Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar las subpoblaciones distintas de células especializadas que se diferencian en biopelículas del organismo modelo, Bacillus subtilis. Esto se logra primero insertando reporteros transcripcionales en el cromosoma de B. subtilis. Estos reporteros se expresarán exclusivamente en la subpoblación de células bajo estudio.

El siguiente paso consiste en favorecer el desarrollo de un biofilm mediante el cultivo de B. subtiles en el medio inductor de biofilm, MSgg. Después de la formación del biofilm, las células del mismo se dispersan y fijan con paraformaldehído. El paso final del procedimiento es detectar la señal de fluorescencia emitida por células individuales de la comunidad microbiana utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

En última instancia, los resultados muestran cómo las células especializadas producen y secretan. La matriz extracelular que constituye el biofilm proviene de una subpoblación diferente a las células que secretan el surfactante, la molécula señalizadora responsable de la diferenciación de la subpoblación de productoras de matriz. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la cuantificación de la expresión transcripcional mediante ensayos de viabilidad o análisis de micromatrices, es que permite monitorear la expresión génica a nivel de célula individual y visualizar poblaciones celulares particularmente pequeñas que están especializadas en expresar un gen específico.

Estas expresiones génicas no se detectarán al analizar la población total. Se utilizan plásmidos integrativos para marcar B. subtiles y aquí se muestra un ejemplo. PTAA, el promotor de los genes responsables de la producción de tass.

Una proteína matriz se clona en el vector utilizando los sitios de restricción ECO R uno y Hindi tres. La expresión del gen informador CFP ahora está bajo el control de ptap A para comenzar el procedimiento de marcado de B, linealice sutilmente el plásmido integrativo mediante digestión enzimática. La enzima de restricción recomendada es XH oh uno cuando el plásmido integrativo esté listo, induzca competencia natural en la cepa B subtiles 1 68 cultivando las células en medio inductor de competencia durante cinco horas a 37 grados Celsius.

Agregue el plásmido linealizado a la cultura de células competentes de B subtiles e incube durante dos horas a 37 grados Celsius; transcurridas dos horas, siembre las células en agar con espectinomicina e incube durante la noche a 37 grados Celsius. El cromosoma de B subtiles posee dos loci neutrales, AmyE y LAC A, que pueden utilizarse para integrar fusiones de reportero sin afectar el desarrollo del biofilm. El plásmido PKM008 linealizado se integra en el genoma de B subtiles mediante recombinación doble.

El siguiente paso consiste en transferir el gen reportero desde la cepa marcada a una cepa capaz de formar biopelículas, utilizando el protocolo de transducción con el fago SPP1. Para los fines de este video, solo se muestran los pasos importantes del protocolo. Incube la cepa donadora 1 68, que porta la fusión del gen reportero, en medio TY a 37 grados Celsius hasta que el cultivo alcance la fase estacionaria temprana; añada 200 microlitros de células a 100 microlitros de un stock diluido de fago en un tubo de vidrio.

Y permanezca a 37 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, pipetee agar TY blando caliente dentro del tubo y mezcle completamente mediante vortex. Extienda suavemente sobre una placa TY fresca e incube a 37 grados Celsius durante ocho a 16 horas para permitir la formación de halos de fagos.

Para recolectar los halos de fagos, agregue tres mililitros de medio TY a la placa y utilice la pipeta de vidrio para desagregar el agar superior. Transfiera la suspensión de agar a un tubo cónico de 15 mililitros. Vortexee suavemente para desagregar el agar y luego centrifugue a 1000 G durante 15 minutos.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 22 micrones. Utilice este sobrenadante para infectar un cultivo de la cepa receptora crecida en medio TY.

Añada 30 microlitros de sobrenadante a 10 mililitros de cultivo diluido uno a 10, e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después, centrifugue a 5.000 RPM durante siete minutos, resuspenda el precipitado en 200 microlitros de medio TY y siembre en una placa que contenga espectinomicina más citrato de sodio 10 milimolar.

Incubar a 37 grados Celsius durante 12 a 36 horas. Seleccionar una colonia y cultivarla durante la noche en caldo LB líquido a 37 grados Celsius. Finalmente, depositar tres microlitros del cultivo nocturno en medio sólido que induzca la formación de biopelículas.

Deje crecer las células durante 72 horas a 30 grados Celsius. Después de tres días de crecimiento, los biofilms formados sobre la superficie del agar Ms.GG desarrollarán una arquitectura morfológica compleja en la superficie del agar. Para comenzar este procedimiento, utilice un palillo de dientes o pinzas para retirar el biofilm de la superficie del agar MSGG.

La consistencia del biofilm debería permitir que se desprenda de la superficie del agar. Coloque el biofilm en un solo trozo en tres mililitros de tampón PBS y disperse el biofilm mediante pulsos suaves. Realice 12 pulsos con una potencia de tres y una amplitud de 0,7 segundos para fijar las muestras antes del análisis de célula individual.

Re-suspender 300 microlitros de la suspensión celular en un mililitro de una solución al 4% de paraformaldehído e incubar a temperatura ambiente durante exactamente siete minutos. Después de la fijación de siete minutos, lavar las células tres veces con tampón PBS. Finalmente, re-suspender las células en 300 microlitros de tampón PBS antes de la microscopía de fluorescencia.

Prepare un portaobjetos de microscopio pipeteando 200 microlitros de agros al 0,8 % sobre el portaobjetos y cubriéndolo cuidadosamente con otro portaobjetos. Después de dos minutos, retire suavemente el portaobjetos superior para obtener una capa de agros adherida al portaobjetos en el punto inferior. Añada 2 microlitros de células fijadas sobre la superficie de la capa de agros y cúbralo con un cubreobjetos de microscopio.

Coloque la muestra sobre la platina del microscopio de fluorescencia. Ajuste el período de excitación según un control negativo que no muestre fluorescencia en las condiciones seleccionadas para el experimento. La exposición debe estar entre 50 y 200 milisegundos.

Adquiera una imagen de fluorescencia y una imagen de campo brillante para cada campo de visión. Para preparar las células para el análisis por citometría de flujo, disperse la muestra de células fijadas mediante sonicación suave. Realice dos series de 12 pulsos con una salida de cinco y una amplitud de 0,7 segundos para dispersar los agregados en células individuales sin causar lisis celular.

Confirme la eficiencia de la dispersión celular mediante microscopía de luz. A continuación, diluya la muestra uno a 100 en tampón PBS. Se utilizará un citómetro de flujo BD FACS Canto II para este análisis de fluorescencia de YFP.

Se utiliza una excitación láser a 488 nanómetros acoplada a un filtro de 5 30 30 para la fluorescencia de CFP. Se utiliza una excitación láser a 405 nanómetros acoplada a un filtro de 4 0 8 40 para calibrar el citómetro de flujo con dos controles negativos. Una muestra de tampón PBS sin células en suspensión debe servir como control negativo para el tamaño de la partícula detectada por el citómetro de flujo.

Una muestra sin un marcador fluorescente debe servir como control negativo para la sensibilidad fluorescente del citómetro de flujo. Después de la calibración, coloque la muestra etiquetada con un marcador fluorescente en el citómetro de flujo; para cada muestra, analice al menos 50.000 eventos con una velocidad de flujo entre 303.000 eventos por segundo. Cuando B. subtiles crece en una placa con medio inductor de biopelícula, se observa la formación de biopelícula MSGG tras tres días de incubación a 30 grados Celsius.

El biofilm muestra una arquitectura morfológica compleja que indica las distintas subpoblaciones celulares participantes. Por ejemplo, la producción de la matriz extracelular y de los biofilms da lugar a la formación de arrugas en la superficie de la colonia. Esta figura muestra un ejemplo de visualización de la diferenciación celular en una sola cepa marcada mediante microscopía de fluorescencia.

Esta cepa alberga el reportero fluorescente Ptap, una CFP que se expresa en la subpoblación de células productoras de matriz, teñida en azul. Esta subpoblación produce y secreta la matriz extracelular que constituye el biofilm. Esta siguiente imagen es el resultado de la visualización mediante microscopía de fluorescencia de una cepa doblemente marcada que alberga el reportero Ptap, una CFP, y el reportero adicional P Surfactin YFP.

Este segundo indicador permite el monitoreo de la subpoblación de células responsables de secretar la molécula señalizadora surfactina, que desencadena la cascada de señalización para la diferenciación de los productores de matriz. Aquí, los productores de matriz se muestran con color falso azul, mientras que los productores de surfactante se muestran con color falso amarillo, resultados de citometría de flujo en 2D utilizando una sola cepa marcada que porta el indicador ptap. Se presenta aquí un YFB.

La cepa control no tratada, sin genes de proteínas fluorescentes, mostró una sola población con células de baja fluorescencia relativa que portaban ptap. Un YFP en condiciones no inductoras de biopelícula no diferenció la subpoblación de productoras de matriz, y toda la población también mostró baja fluorescencia relativa. En contraste, bajo condiciones inductoras de biopelícula, se detectó una subpoblación de células con alta fluorescencia relativa como un hombro hacia la derecha de la fluorescencia relativa baja.

Se muestran aquí los resultados máximos obtenidos mediante citometría de flujo 3D. Las señales de fluorescencia de los canales monitoreados se presentan en el eje X para YFP y en el eje Y para CFP; el panel superior izquierdo muestra una cepa sin genes de proteínas fluorescentes como control de fluorescencia de fondo. En el panel superior derecho, se utilizó una cepa marcada individualmente para detectar la subpoblación de productores de surfactina en el canal de fluorescencia YFP enmarcado en amarillo.

En el panel inferior izquierdo, se utilizó una cepa marcada diferente para detectar la subpoblación de productores de matriz. En el canal de fluorescencia CFP enmarcado en azul, se monitorean las subpoblaciones de productores de matriz y productores de surfactante utilizando la cepa doblemente marcada y se presentan los resultados, en este panel inferior derecho.

Se detectan dos subpoblaciones de células que expresan altos niveles de los reporteros fluorescentes. Cada población está delimitada, lo que muestra que no hay superposición en la expresión de los reporteros entre las dos subpoblaciones de células especializadas. Esta figura final muestra la cuantificación de las subpoblaciones de productoras de matriz y caníbales mediante citometría de flujo 3D.

En el panel superior derecho, se utilizó una sola cepa marcada para detectar la subpoblación de caníbales. En el canal de fluorescencia YFP enmarcado en amarillo, se ha descrito que esta subpoblación de caníbales se diferencia coordinadamente con la subpoblación de productores de matriz. En el panel inferior izquierdo, la subpoblación de productores de matriz se detecta en otra cepa marcada individualmente en el canal de fluorescencia CFP.

Enmarcados en azul, los resultados de la cepa doblemente marcada en el panel inferior derecho mostraron una única subpoblación de células fluorescentes que expresan tanto YFP como CFP, enmarcados en verde. La expresión simultánea de los dos reporteros indica que ambas vías de diferenciación celular se activan de manera coordinada en la misma subpoblación. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar las subpoblaciones celulares distintas que constituyen un biofilm microbiano mediante el análisis celular de la población, como la microscopía fluorescente o la citometría de flujo.