A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos materiales basados en gel de alma para la fabricación de microarrays y utilizarlos para ensayos de enzimas de nanovolumen. Esto se logra identificando primero los materiales que tienen tiempos de ación lo suficientemente largos como para evitar la gelificación en el pin de impresión del microarray durante el proceso de impresión. El segundo paso es evaluar los materiales con tiempos de ación prolongados por su capacidad para imprimir como microarrays, reproducibilidad, resistencia al agrietamiento, calidad de adhesión, separación de fases indeseable y, en última instancia, alta actividad de las enzimas atrapadas.

A continuación, se imprime la enzima de interés como un microarray utilizando los materiales óptimos y se prueba su capacidad para sobrelocalizar la solución del ensayo y generar una respuesta enzimática medible. El paso final es evaluar los materiales por su capacidad para proporcionar ensayos altamente reproducibles utilizando la enzima de interés y generar datos cuantitativos. A continuación, se elige el material final para la fabricación de matrices.

En última instancia, los microarrays de proteínas derivados del gel del alma se utilizan para identificar moléculas pequeñas que reducen la actividad enzimática. La principal ventaja de este método sobre los métodos existentes, como el cribado en placas, es que se pueden cribar grandes cantidades de materiales de forma sistemática y muy rápida utilizando volúmenes bajos de reactivos. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque es posible que los materiales se gelifiquen dentro de los pines de impresión.

Si luego se limpian correctamente, se perderán puntos que pueden interpretarse como materiales no imprimibles. Para comenzar, prepare las numerosas soluciones de aditivos como se describe en el protocolo de texto adjunto. Muchas de las soluciones pueden prefabricarse y almacenarse hasta un mes o más en las condiciones correctas, pero algunas deben prepararse el día del experimento.

Mezcle las sierras a base de silicato de sodio inmediatamente antes de usarlas y asegúrese de mantenerlas en hielo. El SOS debe usarse dentro de una hora después de agregar el agua, ya que los períodos de espera más largos resultan en tiempos de DACIÓN disminuidos e inconsistentes. A continuación, prepare varias combinaciones de tampones, polímeros salans y carriles de órganos como se indica en el protocolo de texto adjunto para identificar qué combinaciones se pueden utilizar como material imprimible con tiempos de dilatación superiores a 2,5 horas.

Una vez que se han identificado varias combinaciones, ajustar la humedad dentro de la cámara de impresión a 80 a 90%humedad de menos del 80% puede resultar en evaporación de la muestra e inconsistencias en la impresión debido a los pequeños volúmenes de deposición con la impresora. Ahora listo, organice los patrones de matriz que se imprimirán con el programa Chip Writer Pro. Establezca el recorrido en la dirección XY en 10 milímetros por segundo y la velocidad de aproximación de la muestra en la dirección Z en dos milímetros por segundo con el tiempo de carga de la muestra de 2,5 segundos utilizando las combinaciones de gel de sierra identificadas anteriormente.

Prepare 25 microlitros de los materiales base combinando los polímeros correspondientes, los carriles orgánicos y los aditivos de moléculas pequeñas identificados a través del proceso de preselección. Usando pilas de 50 milimolares con un pH de 8.0 en pocillos individuales de una placa de microtitulación de 384 pocillos. A continuación, sonique hasta cuatro clavijas de funda ranuradas de 100 micras de diámetro en agua destilada doble.

Después de 15 minutos, pruébelos bajo un chorro de nitrógeno. A continuación, utilice un limpiador de pipas para eliminar la humedad residual del interior del soporte del pin y coloque con cuidado el pin en el cabezal de impresión del robot de impresión de pines de contacto. Si no se elimina la humedad residual, es posible que el pasador se mueva libremente con el soporte, lo que puede provocar que se pierdan puntos.

A continuación, añada 25 microlitros del SA respectivo al pocillo justo antes de imprimir. Mezcle la solución con un movimiento de pipeteo hacia arriba y hacia abajo Repetido 50 veces al mezclar con pipeta. Minimice la cantidad de aire incorporado a la solución.

Las burbujas de aire evitan la carga completa de la muestra dentro del pasador. A continuación, cargue el pin bajándolo a la muestra. Una vez que se hayan cargado los pines, comience el proceso de impresión e imprima la muestra en una superficie de deslizamiento.

Detenga el proceso de impresión antes de agregar sal a la placa de origen posterior. Bueno, con el proceso en pausa, retire el pin de impresión con un imán y coloque un limpiador de pipas en el cabezal de impresión para evitar la acumulación de humedad en el cabezal de impresión. A continuación, enjuague el pin de impresión con agua bidestilada y sonicéelo con agua bidestilada limpia durante 30 segundos.

A continuación, seque el pin de impresión bajo un chorro de nitrógeno y, a continuación, vuelva a colocarlo en el cabezal de impresión. Continúe mezclando, imprimiendo y limpiando todas las muestras que quedan dentro de la placa de origen hasta 12.000 puntos, 100 micras de diámetro se pueden depositar en un solo portaobjetos. Una vez finalizada la impresión, envejezca la matriz durante un mínimo de 30 minutos y hasta 24 horas dentro de la cámara de impresión con una humedad del 80 al 90%.

Prepare 50 microlitros del control positivo justo antes de usar combinando 25 microlitros de un milimolar de yoduro de acetilcolina y 0,14 microlitros de cinco milimolares bodi pi, cisteína FIL y 25 milimolares tris a pH 7,0 con 4% de glicerol en el pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar sin crear burbujas. A continuación, prepare los controles negativos justo antes de su uso combinando 0,14 microlitros de cisteína boai PI FIL de cinco milimolares con 49,86 microlitros de triss de 25 milimolares a pH 7,0 con 4% de glicerol en otro pocillo de una placa de micro titulación de 384 pocillos y mézclelos suavemente sobre la impresión de los controles en los microarrays envejecidos utilizando los mismos procesos descritos en la sección anterior. Sin embargo, en lugar de los pasadores de 100 micras de diámetro, ranuró los pasadores principales con un diámetro de 235 micras.

Esto asegura que las soluciones cubran completamente los puntos depositados previamente. Las manchas envejecen las matrices en un 80 a 90% de humedad durante una hora a temperatura ambiente debido a la autohidrólisis de la acetilcolina. Los tiempos de incubación más largos pueden dar lugar a falsos positivos debido a la mayor actividad enzimática.

Asegúrese de que el generador de imágenes alpha innotech novo array esté encendido y equipado con un filtro de excitación de 478 más o menos 17 nanómetros y un filtro de emisión de 538 más o menos 21 nanómetros para la medición de los microarrays de acetilcolina esterasa. A continuación, coloque la corredera en el soporte de la corredera con los puntos hacia arriba. Establezca el número de secciones de previsualización de modo que al menos una a cada lado del portaobjetos del microscopio se previsualice con una resolución mínima de cuatro micrómetros mediante la exposición automática.

Una vez que los parámetros se consideren aceptables, adquiera una imagen de diapositiva y guárdela como un archivo TIFF. A continuación, abra la imagen de diapositiva adquirida en la imagen J 64. Haz clic en la Herramienta de Selección Oval y selecciona cada punto.

Seleccione una región ligeramente más grande que el punto observado y asegúrese de utilizar un tamaño consistente entre los puntos para reducir la subjetividad de la imagen J. A continuación, mida la intensidad de la señal de cada punto utilizando la opción de medición. En la pestaña Analizar. Promedie la intensidad de 25 puntos de control positivo similares y divida por la intensidad promedio de 25 puntos de control negativo similares para obtener proporciones de control positivo a control negativo para las composiciones de material individuales.

Aquí se muestra un ejemplo del rango dinámico de los microarrays resultantes preparados utilizando estos métodos. Los controles altos dieron como resultado regiones verdes brillantes, mientras que los controles bajos dieron como resultado puntos mucho más tenues. La intensidad, medida por la imagen J 64, muestra que los controles altos promediaron alrededor de 22.000 unidades fluorescentes relativas, y los controles bajos promediaron cerca de 8.000.

Las líneas punteadas representan tres desviaciones estándar de la media. A continuación se muestran ejemplos de microarrays para el cribado de una matriz de honor de análogos sintéticos de alcaloides amerales identificados como compuesto uno y compuesto dos. Ambos ejes representan el porcentaje de enzima determinado por la señal fluorescente.

Por duplicado, la cercanía de los puntos a la diagonal representa una alta reproducibilidad del ensayo. Aquí se muestran gráficos IC 50 de dos inhibidores potenciales diferentes. El compuesto uno dio como resultado un nivel de IC 50 de 16 micromolares, mientras que el IC 50 del compuesto dos fue de 21 micromolares Los puntos representativos se muestran arriba para ilustrar las diferencias en la señal proporcionales a las concentraciones de inhibidores.

La matriz que se muestra aquí se imprimió con cuatro quinasas diferentes, P 38 map quinasa, EGFR y GSK, y se sobreimprimió con tampón solo que contenía A TP y tampón que contenía A TP y starro esporina un inhibidor de la actividad enzimática. Los resultados muestran un efecto significativo del inhibidor de la quinasa starro sporin en función de las intensidades de fluorescencia resultantes, como se describe aquí. La mayor diferencia observada en la concentración de esporina stor utilizada aquí fue de los puntos P 38.

Aquí, se muestran los puntos representativos de un microarray P 30 8:00 AM BP, que fueron sobremanchados con diferentes concentraciones de stor sporin. Como se ha indicado, se determinó que el IC 50 de esta molécula es de un micromolar y se muestra en el gráfico de la derecha una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en pocas horas si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento.

También se pueden realizar otros métodos, como los inmunoensayos o los ensayos de interacción de proteínas, para responder a preguntas adicionales relacionadas con el diagnóstico o el descubrimiento de moléculas pequeñas.