proteína de la matriz se clona en el vector utilizando los sitios de restricción ECO R uno e Hindi tres. La expresión del gen reportero CFP está ahora bajo el control de ptap A para comenzar el procedimiento de marcaje B, linealizar sutilmente el plásmido integrador por digestión enzimática. La enzima de restricción recomendada es XH oh uno cuando el plásmido integrador está listo, inducir la competencia natural en la cepa B más sutil 1 68 mediante el crecimiento de las células en medio inductor de competencia durante cinco horas a 37 grados Celsius.

Agregue el plásmido linealizado en el cultivo de células B sutiles competentes e incube durante dos horas a 37 grados Celsius después de dos horas, coloque las células en agar con micina spect e incube durante la noche a 37 grados Celsius. El cromosoma B sutiles tiene dos loci neutros, Amy, E, E y LAC A, que se pueden utilizar para integrar fusiones reporteras sin afectar el desarrollo de la biopelícula. El plásmido linealizado PKM 0 0 8 se integra en el genoma de los sutiles B por doble recombinación.

El siguiente paso es transferir el reportero de la cepa marcada a una cepa que sea capaz de formar biopelículas utilizando el protocolo de transducción de un fago. A los efectos de este vídeo, solo se muestran los pasos importantes del protocolo. Cultive la cepa donante 1 68, albergando la fusión reportera en medio TY a 37 grados Celsius hasta que el cultivo alcance la fase estacionaria temprana a 200 microlitros de células a 100 microlitros de stock de fagos diluidos en un tubo de vidrio.

Y pongámonos a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, pipetee agar blando TY caliente en el tubo y mezcle bien mediante vórtice. Extiéndalo suavemente sobre una placa TY fresca e incube a 37 grados centígrados durante ocho a 16 horas para permitir que surjan halos de fagos.

Para recoger los halos de fagos, añada tres mililitros de medio TY a la placa y utilice la pipeta de vidrio para romper el agar superior. Transfiera la suspensión de agar a un tubo de halcón de 15 mililitros. Agite suavemente para romper el agar y luego centrifugue a 1000 G durante 15 minutos.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa puntual de 22 micras. Utilice este sobrenadante para infectar un cultivo de la cepa receptora cultivado en medio TY.

Añadir 30 microlitros de sobrenadante a 10 mililitros de cultivo diluido de uno a 10, e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de eso, centrifugar a 5.000 rpm durante siete minutos, suspender el pellet en 200 microlitros de medio TY y esparcir sobre una placa que contenga micina SPECT más 10 milimolares. Citrato de sodio.

Incubar a 37 grados centígrados durante 12 a 36 horas. Seleccione una colonia y hágala crecer durante la noche en LB líquido a 37 grados centígrados. Finalmente, detecte tres microlitros del cultivo durante la noche en un medio inductor de biopelícula sólida.

Deje que las células crezcan durante 72 horas a 30 grados centígrados. Después de tres días de crecimiento, las biopelículas formadas en la superficie del agar Ms.GG desarrollarán una arquitectura morfológica compleja en la superficie del agar. Para comenzar este procedimiento, use un palillo de dientes o pinzas para eliminar la biopelícula de la superficie del agar MSGG.

La consistencia de la biopelícula debería permitir que se despegue de la superficie del agar. En una sola pieza, coloque la biopelícula en tres mililitros de tampón PBS, disperse la biopelícula por suave. Realice 12 pulsos con una salida de tres y una amplitud de 0,7 segundos para fijar las muestras antes del análisis de una sola célula.

Resus suspende 300 microlitros de la suspensión celular en un mililitro, una solución de aldehído paraformado al 4%, e incuba a temperatura ambiente durante exactamente siete minutos. Después de la fijación de siete minutos, lave las células en el tampón PBS tres veces. Finalmente, resuspenda las células en 300 microlitros de tampón PBS antes de la microscopía de fluorescencia.

Prepare un portaobjetos de microscopio pipeteando 200 microlitros de 0,8%agros sobre el portaobjetos y cubriéndolo cuidadosamente con otro portaobjetos. Después de dos minutos, retire el portaobjetos superior con cuidado para obtener una capa de agros adherida al portaobjetos en el punto inferior. Dos microlitros de células fijadas en la superficie de la capa agros y la cubren con un cubreobjetos de microscopio.

Coloque la muestra en la platina del microscopio de fluorescencia. Establezca el período de excitación de acuerdo con un control negativo que no muestre fluorescencia en las condiciones seleccionadas para el experimento. La exposición debe ser de entre 50 y 200 milisegundos.

Adquiera una imagen de fluorescencia, así como una imagen de campo claro para cada campo de visión. Para preparar las células para el análisis de citometría de flujo, disperse la muestra de células fijas mediante una sonicación suave. Realice dos series de 12 pulsos con una salida de cinco y una amplitud de 0,7 segundos para dispersar los grupos en celdas individuales sin causar lisis celular.

Confirmar la eficacia de la dispersión celular mediante microscopía óptica. A continuación, diluya la muestra uno a 100 en tampón PBS. Para este análisis se utilizará un citómetro de flujo de dos cilindros de fax BD

Para la fluorescencia de CFP se utiliza una excitación láser a 488 nanómetros junto con un filtro 5 30 30. Se utiliza una excitación láser a 405 nanómetros junto con un filtro 4 0 8 40, calibra el citómetro de flujo con dos controles negativos. Una muestra de tampón PBS sin células en suspensión debe servir como control negativo para el tamaño de la partícula detectado por el citómetro de flujo.

Una muestra sin un indicador fluorescente debe servir como control negativo de la sensibilidad fluorescente del flujo. Citómetro después de la calibración, coloque la muestra marcada con un indicador fluorescente en el citómetro de flujo para cada muestra, analice al menos 50, 000 eventos con un caudal entre 303, 000 eventos por segundo. Cuando B Subtles crece en una placa del medio inductor de biopelícula, se observa la formación de biopelícula MSGG después de tres días de incubación a 30 grados centígrados.

La biopelícula muestra una arquitectura morfológica compleja que es indicativa de las distintas subpoblaciones celulares participantes. Por ejemplo, la producción de la matriz extracelular y las biopelículas da lugar a la formación de arrugas en la superficie de la colonia. Esta figura muestra un ejemplo de visualización de la diferenciación celular en una sola cepa marcada utilizando microscopía de fluorescencia.

Esta cepa alberga el indicador fluorescente Ptap, un CFP que se expresa en la subpoblación de células productoras de matriz coloreadas en azul. Esta subpoblación produce y segrega la matriz extracelular que constituye el biofilm. La siguiente imagen es el resultado de la visualización por microscopía de fluorescencia de una cepa doble marcada que alberga el reportero Ptap, A CFP, y el reportero adicional P Surfactin YFP.

Este segundo reportero permite monitorizar la subpoblación de células responsables de secretar la molécula de señalización surfactina, que desencadena la cascada de señalización para la diferenciación de los productores de matrices. Aquí, los productores de la matriz tienen un color falso en azul, mientras que los productores de surfactantes tienen un color falso en amarillo, los resultados de la citometría de flujo 2D utilizando una sola cepa etiquetada que alberga el ptap reportero. Aquí se presenta un YFB.

La cepa de control no tratada sin ningún gen de proteína fluorescente mostró una sola población con células de fluorescencia relativa baja que albergaban ptap. Un YFP en condiciones no inductoras de biopelícula no diferenció la subpoblación de productores de matriz, y toda la población también mostró una baja fluorescencia relativa. Por el contrario, en condiciones de inducción de biopelícula, se detectó una subpoblación de células con una fluorescencia relativa alta como un hombro a la derecha de la fluorescencia relativa baja.

Aquí se muestran los resultados máximos obtenidos de la citometría de flujo 3D. Las señales de fluorescencia de los canales monitoreados se presentan en el eje X para YFP y en el eje Y para CFP, el panel superior izquierdo muestra una cepa sin genes de proteínas fluorescentes como control para la fluorescencia de fondo. En el panel superior derecho, se utilizó una sola cepa marcada para detectar la subpoblación de productores de surfactina en el canal de fluorescencia YFP enmarcado en amarillo.

En el panel inferior izquierdo, se utilizó una cepa marcada única diferente para detectar la subpoblación de productores de matriz. En el canal de fluorescencia CFP enmarcado en azul, se monitorean las subpoblaciones de productores de matriz y productores de surfactante utilizando la cepa doble marcada y se presentan los resultados. En este panel inferior derecho.

Se detectan dos subpoblaciones de células que expresan altos niveles de los reporteros fluorescentes. Cada población está enmarcada mostrando que no hay superposición en la expresión de los reporteros entre las dos subpoblaciones de células especializadas. Esta última figura muestra la cuantificación de las subpoblaciones de productores de matriz y caníbales mediante citometría de flujo 3D.

En el panel superior derecho, se utilizó una sola cepa marcada para detectar la subpoblación de caníbales. En el canal de fluorescencia YFP enmarcado en amarillo, se ha descrito que esta subpoblación de caníbales se diferencia coordinadamente con la subpoblación de productores de matriz. En el panel inferior izquierdo, la subpoblación de productores de matriz se detecta en otra cepa marcada única en el canal de fluorescencia CFP.

Enmarcados en azul, los resultados de la cepa doble marcada en el panel inferior derecho mostraron una sola subpoblación de células fluorescentes que expresan tanto YFP como CFP enmarcadas en verde. La expresión simultánea de los dos reporteros indica que ambas vías de diferenciación celular están activadas coordinadamente en la misma subpoblación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar las distintas subpoblaciones de células que constituyen una biopelícula microbiana utilizando el análisis de células de la población celular, como la microscopía fluorescente o la citometría de flujo.