Name: Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Descubre cómo visualizar interacciones proteína-proteína a escala de molécula única usando BiFC-PALM en células U2OS. Esta técnica de microscopía permite estudiar señalización oncogénica con resolución nanométrica.

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Los autores agradecen a los Dres. Steven Chu y Joe W. Gray por sus útiles discusiones, a Henry Marr por su trabajo inicial en el proyecto BiFC-PALM, y a Alexis Shoemaker por su asistencia técnica. Este trabajo cuenta con el apoyo de fondos iniciales para X.N. de OHSU. La investigación en el laboratorio de Nan también contó con el apoyo de NIH 5U54CA143836-05, la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon, el M. J. Murdock Charitable Trust y la compañía FEI.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

BiFC ha sido una técnica comúnmente utilizada para la detección y la visualización de los IBP en las células, mientras que PALM es una técnica de microscopía reciente sola molécula de super-resolución que permite formación de imágenes a nanoescala de muestras biológicas intactas. La combinación de BiFC con PALM logra imagen selectiva de los IBP en el interior de una celda con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula. BiFC-PALM extiende la utilidad de ambas técnicas, y como se demuestra en este trabaj...

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología 1 y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares 2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología. Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) es una de las pocas herramientas existentes para la visualización de los IBP en una celda con resolución subcelular y la compatibilidad de las células vivir 3-5. La técnica es relativamente sencilla y consiste en la división de una proteína de fluorescencia en dos fragmentos no fluorescentes; cuando etiquetados genéticamente para dos proteínas que interactúan ypuesto en proximidad, los fragmentos pueden reconstituir para formar una proteína fluorescente completa, dando señal fluorescente. Cuando se diseñan adecuadamente, sondas BiFC no deben reconstituir de forma espontánea en ausencia de IBP. Como tal, la señal de fluorescencia en un ensayo de BiFC sólo surgir en la presencia de los IBP, que permite la visualización directa de los IBP con alta especificidad. Beneficios adicionales de utilizar la fluorescencia como la lectura son de alta sensibilidad, resolución subcelular, y la compatibilidad con un alto rendimiento y ensayos de cribado de alto contenido, entre otros. Para estos beneficios, una serie de sondas BiFC basados ​​en diferentes proteínas fluorescentes padres se han desarrollado. Como en todas las otras técnicas de detección basados ​​en microscopía de luz convencional, sin embargo, la resolución espacial de BiFC se limita a ~ 250 nm por la difracción de la luz. Esto hace que sea un reto para estudiar la regulación de los IBP en la nanoescala, que, como se aludió antes y ejemplificado por las balsas de lípidos 6and nanoclusters Ras 7, es una escala de longitud crítica para la comprensión de muchos procesos celulares como la señalización. BiFC se ha combinado con microscopía de localización fotoactivado (PALM) 8,9 para superar este límite de la resolución espacial para obtener imágenes de los IBP 10. PALM es una técnica de microscopía de super-resolución reciente que elude el límite de difracción en imágenes de fluorescencia a través de la activación estocástico y localización subdiffractive de moléculas fluorescentes individuales. En cada ciclo de activación, una molécula fluorescente emite unos pocos cientos a unos pocos miles de fotones y da lugar a una sola imagen molécula en el detector. Mientras que la imagen es de difracción limitada (~ 250 nm de anchura), su centroide se puede determinar con precisión mucho mayor, típicamente del orden de un 10-50 nm en función del número de fotones detectados. Mediante la activación y localización de cada molécula fluorescente en la muestra, una imagen de alta resolución puede ser reconstruido. Performed en las células vivas, sola molécula de seguimiento (SMT-) PALM permite además adquisición de miles de trayectorias de difusión proteína a partir de una sola célula 11. Es importante destacar que, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados tales como proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-PM) para lograr la activación estocástico. Dado que tanto BiFC y proteínas fluorescentes uso PALM, que se combinaron mediante el fraccionamiento de PAmCherry1, un PA-FP comúnmente utilizado para PALM, en dos fragmentos entre los aminoácidos 159 y 160. El sistema basado en PAmCherry1 BiFC dividida muestra una baja señal de fondo de la reconstitución espontánea de los dos fragmentos. Cuando etiquetado genéticamente a un par de proteínas que interactúan, los dos fragmentos (RN = residuos 1 a 159; RC = Met + residuos 160-236) reconstituido de manera eficiente para formar proteínas completas PAmCherry1 incluso a 37 ° C y sin incubación a temperaturas más bajas, lo cual No es el caso de otros pares BiFC 12 como el padre mCherry 13. Furthermore, la proteína PAmCherry1 reconstituido conserva las propiedades fotofísicas del PAmCherry1 padres, tales como alta relación de contraste, rendimiento de fotones medio y fotoactivación rápida, entre otros, que son fundamentales para la exacta localización sola molécula y de imágenes PALM alta resolución. En este protocolo, se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS utilizando dividida PAmCherry1 (Figura 1). El primer paso es el diseño de las construcciones para la expresión de proteínas de fusión entre los fragmentos PAmCherry1 (es decir, RN y RC) y las proteínas de interés. En teoría, para cada par de proteínas candidatas (A y B), hay ocho pares de proteínas de fusión a ensayar: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; y A-RC / B-RN. Este proceso a menudo se puede simplificar teniendo en cuenta las propiedades estructurales o bioquímicas de las proteínas candidatas. En el caso de Ras, la proteína esdespués de la traducción modificado el cuadro de CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = cualquier), después de lo cual el motivo AAX se escinde. Por lo tanto, RN o RC sólo pueden ser fusionados con el extremo N-terminal de Ras; esto reduce el número de pares de proteína de fusión a cuatro (Figura 1B). Para Raf, los dominios Ras vinculante (RBD; residuos 51-131) se utiliza y se pueden etiquetar en cada extremo. Se generaron Estas cuatro configuraciones de fusión: RN-KRas / RC-Raf RBD; RN-KRas / Raf RBD-RC; RC-KRas / RN-Raf RBD; y RC-KRas / Raf RBD-RN. Además, tendrá que ser considerado el enlazador entre los fragmentos y las proteínas de interés. Un enlazador flexible de aproximadamente diez aminoácidos se utiliza a menudo, ya que proporciona la suficiente libertad para la complementación que se produzca. Uno de estos es enlazador (GGGGS) x2, aunque hay muchos otros que se han aplicado con éxito, incluyendo secuencias aleatorias generadas a partir de un sitio de clonación múltiple (MCS) 14. La longitud de los enlazadores puede necesitar ser optimizado depending del tamaño de las proteínas de interés y sus orientaciones cuando interactúan. Los fragmentos PAmCherry1 están contenidos en una pequeña columna vertebral de la clonación con flanqueando MCSs (ver Lista de Materiales). Los genes de interés se pueden insertar a través de los sitios de restricción o con un método de ligadura independiente. Después de la clonación y la secuencia de verificación, el casete de expresión se transfiere a un vector de expresión usando una reacción de recombinasa, un proceso de clonación con alta fidelidad y alta eficiencia. A continuación, las construcciones de expresión resultantes se transfectaron en la línea de célula diana o, si se desea una línea celular estable, empaquetado en lentivirus para infectar la línea celular objetivo. La transfección transitoria permite la validación rápida de las configuraciones BiFC, pero los problemas potenciales debe tenerse en cuenta. La transfección utilizando productos químicos a menudo hace hincapié en las células, lo que resulta en alta autofluorescencia; mientras que el uso del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopy puede mitigar esta señal de fondo mediante la limitación del volumen de la iluminación, TIRF ideal cuando los IBP tienen lugar en la membrana celular. Además, las transfecciones transitorias a menudo conducen a altos niveles de expresión de proteínas, muy por encima de los de las proteínas endógenas, que pueden causar artefactos en la detección de los IBP. Por lo tanto, se recomienda que se establezcan líneas celulares estables después de una configuración apropiada BiFC se ha determinado a través de pruebas inicial. Las líneas celulares estables también tienen el potencial para la expresión sintonizable mediante doxiciclina inducción 15. Después de la infección, las células se seleccionan con antibióticos, por lo general puromycin y neomicina, uno para cada constructo. Los pasos subsiguientes para la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y análisis de datos se describen en detalle en los protocolos. Con este enfoque, la formación de agrupaciones de nanoescala en imágenes BiFC-palma de Ras-Raf RBD se observan rutinariamente (Figura 2A &lt;/ strong&gt;). Consistentemente, trayectorias smt-palma de Ras-Raf RBD muestran una distribución heterogénea en los estados de difusión (Figura 2B-D). Estos resultados sugieren que existen complejos de Ras-Raf en varios estados en la membrana celular, presumiblemente como monómeros y clusters, con potenciales implicaciones biológicas. Este trabajo demuestra el poder de BiFC-PALM en imagen selectiva de los IBP en células con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula, que sería difícil de obtener con BiFC convencional, fluorescencia co-localización, o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). En el diseño de experimentos BiFC e interpretación de los resultados, es importante tener en cuenta que el proceso BiFC es irreversible en la mayoría de casos, incluyendo PAmCherry1 dividida. Una vez que los dos fragmentos se combinan y forman una proteína PAmCherry1 completa, el enlace entre los dos fragmentos, y por lo tanto el PPI se convierte en permanente. Esto limita el uso de BiFC y BiFC-PALM para el seguimiento de la dinámica de los IBP (es decir, la cinética de unión y no la dinámica de difusión del complejo de proteínas, una vez que se forma) y, a veces incluso podría conducir a mislocalization de los complejos de PPI. Un factor adicional a tener en cuenta en el diseño de experimentos BiFC-PALM es el retraso en la maduración cromóforo que es inherente a las proteínas fluorescentes. Una vez que dos proteínas interactúan y los fragmentos de PF se unen, por lo general refold del orden de segundos (tiempo-medio de 60 seg para EYFP 3). Sin embargo, la maduración cromóforo subsiguiente y la señal fluorescente se desarrollan en el orden de minutos. Mientras que la fluorescencia puede ser detectable en 10 minutos después de la reconstitución de la fracción de Venus, una variante de rápido plegado YFP, el tiempo medio para la maduración en general es a menudo alrededor de 60 min 16. Split-PAmCherry1 se observó a tener tasas similares. Por lo tanto, BiFC y BiFC-PALM son opciones actualmente pobres para el seguimiento de la cinética de PPI en tiempo real; otro yothods, tales como FRET y una proteína fluorescente dependiente de la dimerización recientemente desarrollado 17, pueden ser más adecuados para este propósito.

<table><tbody><tr><td>Marco de microscopio</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X objetivo TIRF de inmersión en aceite con 1.49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>Cámara EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm láser</td><td>Opto Motor</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm láser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm espejo dicroico</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 561 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de muesca de 405/561 nm</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura y CO2 etapa controlada</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Embalaje de lentivirus</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de transfección X-tremeGENE</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara Thermo</td><td>Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5 placas con fondo de vidrio</td></tr><tr><td>Celdas U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con rojo fenol</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin rojo fenol</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>L-15 de Leibovit, sin rojo fenol</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Medio sérico reducido</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Millipore SLHV033RB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrador lentiviral</td><td>Clontech</td><td></td> 631231 <td></td></tr><tr><td>Concentrador retroviral</td><td>Clontech 631455</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultivo de 10 cm plato</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomicina</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>TUBOS</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma</td><td>221473 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm partículas de oro</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midiprep</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml Fisher</td><td></td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de fondo redondo de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de polipropileno de 14 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tubo de PCR</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>medio SOC</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoactivado localización microscopía con bimolecular fluorescencia complementación (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Las interacciones proteína-proteína (PPIs) son eventos moleculares clave para la biología. Sin embargo, sigue siendo un desafío visualizar IBP con suficiente resolución y sensibilidad en las células porque la resolución de la microscopía óptica convencional está limitada por difracción a ~ 250 nm. Al combinar la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con la microscopía de localización fotoactivada (PALM), los PPI se pueden visualizar en células con sensibilidad de una sola molécula y resolución espacial nanométrica. BiFC es una técnica comúnmente utilizada para visualizar IBP con contraste de fluorescencia, que implica la división de una proteína fluorescente en dos fragmentos no fluorescentes. PALM es una técnica reciente de microscopía de superresolución para obtener imágenes de muestras biológicas a escala nanométrica y de una sola molécula, que utiliza sondas fluorescentes fototransformables como las proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-FP). BiFC-PALM se demostró dividiendo PAmCherry1, un PA-FP compatible con PALM, por su naturaleza monomérica, buen brillo de una sola molécula, alta relación de contraste y utilidad para las mediciones estequiométricas. Cuando se divide entre los aminoácidos 159 y 160, PAmCherry1 se puede convertir en una sonda BiFC que se reconstituye eficientemente a 37 °C con alta especificidad para los IBP y baja reconstitución inespecífica. La interacción Ras-Raf se utiliza como ejemplo para mostrar cómo BiFC-PALM ayuda a sondear las interacciones a escala nanométrica y con una resolución de una sola molécula. Su difusión también se puede rastrear en células vivas utilizando el seguimiento de una sola molécula (smt-) PALM. En este protocolo, se discuten los factores a tener en cuenta al diseñar las proteínas de fusión para BiFC-PALM, se explican los pasos de preparación de la muestra, adquisición de imágenes y análisis de datos, y se muestran algunos resultados ejemplares. Al proporcionar una alta resolución espacial, especificidad y sensibilidad, BiFC-PALM es una herramienta útil para estudiar los IBP en muestras biológicas intactas.

El ejemplo BiFC-PALM mostrado es KRas G12D mutante interactuar con los Ras vinculante dominio (RBD) de FARC (Figura 1). Como se ha discutido, la RN o fragmentos de RC no se marcaron a la C-terminal de Ras, ya que perturbaría la localización de la membrana y por lo tanto la actividad biológica de Ras. Esto reduce las posibles combinaciones de ocho a cuatro (Figura 1B). Cada una de estas cuatro combinaciones se introdujo en células U2OS utilizando la infección lentiviral. Las células se f...

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

El objetivo general de esta técnica de microscopía es visualizar proteínas e interacciones proteicas a escala de molécula individual y nanométrica. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a responder algunas preguntas clave en el campo de la biología, como las interacciones moleculares en procesos de señalización oncogénica. La principal ventaja de esta técnica es que es sensible, específica y ofrece resoluciones a nivel de molécula individual y nanométrica.El procedimiento será demostrado por el Dr. Tahan, un investigador asociado sénior en mi laboratorio. Después de clonar los fragmentos RAs y RAF R-B-D-P-A-M Cherry uno, empaquetarlos en partículas virales e infectar células U2 OS según el protocolo descrito. Para preparar una muestra para imágenes, coloque aproximadamente 5,5 × 10⁴ células con expresión estable por pocillo en una placa de cámara de ocho pocillos con fondo de vidrio, utilizando 350 µL de DMEM sin fenol rojo. Use paraformaldehído fresco con glutaraldehído para fijar las células y, tras reemplazar el fijador con PBS o tampón de imágenes, vortexe partículas de oro de 100 nanómetros y agregue 35 µL por pocillo para rastrear la deriva de la platina durante la adquisición de imágenes.Acérquese al microscopio y encienda los láseres de 405 y 561 nanómetros, manteniendo los obturadores cerrados por ahora; asegúrese de que el espejo dicromático y el filtro rechazabanda de 561 nanómetros estén colocados. Abra el software de adquisición de imágenes. Encienda la cámara E-M-C-C-D y permita que se enfríe, luego configure el tiempo de exposición en 100 milisegundos y el ganancia de la cámara E-M-C-C-D en un valor adecuado.Añada aceite de inmersión al objetivo y asegure la muestra sobre la platina del microscopio. A continuación, utilizando campo claro o el láser de 561 nanómetros, enfoque la muestra para obtener imágenes de RAs y otras proteínas de membrana. Utilice un objetivo APO de 60 x con una apertura numérica de 1,49 y configure el microscopio en modo turf.Ajuste el láser de excitación para que esté descentrado al incidir en la abertura trasera del objetivo de césped, lo que hará que el láser se desvíe al alcanzar el buffer de la cubierta. Siga ajustando la posición de incidencia del láser hasta alcanzar el ángulo crítico y el láser se refleje de regreso. Busque una célula para obtener imágenes que tenga varias partículas de oro visibles.Luego, establezca una región de interés que encierre la célula o una región de ella y las partículas de oro en caso de que ya esté ocurriendo una activación suficiente debido a niveles altos de expresión. Comience la adquisición con el láser de 405 nanómetros apagado y el láser de 561 encendido. De lo contrario, encienda el láser de 405 nanómetros en la configuración de potencia mínima de fábrica y aumente gradualmente hasta que haya decenas de moléculas por cuadro, de modo que las moléculas individuales estén bien separadas.Mientras continúa la adquisición de datos, aumente gradualmente la potencia del láser de 405 nanómetros para mantener la densidad de puntos aproximadamente constante. Continúe la adquisición de imágenes hasta que la alta potencia de 405 no inicie más.Los eventos de activación finalizan el proceso de imágenes. Descargue el software de procesamiento de imágenes. Abra MATLAB y cargue el software de lectura WFI.Visualice la secuencia de imágenes crudas y determine la región de interés (ROI); seleccione el área de la pila que se procesará haciendo clic izquierdo y arrastrando un cuadro alrededor del área deseada. Si la región de interés no se redujo durante la adquisición, seleccione un área más pequeña para reducir el tiempo de procesamiento. Para anular la selección de un área y procesar todo el cuadro, haga clic derecho en cualquier parte de la imagen. A continuación, defina un conjunto de marcadores fiduciarios, como nanopartículas de oro absorbidas sobre el cubreobjetos, que estén bien aisladas, sean uniformes en forma y estén presentes en el campo de visión a lo largo de toda la pila de imágenes. Comience seleccionando una partícula de oro candidata haciendo clic izquierdo sobre su imagen y arrastrando un cuadro pequeño alrededor de ella.Bajo el seguimiento de partículas, haga clic en el botón de seguimiento. Aparecerá un gráfico que muestra la posición de la partícula de oro seleccionada a través de la serie de imágenes, representando el grado de deriva. Repita este proceso para seguir tantas partículas de oro como sea posible y determine las partículas que se desplazan juntas. Idealmente.La deriva general es de una magnitud máxima de 0,1 píxel, uno a la vez. Seleccione las partículas de oro que se rastrearon juntas y bajo el seguimiento de partículas. Haga clic en el botón agregar marcador.Aparecerá una cruz verde que indica que la partícula ha sido agregada como marcador y se utilizará para corregir la deriva. Ajuste el rango de suavizado sigma y el umbral según sea necesario, modificando ligeramente el valor. Haga clic en el botón encontrar partícula para probar los ajustes e inspeccionar visualmente las partículas procesadas; por ejemplo, las moléculas PAM cherry que son relativamente redondas y brillantes serán encuadradas, mientras que las que no cumplan con estas características quedarán excluidas.Para comenzar a procesar las imágenes, haga clic en el botón crear archivo de cordón y guarde el archivo con un nombre deseado para postprocesar las imágenes y renderizar la imagen de la palma. Inicie el paquete de palma en MATLAB y cargue el archivo de núcleo de puntos recién creado. Aparecerá una imagen renderizada aproximadamente en el cuadro de imagen junto a los botones de control.Ordene las coordenadas individuales utilizando los siguientes valores típicos. Para PAM Cherry uno, el marco de combinación es igual a ocho. La distancia de combinación en nanómetros es igual a 100 y el RMS mínimo es igual a cuatro.El ajuste mínimo de bondad es igual a 0,25 y la excentricidad máxima es igual a 1,4. Haga clic en el botón de ordenar para generar un nuevo conjunto de coordenadas curadas listas para renderizar imágenes de alta resolución. Ingrese valores para la correcta representación de la imagen final, como el tamaño de píxel en bruto previamente determinado y el tamaño deseado de la característica en la imagen renderizada, que normalmente se establece en un valor ligeramente superior al de la localización promedio y al tamaño de píxel, por ejemplo, 10 nanómetros.Para la imagen renderizada, haga clic en el botón de renderizado para generar la imagen de la palma. Luego, utilice los iconos de aumento y disminución con los signos más y menos en la barra de herramientas de la ventana de la figura para acercar y alejar la imagen y así rastrear moléculas individuales en células vivas. Trate la superficie de cultivo de tejidos y siembre las células como se describió anteriormente en este video.Asegúrese de que la lámina de cubreobjetos tenga el grosor adecuado para el montaje microscópico después de seccionar las células y realizar los tratamientos e incubaciones necesarios para el experimento; coloque el recipiente de cultivo en un incubador sobre el escenario. Deje que el recipiente se asiente en el escenario durante unos minutos hasta que la temperatura y la concentración de CO₂ se estabilicen en este paso. Bloquee los láseres.Si no se dispone de control de CO2, cambie a un medio independiente de CO2 justo antes de la adquisición de imágenes, como el medio Leibovitz L-15, para reducir la fluorescencia de fondo. Finalmente, adquiera las imágenes como se demostró anteriormente, ajustando un tiempo de exposición adecuado para garantizar una buena relación señal-ruido sin perder resolución temporal. El BFC palm en esta figura corresponde al mutante KRAS G12D que interactúa con el dominio de unión a RAS (RBD) de CRAF. Cada una de las cuatro combinaciones mostradas aquí se introdujo en células U2OS mediante infección lentiviral. Células con dos de las configuraciones presentaron señales de BFC fuertemente positivas, identificadas por el aumento brusco de la fluorescencia cuando se encendió el láser de 405 nanómetros debido a la fotoactivación del BFC reconstituido PAmCherry1, como se demuestra aquí utilizando las mismas condiciones experimentales que con el PAmCherry1 original.Se generó una señal BFC fuerte tras la infección con RN R y RAF RBD RC. Aquí, RN y RC denotan los fragmentos terminal n y terminal C de PAM Cherry uno, respectivamente, cuando se amplía a nivel de moléculas individuales y su distribución espacial a escala nanométrica puede observarse claramente en este experimento, en el que se realizó un seguimiento individual de moléculas mediante PALM para obtener las trayectorias de difusión de RA individuales. Complejos RAF RBD bajo iluminación continua con láseres de 561 nanómetros y 405 nanómetros. Moléculas individuales de PA m cherry uno est.Enciéndase y dure algunos fotogramas antes de entrar en estados oscuros donde se observó que eran inmóviles o móviles. Este gráfico de grabaciones para múltiples moléculas ilustra claramente ambos tipos de trayectorias. La misma distribución heterogénea de estados de difusión puede inferirse a partir del histograma del desplazamiento molecular entre fotogramas sucesivos Mass mastered.Esta técnica puede realizarse en una a tres semanas, dependiendo de si los constructos son transitoriamente transfectados o establemente expresados, siempre que se realice adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar controles como Putinas mutantes que carecen de la interacción tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como un análisis de agrupamiento, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como, ¿cómo se organiza espacialmente la interacción de proteínas en la célula?Para el seguimiento de células en el laboratorio, como base evaluacional, se puede realizar un seguimiento de partículas individuales para determinar los estados de difusión y las probabilidades de transición tras su desarrollo. Esta técnica se está utilizando en nuestro laboratorio en el campo de la biología del cáncer para explorar las interacciones inducidas por el ácido retinoico, así como la homodimerización y heterodimerización de los receptores de la familia HER en células tumorales humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar e implementar un seguimiento por biopsia para investigar una interacción proteica de interés.No olvide que trabajar con antivirales y células tumorales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como los protocolos estándar de seguridad biológica al realizar este procedimiento.

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada...

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

Descubre cómo visualizar interacciones proteína-proteína a escala de molécula única usando BiFC-PALM en células U2OS. Esta técnica de microscopía permite estudiar señalización oncogénica con resolución nanométrica.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

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