Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

El objetivo general de esta técnica de microscopía es visualizar proteínas, interacciones proteicas a escala de molécula única y nanómetro. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a responder algunas preguntas clave en el campo de la biología, como las interacciones moleculares en los procesos de señalización oncogénica. La principal ventaja de esta técnica es que es sensible, específica y ofrece resoluciones de molécula única y nanómetros.

La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Tahan, un investigador senior asociado en mi laboratorio Después de clonar RAs y RAF R-B-D-P-A-M Cherry one fragmentos empaquetados en partículas virales e infectar células U2 OS de acuerdo con el protocolo de texto. Para preparar una muestra para la toma de imágenes, placa aproximadamente 5,5 veces 10 a la cuarta células de expresión estable por pocillo de una cámara con fondo de vidrio de ocho pocillos, deslice 350 microlitros de DMEM libre de rojo fenol. Use paraldehído fresco con glutaraldehído para fijar las células y después de reemplazar el fijador con PBS o vórtice de tampón de imágenes de partículas de oro de 100 nanómetros y agregue 35 microlitros por pocillo para rastrear la deriva de la etapa durante la imagen.

Acérquese al microscopio y encienda los láseres de 405 y 561 nanómetros manteniendo los obturadores cerrados en este punto, asegúrese de que el espejo dicroico de 561 nanómetros y el filtro de muesca estén en su lugar. Abra el software de adquisición de imágenes. Encienda la cámara E-M-C-C-D y deje que se enfríe y ajuste el tiempo de exposición a 100 milisegundos y la ganancia E-M-C-C-D a un valor adecuado.

Agregue aceite de inmersión al objetivo y asegure la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, con el láser de campo claro o de 561 nanómetros, enfoque la muestra para obtener imágenes de los RA y otras proteínas de membrana. Utilice un objetivo de césped cromático APO de 60 x con una apertura numérica de 1,49 y coloque el microscopio en la configuración de césped.

Ajuste el láser de excitación para que esté descentrado al golpear la apertura posterior del objetivo de césped, lo que hará que el láser se desvíe al llegar al tope de deslizamiento de la cubierta hacia la cara. Siga ajustando la posición de incidencia del láser hasta que se alcance el ángulo crítico y el láser se refleje. Busque una celda para obtener una imagen con varias partículas de oro a la vista.

A continuación, establezca una región de interés que encierre la célula o una región de la misma y las partículas de oro en caso de que ya se esté produciendo una activación suficiente debido a los altos niveles de expresión. Comience la adquisición con el láser de 405 nanómetros apagado y el láser de 561 encendido. De lo contrario, encienda el láser de 405 nanómetros en la configuración de potencia más baja de fábrica y auméntelo gradualmente hasta que haya decenas de moléculas por cuadro o para que las moléculas individuales estén bien separadas.

A medida que continúa la adquisición de datos, aumente gradualmente la potencia del láser de 405 nanómetros para mantener la densidad del punto aproximadamente constante. Continúe la adquisición de imágenes hasta que sea alto 4 0 5. El poder ya no inicia.

Los eventos de activación finalizan para procesar imágenes. Descargue el software de procesamiento de imágenes. Abra MATLAB y cargue el software de lectura WFI.

Vea la secuencia de imágenes sin procesar y determine la región de interés o el retorno de la inversión, seleccione el área de la pila que se procesará haciendo clic con el botón izquierdo y arrastrando un cuadro alrededor del área deseada. Si la región de interés no se redujo durante la adquisición, seleccione un área más pequeña para disminuir el tiempo de cálculo para anular la selección de un área y procesar todo el fotograma con el botón derecho Haga clic en cualquier parte de la imagen siguiente para definir un conjunto de marcadores fiduciarios, como las nanopartículas de oro absorbidas en el cubreobjetos, que están bien aislados, uniformes y con forma y presentes en el campo de visión en toda la pila de imágenes. Comience seleccionando una partícula de oro candidata haciendo clic con el botón izquierdo en su imagen y arrastrando un pequeño cuadro a su alrededor.

En Seguimiento de partículas, haga clic en el botón de seguimiento. Aparecerá un gráfico que muestra la posición de la partícula de oro seleccionada en la pila de imágenes que representan el alcance de la deriva. Repita este proceso para rastrear tantas partículas de oro como sea posible y determine las partículas que se rastrean juntas. Idealmente.

La deriva general es de la magnitud de 0,1 píxeles como máximo, uno a la vez. Seleccione las partículas de oro que se rastrearon juntas y bajo seguimiento de partículas. Haga clic en el botón Agregar marcador.

Aparecerá una cruz verde que significa que la partícula se ha agregado como marcador y se utilizará para corregir la deriva. Ajuste el rango sigma, el rango de suavizado y el umbral según sea necesario cambiando ligeramente el valor. Haga clic en el botón buscar partícula para probar la configuración e inspeccionar visualmente las partículas del proceso, como las moléculas de cereza PAM que son relativamente redondas y brillantes, se empaquetarán y las que no lo sean se dejarán fuera.

Para comenzar a procesar las imágenes, haga clic en el botón crear archivo de cable y guarde el archivo con el nombre deseado para procesar posteriormente las imágenes y renderizar la imagen de la palma. Inicie el paquete palm en MATLAB, cargue el archivo dot core que se acaba de crear. Aparecerá una imagen renderizada en el cuadro de imagen junto a los botones de control.

Ordene las coordenadas individuales utilizando los siguientes valores típicos. Para PAM Cherry uno, la combinación de fotogramas es igual a ocho. La combinación de la distancia en nanómetros es igual a 100 y el mínimo RMS es igual a cuatro.

La bondad de ajuste mínima es igual a 0,25 y la excentricidad máxima es igual a 1,4. Haga clic en el botón de ordenación para generar un nuevo conjunto de coordenadas seleccionadas listas para renderizar imágenes de alta resolución. Introduzca valores para la representación correcta de la imagen final, como el tamaño de píxel sin procesar, tal como se determinó anteriormente, el tamaño de entidad deseado en la imagen renderizada, que normalmente se establece en un valor ligeramente superior a la localización media y el tamaño de píxel, como 10 nanómetros.

Para la imagen renderizada, haga clic en el botón renderizar para generar la imagen de la palma. A continuación, utilice los iconos de aumento más y menos en la barra de herramientas de la ventana de la figura para acercar y alejar el zoom y realizar un seguimiento de moléculas individuales en células vivas. Trate la superficie de cultivo de tejidos y coloque las células en placas como se describió anteriormente en este video.

Asegúrese de que el cubreobjetos tenga el grosor adecuado para la microscopía configurada después de seccionar las células y realizar los tratamientos e incubaciones necesarios para el experimento, coloque la placa de cultivo en una incubadora en el escenario. Deje que el plato se asiente en el escenario durante unos minutos hasta que la temperatura y la concentración de CO2 se estabilicen en este paso. Bloquea los láseres.

Si el control de CO2 no está disponible, cambie a un medio independiente de CO2 justo antes de obtener imágenes, como el L 15 de Leibovitz para deprimir la fluorescencia de fondo, finalmente adquiera imágenes como se demostró anteriormente, estableciendo un tiempo de exposición adecuado para garantizar una buena relación señal-ruido sin perder la resolución del tiempo. La palma BFC en esta figura es el mutante KRAS G 12 D que interactúa con el dominio de unión de RAs o RBD de CRAF. Cada una de las cuatro combinaciones que se muestran aquí se introdujeron en células U2 OS utilizando células de infección lentiviral con dos de las configuraciones que tenían fuertes señales positivas de BFC, identificadas por el aumento abrupto de la fluorescencia cuando se encendió el láser de 405 nanómetros debido a la fotoactivación de la PAM Cherry reconstituida por BFC, como se demuestra aquí, utilizando los mismos ajustes experimentales que con la PAM Cherry principal.

Se generó una fuerte señal de BFC después de la infección con RN R y RAF RBD RC. Aquí, RN y RC denotan el fragmento terminal n y C de PAM Cherry uno respectivamente cuando se amplían en moléculas individuales y su distribución espacial a nanoescala se puede ver claramente en este experimento donde se realizó un seguimiento de una sola molécula para adquirir trayectorias de difusión de ARs individuales. Complejos RAF RBD bajo iluminación continua con láseres de 561 nanómetros y 405 nanómetros. PA individual m cereza una molécula st.

Se encienden y duran unos pocos fotogramas antes de entrar en estados oscuros en los que se encuentran inmóviles o móviles. Este gráfico de registros para múltiples moléculas ilustra claramente ambos tipos de trayectorias. La misma distribución heterogénea de los estados de difusión se puede inferir del histograma del desplazamiento de las moléculas entre los fotogramas sucesivos dominados por la masa.

Esta técnica se puede realizar en una a tres semanas, dependiendo de si los constructos son trascendentes, transfectados u oprimidos de manera estable si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe preparar controles como los Putins mutantes que carecen de la interacción que sigue este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como un análisis de conglomerados, para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo se organizan espacialmente las interacciones de las proteínas en la célula?

Para el seguimiento de células de laboratorio, se puede realizar un seguimiento de una sola partícula base de evaluación para determinar los estados de difusión y las probabilidades de transición después de su desarrollo. Esta técnica se está utilizando en nuestro laboratorio en el campo de la biología del cáncer para explorar las interacciones de los impulsores de la AR, así como los receptores homo y su familia en las células tumorales humanas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseñar e implementar una biopsia de la palma de la mano para investigar una interacción de proteínas de interés.

No olvide que trabajar con antivirus y las células tumorales puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como los protocolos estándar de bioseguridad al realizar este procedimiento.