La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

El objetivo general del siguiente experimento es generar un gran número de esferoides tumorales controlados de tamaño uniforme. Esto se logra preparando primero las placas de micropocillos para agrupar las células que se formarán en esteroides. Como segundo paso, se cosecha un cultivo del tipo de célula deseado, que proporciona la suspensión celular que determina el tamaño y la composición de los OID.

A continuación, la suspensión celular se centrifuga en los micropocillos y se incuba para permitir que se formen esteroides después de la incubación. Los esteroides resultantes son muy uniformes y pueden recogerse o cultivarse en los micropocillos en los que se formaron. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que se puede hacer simultáneamente un gran número de agregados uniformes.

Las personas nuevas en este método pueden encontrar que su combustible es muy grande. Es importante asegurarse de que la suspensión de la célula se distribuya uniformemente a través de la placa y que los portadores de placa oscilante en el Fuge central se muevan libremente para que la fuerza sea perpendicular a la superficie. Para comenzar, prepare una placa estéril agro well 400 agregando 0,5 mililitros de surfactante que contenga solución de enjuague a cada pocillo.

El uso de surfactante garantiza que las células no interactúen con la superficie del micropocillo. Para evitar atrapar burbujas de aire en los micropocillos, agregue líquido a un lado y deje que se extienda por la superficie en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Después de agregar la solución a los pocillos, vuelva a colocar la tapa.

Asegúrese de que el rotor esté correctamente equilibrado antes de centrifugar las placas durante dos minutos a 2000 veces G.To eliminar las burbujas con un microscopio invertido de bajo aumento, verifique que las burbujas se hayan eliminado de los micropocillos. Incube la placa durante al menos 30 minutos con la tapa puesta a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Aspire la solución de enjuague de los pocillos y lave la placa con agua estéril o PBS inmediatamente antes de usarla.

No permita que las placas se sequen después de la codificación. Los detalles de la preparación celular variarán según el tipo específico de célula que se estudie. Sin embargo, hemos observado que esta condición es efectiva para una amplia gama de células, incluidas las líneas que hemos discutido aquí, así como para células madre embrionarias humanas y neuronales, células madre pluripotentes inducidas humanas, fibroblastos, células putativas, endodonas primitivas y células estromales Para preparar las células, comience con el matraz T 75 de células HT 29.

Aspirar el medio de crecimiento del matraz y añadir tres mililitros de tripsina. Incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Detenga la digestión de la tripsina agregando tres mililitros de medio de crecimiento.

Transfiera el resto a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Luego, de un tubo de 15 mililitros, tome una alícuota para el recuento de células. Centrifugar las células durante cinco minutos a 200 veces G mientras la centrifugación está en curso.

Cuenta las celdas. A continuación, aspire la mezcla de medio de prueba y reemplácela con crecimiento fresco. Medio a un volumen determinado por la densidad de celdas requerida previamente calculada como se describe en el protocolo de texto como paso opcional.

Pase la suspensión de la celda a través de un colador para eliminar los grumos. Los esferoides pueden generarse en una variedad de formulaciones de medios, sin embargo, los ensayos iniciales deben llevarse a cabo utilizando el medio en el que se cultivaron las células. Para distinguir las consecuencias de la transición a un sistema de cultivo tridimensional de las consecuencias de cambiar la composición del medio, comience agregando 0.4 mililitros de medio de crecimiento a cada centrífuga de pocillos durante dos minutos a 2000 veces G.To eliminar las burbujas con un microscopio invertido de bajo aumento, verifique que las burbujas se hayan eliminado de los micropocillos.

A continuación, agregue 0,4 mililitros de suspensión celular a la densidad requerida a los micro pocillos. A continuación, mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en los micropocillos, asegúrese de que las células se distribuyan uniformemente por todo el pocillo. Para obtener esteroides consistentes.

Centrifugar la placa durante cinco minutos a 200 veces. G, la placa debe estar equilibrada internamente y contra la otra placa para que el peso se distribuya uniformemente a ambos lados del soporte de la placa. Esto asegura que la placa se autonivele durante la centrifugación, de modo que no surjan corrientes de convección y resulten en una distribución desigual de las celdas a través de los micropocillos.

Usando un microscopio invertido, verifique que las células se hayan agrupado dentro de los micropocillos y que estén distribuidas uniformemente a través del pocillo antes de incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius. Observe el proceso de formación de esferoides s utilizando un microscopio invertido. Algunas líneas celulares formarán esteroides compactos dentro de las 24 horas.

Otros pueden tardar más. Aquí se muestra la progresión de clúster a agregado en células HT 29. La parte más difícil de este procedimiento es eliminar los esteroides intex sin alterar las estructuras: para extraer los esteroides de los micro pocillos, pipetear hacia arriba y hacia abajo muy suavemente para permitir que los esferoides salgan de los micro pocillos.

A continuación, incline la placa para aspirar la mezcla media de esteroides. Utilice puntas de pipeta de orificio ancho para esteroides de mayor tamaño para evitar descomponer el esteroide. Después de recuperar el esteroide de los micropocillos, transfiéralo al cultivo en suspensión inyectándolos suavemente con una pipeta.

Alternativamente, la rosa severa se puede mantener en convulsión con un reemplazo medio. La duración depende del tamaño inicial y de la tasa de crecimiento, que define el tiempo hasta que superan los micro pozos. Bueno, se formaron para reemplazar el medio sin perder esteroides.

Aspire el medio en el borde del pozo. Con una pipeta para pastos, baje lentamente la punta hasta que comience a extraer líquido del menisco y siga el menisco hacia abajo a medida que cae. Luego agregue medio fresco contra la pared del pozo en el mismo lugar.

Al agregar el medio fresco, recuerde empujar el pipete suavemente y mantener la punta contra la pared para evitar la alteración de la PHE en los micropocillos. Es posible que se pierdan algunos esteroides. Sin embargo, si el medio siempre se aspira y se reemplaza en la misma posición, este número seguirá siendo pequeño.

En comparación con los grandes números en el pozo, los esteroides de múltiples líneas tumorales de diferentes orígenes anatómicos pueden extraerse fácilmente en suspensión. El control de tamaño consistente que se puede obtener a través de este método se demuestra aquí con poblaciones de esteroides altamente uniformes. Bajo cada condición formado por 700 o 1.500 células.

Las claras diferencias interlineales en el comportamiento también son visibles con las células de cáncer de colon HT 29 y las células de cáncer de esófago TE 6 que forman esteroides densamente empaquetados con límites claramente definidos. Por el contrario, las células cancerosas de próstata dan lugar a esteroides menos coherentes con límites irregulares. Las fuerzas internas más fuertes en los agregados más coherentes también resultaron en el colapso a una forma más simétrica, incluso mientras aún estaban en los micropozos en los que se formaron.

Sin embargo, los agregados de lin, particularmente en el tamaño más grande, retienen visiblemente la geometría cuadrada del parametal de los micropocillos. Una vez dominados, este proceso se puede llevar a cabo en aproximadamente una hora más el período de incubación requerido para que las células se adhieran y produzcan fluidos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que asegurarse de que burbujea otra, recorriendo los micro pocillos antes de añadir las células.