Name: Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar subpoblaciones celulares especializadas en biopelículas de Bacillus subtilis mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Este método permite analizar la diferenciación celular a nivel individual.

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Este trabajo está financiado por el Programa de Investigación Investigador Joven, del Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas (Zinf) de la Universidad de Würzburg. Juan C García-Betancur es un compañero de doctorado de la Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida (GSL) de la Universidad de Würzburg.

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<li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture%2C+sporulation%2C+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li>
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No tenemos nada que revelar.

El hecho de que las comunidades bacterianas muestran las subpoblaciones de células que expresan el conjunto específico de genes evidencia la complejidad de las comunidades microbianas 33,34. Este protocolo debe ayudar a determinar si la expresión de cualquier gen de interés se limita a una subpoblación particular de células especializadas dentro de la comunidad microbiana. La visualización de estas subpoblaciones requiere el desarrollo de nuevas técnicas, porque los métodos tradicionales para controlar la exp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Técnica </td><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composición </td><td> 5 mM de fosfato de potasio </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> MOPS 100 mm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio 2 mM </td><td> Roth </td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td> 700μM de cloruro de calcio </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> 50 micras de cloruro férrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> 1um cloruro de cinc </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> La tiamina 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> El glicerol 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutacompañero de 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> El triptófano 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> La fenilalanina 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> La fijación de la célula </td><td> Paraformaldehído </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sonicación </td><td> Celular Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Microscopía de fluorescencia </td><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nombre del software </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Microscopía de fluorescencia </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> La citometría de flujo </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> La citometría de flujo </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

sola célula de análisis de bacillus subtilis las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

La formación de biopelículas es un atributo general a casi todas las bacterias 1-6. Cuando las bacterias forman biopelículas, las células están encerradas en una matriz extracelular que está mayoritariamente constituida por las proteínas y exopolisacáridos, entre otros 7-10. La comunidad microbiana encerrado dentro de la biopelícula a menudo muestra la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas 11-17. Estas subpoblaciones coexisten y se muestran a menudo la organización espacial y temporal dentro del biofilm 18-21. La formación de biopelículas en los Bacillus subtilis organismo modelo requiere la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas. Entre ellos, la subpoblación de los productores de matriz, responsables de producir y secretar la matriz extracelular de la biopelícula es esencial para la formación de biopelículas 11,19. Por lo tanto, la diferenciación de los productores de la matriz es una característica de la formación de biopelículas en la B. subtilis. Hemos utilizado los reporteros fluorescentes para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz en las biopelículas de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, hemos observado que la subpoblación de los productores de matriz diferencia en respuesta a la presencia de auto-producido señal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina es producida por una subpoblación de células especializadas diferentes de la subpoblación de los productores de matriz 15. Hemos expuesto en este informe, el enfoque técnico necesario para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz y los productores de surfactina en las biopelículas de B. subtilis. Para hacer esto, los reporteros fluorescentes de los genes necesarios para la producción de matriz y la producción de surfactina se insertan en el cromosoma de B. subtilis. Los reporteros se expresan únicamente en una subpoblación de células especializadas. Entonces, las subpoblaciones puede sercontrolará mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (ver Fig. 1). El hecho de que diferentes subpoblaciones de células especializadas coexisten dentro de las comunidades de bacterias multicelulares nos da una perspectiva diferente sobre la regulación de la expresión génica en procariotas. Este protocolo trata este fenómeno de manera experimental y puede ser fácilmente adaptado a cualquier modelo de otros tratamientos, para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la heterogeneidad fenotípica dentro de una comunidad microbiana.

Biopelículas microbianas están constituidas generalmente por distintas subpoblaciones de células especializadas. Sola célula de análisis de estas subpoblaciones requiere el uso de reporteros fluorescentes. A continuación se describe un protocolo para visualizar y controlar varias subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biopelículas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

La formación de biopelículas es un atributo general de casi todas las bacterias 1-6. Cuando las bacterias forman biopelículas, las células quedan encerradas en una matriz extracelular compuesta principalmente por...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar las subpoblaciones distintas de células especializadas que se diferencian en biopelículas del organismo modelo, Bacillus subtilis. Esto se logra primero insertando reporteros transcripcionales en el cromosoma de B. subtilis. Estos reporteros se expresarán exclusivamente en la subpoblación de células bajo estudio.El siguiente paso consiste en favorecer el desarrollo de un biofilm mediante el cultivo de B. subtiles en el medio inductor de biofilm, MSgg. Después de la formación del biofilm, las células del mismo se dispersan y fijan con paraformaldehído. El paso final del procedimiento es detectar la señal de fluorescencia emitida por células individuales de la comunidad microbiana utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.En última instancia, los resultados muestran cómo las células especializadas producen y secretan. La matriz extracelular que constituye el biofilm proviene de una subpoblación diferente a las células que secretan el surfactante, la molécula señalizadora responsable de la diferenciación de la subpoblación de productoras de matriz. La principal ventaja de esta técnica frente a mé

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

Fuente: Cabeen, M. T., et al. Análisis microfluídico de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para observar el crecimiento bacteriano a nivel de célula única. Muestra cómo las células bacterianas no móviles, confinadas en trincheras a microescala, son continuamente nutridas e imaginadas bajo un microscopio de fluorescencia. La configuración permite la visualización en tiempo real de la división celular y el seguimiento de...

Seguimiento del crecimiento bacteriano a resolución de célula única en un sistema microfluídico

Las biopelículas tienen interacciones complejas con su entorno circundante. Para investigar de manera exhaustiva las interacciones entre el biofilm y el medio ambiente, presentamos aquí una serie de métodos para crear un entorno químico heterogéneo para el desarrollo de biopelículas, para cuantificar la velocidad del flujo local y para analizar el transporte de masa dentro y alrededor de las colonias de biopelículas.

Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Citometría de flujo en combinación con agrupamiento visual ofrece un método rápido y fácil de usar para el estudio de biopelículas acuáticas. Puede ser utilizado para la caracterización de biopelículas, detección de cambios en la estructura de la comunidad de biofilm y la detección de partículas abióticas en el biofilm.

Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Este protocolo se centra en el uso de citometría de flujo y perlas de recuento para cuantificar las esporas bacterianas marcadas con bromuro de etidio. El método también es eficiente para analizar el acoplamiento covalente de proteínas en la superficie de esporas intactas.

Mejora de la enumeración de esporas de Bacillus subtilis y el análisis de etiquetas en citometría de flujo

Aprende a visualizar y cuantificar subpoblaciones celulares especializadas en biopelículas de Bacillus subtilis mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Este método permite analizar la diferenciación celular a nivel individual.

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

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