Name: A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a desarrollar microarrays de proteínas con sol-gel para cribado de moléculas pequeñas usando acetilcolinesterasa y multikinasa. Este método optimiza la fabricación y mejora la reproducibilidad de ensayos enzimáticos.

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Los autores agradecen a Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge y Laura Lautens para la asistencia en el desarrollo de microarrays de la proteína. Los autores también agradecen a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) por financiar este trabajo. Los autores también agradecen a la Fundación Canadiense para la Innovación y la Innovación Confianza Ontario para apoyar este trabajo. JDB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en Química bioanalíticos y Biointerfaces.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

La metodología descrita aquí fue seleccionado como el más adecuado para la identificación de los materiales derivados de sol-gel para imprimir con una impresora de contacto, produciendo un tiempo-y el procedimiento rentable para la rápida identificación de los materiales óptimos sin tener que cribar un gran número de materiales. De un total de ~ 20.000 materiales potenciales, era posible identificar ~ 200 materiales que eran adecuados para la impresión sobre la base de tiempo de gelificación solo. Esto reduce de manera significativa el número de materiales necesarios para estar preparados para los ensayos de impresión posteriores. Estos materiales imprimibles a continuación, se imprimieron en 4 superficies de deslizamiento para un total de 768 combinaciones de material de diapositivas. En promedio, 50 puntos / replica de un material se puede imprimir en aproximadamente 3 minutos, incluyendo la carga de la muestra, la deposición de punto y limpieza pin. De ellos, 155 materiales, o más o menos 20%, se permite imprimir el número máximo de puntos por la absorción de solución y producen tamaños de punto reproducibles. Cabe señalar que de la 4 slsuperficies ide probados, materiales impresos mejor en el orden: amina&gt; epoxi&gt; aldehído&gt; PMMA, PMMA diapositivas no produjeron matrices útiles para cualquier material. Esto se atribuye probablemente a la polaridad de la superficie de recubrimiento. La comparación de las superficies de deslizamiento antes mencionados, la amina más polar y epoxi se adaptan mejor para los soles acuosos en comparación con las diapositivas de PMMA. Por otra parte, de las superficies ensayadas, los portaobjetos recubiertos de amina proporcionan una superficie de potencial cargado positivamente para el depositado aniónico sol para unir. Nosotros sospechamos, la nanopartículas de sílice en la interfaz entre la corredera y el sol de interactuar a lo largo de la superficie. Tanto el epoxi y las superficies de deslizamiento aldehído carecen de la misma interacción de carga basado en inicial. Para garantizar la deposición óptima lugar es muy recomendable utilizar diapositivas pre-recubiertos de un proveedor como Arrayit. Recubrimiento en la casa produce superficies inconsistentes que conducen a la mala reproducibilidad punto 13 y, en algunos casos, puede conducir a problemas de cuantificaciónblemas. 18 De igual importancia, la temperatura y la humedad afectan a la &quot;impresión&quot; de los materiales. Si bien no se realizaron estudios detallados sobre los efectos relacionados con la temperatura, la impresión siempre se llevó a cabo a temperatura ambiente (23 ± 3 ° C). Humedad (mayor que 80%) también se controla dentro de la cámara de impresión para evitar la deposición de forma irregular debido a la deposición de pequeños volúmenes (0,7-2,3 nl) y la evaporación. Mientras la pantalla del material fue guiada hacia la identificación de los materiales derivados de sol-gel óptimas específicamente para la impresión de la AChE y quinasas, un pequeño conjunto de materiales fueron identificados que trabajó para ambos tipos de proteínas. En efecto, tanto de los materiales que fueron identificados para la fabricación de microarrays quinasa se basaron en SS + PVA + glicerol, y ambos materiales también fueron identificados dentro de los 26 materiales seleccionados para microarrays de AChE. Estos materiales &quot;óptimas&quot; pueden ofrecer un punto de partida para el desarrollo de genéricos más proteen dopados con microarrays de base de sol-gel, y las pantallas pequeñas centradas alrededor de estas composiciones pueden identificar incluso mejores materiales para la fabricación de microarrays. Un segundo punto a destacar es la importancia de la enzima utilizada. En el caso de la AChE (una enzima en lugar robustos), 26 (o más o menos 40%) de los 66 materiales originales identificados como compatibles-ensayo retenido la actividad de la AChE atrapado. Sin embargo, para los más delicados quinasas, sólo 2 de las 69 composiciones con capacidad para un ensayo, o más o menos 3% de los materiales, fueron capaces de retener la actividad de todas las quinasas. Mientras que un número suficiente de diferentes enzimas no se han estudiado a hacer declaraciones concluyentes, parece que la fabricación de gran variedad de optimización con las enzimas relativamente inestable puede conducir a la identificación de materiales que pueden atrapar una gran variedad de proteínas para permitir mutliplexed microarray fabricación. Independiente de la proteína elegida, el factor de corte importante para la identificación de los materiales de impresión era la necesidad de un largotiempos de gelificación de los materiales (&gt; 2,5 horas). Cuando el desarrollo de materiales de sol-gel a base de SS, es muy importante asegurarse de que, a raíz de intercambio iónico y filtración, el sol es a aproximadamente pH 4. Sols con un pH inicial más baja puede dar lugar a materiales con un pH por debajo de lo neutro, lo que puede afectar a la actividad enzimática. 19 Ajuste de la cantidad de Dowex (resina de intercambio iónico) a la SS puede alterar el pH final de la sol. Cuando se prepara un nuevo lote de la resina de la relación de resina a SS necesita ser ajustada con el fin de producir soles a aproximadamente pH 4 siguiendo el procedimiento en la sección 2 del protocolo. Del mismo modo, la preparación de DGS cristalinas es a menudo una fuente de error asociado con la falla del material cuando se utiliza DGS soles basados ​​para el atrapamiento biomolécula. Aunque no se informó en detalle, el gran cuidado debe ser tomado durante la síntesis de DGS cristalinas, en particular, la necesidad de evitar la presencia de agua durante la síntesis, que puede producir sílice polyglyceratedTES en lugar de DGS monoméricas. También, debido a la naturaleza higroscópica de DGS, la muestra cristalina necesita ser almacenado desecado y utilizarse dentro de 6 meses después de la síntesis. DGS cristalinos mayores de 6 meses no pueden disolverse completamente (debido al material de silicato de poliglicerol parcialmente condensado) incluso con sonicación en un ambiente ácido. DGS incompleta disolución produce soles con contenido de sílice desconocido e incontrolable y por lo tanto, los materiales menos robustos. Un punto importante a destacar con impresión por contacto es la calidad de los pasadores. Pines dañados o mal manejo (Figura 9) nunca se producen matrices reproducibles independientes del material que se imprime. Se recomienda comprobar la calidad de pin utilizando un microscopio de disección para garantizar pins roto u obstruido no se utilizan. El manejo cuidadoso asegura una larga vida de los pines. Libre circulación de la espiga es también importante. En los casos en que la humedad es atrapada en el cabezal de impresión entre la cabeza y el pasador, el pasadorno asiento correctamente y por lo tanto no va a hacer buen contacto con la superficie, lo que resulta en una falta de deposición de material. En conclusión, hemos aportado un enfoque de estudio detallado, de múltiples etapas para el desarrollo de proteínas de alta densidad de microarrays dopados pin-impresas. La selección implica la optimización de las propiedades del material (tiempo de gelificación y capacidad de impresión) para permitir la impresión de los materiales, seguida por el cribado más centrado para identificar materiales que son compatibles con un ensayo dado y capaz de retener la actividad enzimática. Este enfoque de detección de material guiada puede aplicarse a formatos de microarrays adicionales para reducir el tiempo y costo asociado con la producción eficiente de alta densidad de microarrays.

Microarrays han ganado popularidad dentro de la comunidad científica como un método para aumentar el rendimiento del ensayo. Desde el desarrollo de la tecnología de microarrays para evaluar la expresión de genes 1 a mediados de la década de 1990, los microarrays han encontrado uso en el desarrollo de ensayos de alto rendimiento para identificar la proteína-proteína y proteína-interacciones de moléculas pequeñas, y para encontrar nuevos materiales con propiedades únicas. 2-5 Más recientemente, se han desarrollado micromatrices de materiales específicos en el que se utilizan para inmovilizar proteínas funcionales, la producción de un elemento de microarrays de tres dimensiones en el que se atrapan las proteínas, lo que permite la medición fácil de la actividad enzimática y la inhibición en el propio microarray utilizando una fluorescencia adecuado ensayo que está acoplado a la rotación de sustrato. 5-10 Es importante destacar que, tales micromatrices pueden ser diseñados para incluir todos los componentes necesarios para seleccionar las muestras y los controles juntos de una manera altamente paralelo. 5,8 &lt;/ P&gt; Los primeros ejemplos de microarrays de proteínas se preparan típicamente utilizando métodos estándar para la inmovilización de proteínas sobre soportes sólidos, tales como unión covalente, 11 afinidad de captura 3 y adsorción física. 12 Si bien estos métodos de bio-inmovilización permiten un aumento de la concentración de la muestra y la cinética de reacción acelerada requerido para miniaturización ensayo, cada uno de ellos sufren inconvenientes. En general, todos causan una reducción de la funcionalidad biomolécula nativa debido a una modificación química de la superficie, dificultado el acceso a los sitios activos, o la orientación incorrecta debido a la inmovilización no específica. Por lo tanto, todos los métodos dan lugar a la sensibilidad del ensayo menor a pesar de un aumento en la deposición de biomolécula, una respuesta que probablemente surge debido a la necesidad de unir artificialmente biomoléculas a una superficie. Un enfoque emergente para la producción de micromatrices de biomoléculas funcionales es a través del pin-impresión de la proteína-dopadosoles de sílice sobre soportes sólidos, que son típicamente portaobjetos de vidrio o bien funcionalizados o pocillos individuales de placas de micropocillos. El proceso sol-gel en sí se lleva a cabo en un medio acuoso a temperatura ambiente, y que es el precursor líquido que se imprime y luego los geles a biomoléculas atrapan dentro de la matriz 3D, lo que permite alta carga de proteína 13 así como atrapamiento de múltiples componentes dentro de el mismo elemento de microarrays. 13,14 de costura en el material derivado de sol-gel se puede hacer a través de una cuidadosa selección de diferentes precursores de sílice, así como mediante la alteración de la componente acuoso a través del uso de diferentes tampones (pH, fuerza iónica), y la inclusión de los diversos aditivos (polímeros, moléculas pequeñas) para lograr un material óptimo, la naturaleza específica de los cuales depende de la biomolécula que está atrapado. 10 Una limitación potencial asociado con el desarrollo de sol-gel derivadas microarrays de proteínas a través del pin de impresión esla necesidad de identificar los materiales compuestos basados ​​en sol-gel que se pueden imprimir sin gelificante en la clavija o mostrar propiedades indeseables (tamaños irreproducibles punto, grietas, falta de adherencia, la incompatibilidad con los componentes del ensayo, la actividad de la proteína deficiente) una vez impresas en una superficie. 5 Simultánea optimización de todos estos parámetros se opone a un enfoque en el que los materiales se pueden diseñar de novo, o examinó lentamente de una manera en serie. Por otro lado, la selección aleatoria de muchos miles o decenas de miles de materiales no es ni de tiempo ni rentable. En este artículo se describe un método de detección ordenado que permite una rápida identificación de los materiales adecuados para la producción de microarrays de proteínas sin la necesidad de defender al azar una gran cantidad de materiales. Utilizando un enfoque de guiado, los materiales adecuados para la impresión de microarrays se identificó por primera vez, seguida de una serie de pantallas de pequeña escala para identificar óptima de sol-gel deriva materialescombinaciones al que se pueden imprimir reproducible, sin agrietarse y son compatibles con un ensayo dado. Por último, se identifican los materiales óptimos sobre la base de la retención de la actividad de la enzima y el rendimiento en un ensayo de cribado de pequeña molécula final. De esta manera, los materiales óptimos pueden ser identificados a partir de muchos miles de candidatos utilizando sólo unos pocos cientos de pasos del ensayo. Demostramos este enfoque para la fabricación tanto de la acetilcolinesterasa de alta densidad y microarrays de multicinasa y el uso de tales microarrays para la detección de molécula pequeña.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td></tr><tr><td>Poli(alcohol vinílico) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>80% hidroloizado, Mw 600</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>solución al 50% en peso en agua</td></tr><tr><td>Carboxietilsilanilantriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>25% en agua</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysililpropyl) gluconamida (GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>50% en etanol</td></tr><tr><td>bis[(3-metildimetoxisilil)propil]óxido de polipropileno (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metiltrimetoxisilano (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(trietoxisililia)etano (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalosa dihidratado</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&épsilon; -Acetil-L-lisina</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, 1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 1.0 N/0.1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diglicerosilano (DGS)</td><td></td><td></td><td>Preparado en laboratorio</td></tr><tr><td>Solución de silicato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 resina de iones Exchance</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yoduro de acetiltiocolina</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetilcolinesterasa de Electrophorus electricus (anguila eléctrica)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystine</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de sal disódica (ATP) de adenosina 5'trifosfato</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinasa 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), EMD activo</td><td>Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Donado por Millipore</td></tr><tr><td>Glucógeno sintasa quinasa 3 y beta; (GSK-3&beta;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteína básica de mielina (MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Sustrato para MAPK2 y p38&alpha;, donado por Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Sustrato para GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>Poly-glu-tyr polipéptido p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>Sustrato para EGFR</td></tr><tr><td>Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pin sigiloso</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de amina</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de aldehído</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos Exposy</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de poli(metilmetacrilato) (PMMA)</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&mu; m filtro de jeringa</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Virtek Contact Printer</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Generador de imágenes de portaobjetos de fluorescencia Novaray</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de microarrays de sobremesa</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Se utiliza para filtrar toda el agua necesaria para los experimentos</td></tr></tbody></table>

a materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays han encontrado su uso en el desarrollo de ensayos de alto rendimiento de nuevos materiales y el descubrimiento de los cables de drogas de moléculas pequeñas. Aquí se describe un método de detección de material guiada para identificar materiales a base de sol-gel que son adecuados para la producción de tres dimensiones microarrays de proteínas. El enfoque identifica primero los materiales que se pueden imprimir como microarrays, se estrecha hacia abajo el número de materiales mediante la identificación de aquellos que son compatibles con un ensayo de enzima dada, y luego en piedras de afilar en materiales óptimos sobre la base de la retención de la actividad enzimática máxima. Este enfoque se aplica para desarrollar micromatrices adecuados para dos ensayos de enzimas diferentes, uno utilizando la acetilcolinesterasa y la otra usando un conjunto de cuatro quinasas clave implicados en el cáncer. En cada caso, era posible producir micromatrices que podrían ser utilizados para ensayos de cribado de moléculas pequeñas cuantitativos y la producción de curvas de respuesta a inhibidores dependientes de la dosis. Es importante destacar que la capacidad de cribar muchos compañeroriales producen información sobre los tipos de materiales que mejor se adapten tanto la producción de microarrays y la retención de la actividad enzimática. Los datos de los materiales proporcionan una idea de las necesidades de material de base necesarias para la adaptación óptima microarrays derivados de sol-gel de alta densidad.

Mediante la realización de un análisis de factor de guiado para el material de pantalla, hemos sido capaces de minimizar el número de materiales probados de ~ 20.000 a unos pocos centenares que tuvo tiempos de gelificación adecuados para la impresión. Mediante la aplicación de una norma estricta que requiere tiempo de gelificación del material de 2,5 horas o más, nunca se imprimieron materiales que puedan obstruir los pins impresión o producir matrices irreproducibles. Los materiales imprimibles identificadas tener suficientes (&gt; 2,5 hr) tiempos de gelificación se imprimieron en 4 diferentes superficies deslizantes de vidrio funcionalizadas. Con el fin de ser considerado &quot;imprimir&quot;, el número máximo de puntos por volumen de absorción del pasador tuvo que ser impreso (SMP3 = 200). Las manchas también se evaluó la morfología del terreno para asegurar que no separación de fases agrietamiento o indeseables se había producido usando microscopía de campo claro sencilla como se muestra en la Figura 2. A partir de esta etapa de materiales imprimibles identificados, microarrays se producen con la AChE yquinasas incorporados en el componente acuoso tamponado. Materiales que eran compatibles con el procedimiento de ensayo (incluyendo el potencial sobreimpresión y el lavado o la tinción pasos) se identificaron mediante la observación de la retención de manchas de microarrays (sin grietas, pérdida de puntos o patrones inusuales de fluorescencia) y un control positivo (CP) con el control negativo (NC ) relación mayor que 1 como se observa a través de la imagen. Como esto era más o menos 50% de los materiales, una mayor proporción de PC / NC de 3 se utilizó para definir los materiales óptimos con retención de la actividad de la proteína. A través de este método, 26 materiales derivados de sol-gel que contienen materiales AChE y 2 que contienen quinasas cumplieron los criterios de&gt; 3 PC / NC. Figura 3 y la Figura 4 muestran un desglose gráfica de los 5 pasos en pantalla guiadas materiales para la identificación de la AChE y quinasa óptima microarrays, respectivamente. Los ensayos también pueden ser validados a través de la generación de puntuación de un Z-17. </sup&gt; Esto se hizo utilizando el material que produce la mayor proporción de PC / NC. Figura 5 muestra la trama de la Z &#39;obtiene mediante la comparación de la señal generada a partir de 200 puntos, 100 PC y 100 NC después de sobreimpresión el colorante indicador y el sustrato de la matriz de la AChE. El dolor y los arrays quinasa resultaron en las respectivas puntuaciones Z &#39;de 0,60 y 0,67, indicativo de un excelente ensayo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, antes de validación de un ensayo, enzima, tinte, sustrato y cofactor de concentraciones en-matriz tenían que ser optimizado por la sobreimpresión de un intervalo de concentraciones de cada componente y la selección de la concentración que produce la señal más alta, como se describe en detalle en otra parte . 5 Para validar los ensayos, se obtuvieron datos cuantitativos de inhibición mediante inhibidores de la AChE conocidos y desconocidos, con resultados realizados por duplicado y se utiliza para producir lotes duplicados (Figura 6A) y las curvas de inhibición (Figuras 6B y 6C). &lt;strong&gt; Spots fueron sobreimpresas primero con mezclas de inhibidores de moléculas pequeñas biológicamente activas conocidas entonces con el tinte y el sustrato, y se incluyeron mezclas de control que contengan cualquiera de los inhibidores conocidos o no inhibidores. Parcelas duplicadas fueron generados para evaluar la actividad de la enzima, y ​​cualquier mezcla de los que dieron lugar a la actividad enzimática a menos de 25% se consideraron positivos para la inhibición. Son compuestos individuales de tales mezclas se ensayaron a continuación por duplicado para identificar la molécula pequeña específica (s) responsable de la inhibición. Una vez identificadas, estas moléculas pequeñas se utilizaron para generar curvas de inhibición cuantitativos para determinar los valores de IC50 y las constantes de inhibición. Resultados cualitativos similares fueron obtenidos utilizando la matriz multicinasa con un inhibidor de quinasa común, estaurosporina. Figura 7A y 7B muestran la imagen de microarrays e indican que las intensidades de la señal después de sobreimpresión y tinción de la multicinasaarray son los esperados para un control negativo (- ATP), control positivo (+ ATP) y el inhibidor conocido (+ ATP + inh). Para demostrar la capacidad de obtener datos cuantitativos de inhibición de los microarrays, un ensayo de inhibición dependiente de la concentración se hizo por una única quinasa. Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, intensidad de la señal disminuye a medida que aumenta la concentración de inhibidor, y la respuesta sigue la curva de inhibición dependiente de la concentración esperada para el sistema p38α/MBP quinasa / sustrato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática general para el método de detección materiales guiada. Cada bloque representa un paso de la pantalla en orden secuencial. Los números de la izquierda representan el número total de los materiales preparados para el análisis. El uso de un tiempo de gelificación mayor que 2,5 h (materiales con tiempos de gelificación de menos de 2,5 hr are indica el ponche), el número de materiales que pasaban cada etapa y llevado adelante durante la pantalla de materiales se indican con el número de la derecha. * Representa materiales con menos de separación de fases óptima. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figura 2. Las imágenes ópticas que muestran varios modos de fallo de los materiales en el paso de impresión de la pantalla. Una imagen de un material de &quot;buena&quot; (segunda fila, tercera columna) se muestra también para comparación. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figura 3. Un método de detección de material dirigido a la identificación de los materiales óptimos para la fabricación de sol-gel derivadas de microarrays AChE. Reproducido con permisión de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> La Figura 4. Un material dirigido criterio de selección para la identificación de los materiales óptimos para la fabricación de microarrays de sol-gel derivadas de quinasa. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figura 5. (A) Una sección de microarrays AChE muestran HC (verde brillante) y LC (verde claro) puntos (una paleta de negro-verde se aplicó como pseudocolor de claridad en la presentación), (B) una vista ampliada de la zona de caja para resaltar lugar morfología y la alineación;., y (C) un Z &#39;trama líneas continuas indican la media de la<html> repeticiones, mientras que las líneas discontinuas corresponden a 3SD. Reproducido con el permiso de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> La Figura 6. (A) Duplicado parcela para el cribado en-matriz de análogos sintéticos de alcaloides de Amaryllidaceae, (B) IC 50 parcelas de inhibidores potenciales identificados como compuestos marcados 1 y (C) compuestos 2, con barras de error representan una desviación estándar de la media de 25 repeticiones. puntos representativos se muestran para ilustrar las diferencias en la señal proporcional a las concentraciones de inhibidor. Reproducido con el permiso de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figura 7. El ensayo de matriz de cuatro quinasas utilizando 1.4SS/1.0PVA de atrapamiento e impresas sobre una rampa de amina-derivatizado. (A) Una imagen de una sección de microarrays en el que los puntos con quinasas co-atrapadas con sus respectivos sustratos se sobreimprimen con tampón (NC, fila superior), o soluciones que contienen ATP (PC, fila del medio) o ATP + estaurosporina (fila inferior). (B) Los gráficos de barras que comparan las intensidades de señal entre inhibidas y las reacciones no inhibidas, después de la sustracción de las señales de fondo y las barras de error representan una desviación estándar de la media de 25 repeticiones. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figura 8. Inhibiti. en el ensayo en un microarray p38a/MBP (A) Secciones de microarrays que muestran puntos representativos overspotted con concentraciones variables de estaurosporina, como se indica (las imágenes se obtuvieron por una sola exploración de la misma diapositiva, la imagen compuesta se muestra para mayor claridad). (B) IC 50 curva generada a partir de las imágenes de matriz analizados. La intensidad obtenido en 100 mM se restó de todas las imágenes; todos los demás intensidades se normalizaron mediante el establecimiento de la intensidad obtenida en 10 nM a un valor de 100% de actividad. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> La Figura 9. Imágenes de pin stealth microscópica utilizarse en contacto pin-impresión muestra varias imperfecciones: (A) obstruido, (B) doblados.

Se describe un método de detección de material guiada para desarrollar sol-gel dopados con microarrays de proteínas derivadas utilizando un método de pin-impresión emergente de fabricación. Esta metodología se demuestra a través del desarrollo de la acetilcolinesterasa y multicinasa microarrays, que se utilizan para la detección de molécula pequeña rentable.

A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos materiales a base de gel de soul para la fabricación de microarreglos y utilizarlos en ensayos de enzimas a nano volumen. Esto se logra primero identificando materiales que tengan tiempos de ation suficientemente largos para evitar la gelificación en la punta de impresión del microarreglo durante el proceso de impresión. El segundo paso consiste en evaluar los materiales con tiempos de ation prolongados según su capacidad de impresión como microarreglos, reproducibilidad, resistencia a la fisuración, calidad de adhesión, separación de fases indeseable y, finalmente, actividad elevada para enzimas atrapadas.A continuación, la enzima de interés se imprime como un microarreglo utilizando los materiales óptimos, y se evalúa su capacidad para superponer el punto con la solución de ensayo y generar una respuesta enzimática medible. El paso final consiste en evaluar los materiales según su capacidad para proporcionar ensayos altamente reproducibles utilizando la enzima de interés y generar datos cuantitativos. Luego se selecciona el material final para la fabricación del arreglo.En última instancia, las matrices microscópicas de proteínas derivadas del gel soul se utilizan para identificar moléculas pequeñas que reducen la actividad enzimática. La principal ventaja de este método frente a métodos existentes como la cribado basado en placas es que permite examinar un gran número de materiales de forma sistemática y muy rápida utilizando volúmenes bajos de reactivos. En general, las personas nuevas en esta técnica suelen tener dificultades porque es posible que los materiales se gelifiquen dentro de las puntas de impresión.Si luego se limpian adecuadamente, esto dará como resultado áreas omitidas que pueden interpretarse como materiales no imprimibles. Para comenzar, prepare las diversas soluciones aditivas según se describe en el protocolo de texto adjunto. Muchas de las soluciones pueden prepararse con antelación y almacenarse durante un mes o más bajo las condiciones adecuadas, pero otras deben prepararse el mismo día del experimento.Mezcle las sierras a base de silicato de sodio inmediatamente antes de usarlas y asegúrese de mantenerlas sobre hielo. El SOS debe utilizarse dentro de una hora de haber agregado el agua, ya que períodos de espera más largos resultan en tiempos de DATION reducidos e inconsistentes. A continuación, prepare diversas combinaciones de tampones, polímeros salans y vías orgánicas según se indica en el protocolo de texto adjunto, con el fin de identificar qué combinaciones pueden utilizarse como material imprimible con tiempos de dilatación superiores a 2,5 horas.Una vez identificadas varias combinaciones, ajuste la humedad dentro de la cámara de impresión al 80–90 %. Una humedad inferior al 80 % puede provocar evaporación de la muestra e inconsistencias en la impresión debido a los pequeños volúmenes de deposición con la impresora. Ahora, listo para comenzar, organice los patrones de matriz que se imprimirán utilizando el programa Chip Writer Pro. Establezca la velocidad de desplazamiento en las direcciones XY en 10 milímetros por segundo y la velocidad de aproximación de la muestra en la dirección Z en 2 milímetros por segundo, con un tiempo de carga de muestra de 2,5 segundos, utilizando las combinaciones de gel de sierra identificadas previamente.Prepare 25 microlitros de los materiales base combinando los polímeros, organo-cadenas y aditivos de molécula pequeña identificados mediante el proceso de preselección. Utilice acumulaciones de 50 milimoles con un pH de 8,0 en pozos individuales de una placa microtituladora de 384 pozos. Luego, someta a ultrasonido hasta cuatro alambres ranurados de 100 micrones de diámetro en agua doblemente destilada.Después de 15 minutos, pruébelos bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, use un limpiador de tubos para eliminar la humedad residual dentro del soporte del pasador y coloque cuidadosamente el pasador en la cabeza de impresión del robot de impresión por contacto con pasadores. La falta de eliminación de la humedad residual puede impedir que el pasador se mueva libremente con el soporte, lo que resulta en puntos omitidos.Luego, agregue 25 microlitros del respectivo SA al pocillo justo antes de la impresión. Mezcle la solución mediante un movimiento de pipeteo ascendente y descendente repetido 50 veces al mezclar con pipeta. Minimice la cantidad de aire incorporado en la solución.Las burbujas de aire impiden la carga completa de la muestra dentro del pin. A continuación, cargue el pin introduciéndolo en la muestra. Una vez cargados los pins, inicie el proceso de impresión e imprima la muestra sobre la superficie de un portaobjetos.Pausar el proceso de impresión antes de añadir sal a la placa fuente siguiente. Con el proceso pausado, retirar el pin de impresión utilizando un imán y colocar un limpiador de tubos en la cabeza de impresión para evitar la acumulación de humedad. Luego, enjuagar el pin de impresión con agua doblemente destilada y someterlo a ultrasonido en agua doblemente destilada limpia durante 30 segundos.A continuación, seque la punta de impresión bajo una corriente de nitrógeno y luego coloque la punta nuevamente en la cabeza de impresión. Continúe mezclando, imprimiendo y limpiando para todas las muestras restantes en la placa fuente; hasta 12.000 puntos, de 100 micrones de diámetro, pueden depositarse en un solo portaobjetos. Una vez finalizada la impresión, deje envejecer el arreglo durante un mínimo de 30 minutos y hasta 24 horas dentro de la cámara de impresión a una humedad del 80 al 90 %.Prepare 50 microlitros del control positivo justo antes de usar combinando 25 microlitros de yoduro de acetilcolina uno milimolar, 0,14 microlitros de bodi pi, FIL cisteína cinco milimolar y 25 milimolar de tris a pH 7,0 con 4 % de glicerol en el pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos. Pipetee la solución lentamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar sin crear burbujas. A continuación, prepare los controles negativos justo antes de usar combinando 0,14 microlitros de boai PI FIL cisteína cinco milimolar con 49,86 microlitros de tris 25 milimolar a pH 7,0 con 4 % de glicerol en otro pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos y mezcle suavemente. Imprima los controles sobre las micromatrices envejecidas utilizando los mismos procedimientos descritos en la sección anterior. Sin embargo, en lugar de las puntas de 100 micrones de diámetro, utilice puntas ranuradas con un diámetro de 235 micrones.Esto asegura que las soluciones cubran completamente los puntos depositados previamente. Los puntos envejecen las matrices en una humedad del 80 al 90 % durante una hora a temperatura ambiente debido a la hidrólisis espontánea de la acetilcolina. Tiempos de incubación más largos pueden provocar resultados falsos positivos debido a la actividad enzimática aumentada.Asegúrese de que el lector de microarreglos Alpha Innotech Novo esté encendido y equipado con un filtro de excitación de 478 más o menos 17 nanómetros y un filtro de emisión de 538 más o menos 21 nanómetros para la medición de los microarreglos de acetilcolinesterasa. Luego, coloque el portaobjetos en el soporte con las manchas hacia arriba. Establezca el número de secciones de vista previa de modo que al menos una en cada lado del portaobjetos sea vista con una resolución mínima de cuatro micrómetros utilizando la exposición automática.Una vez que los parámetros sean considerados aceptables, adquiera una imagen de la preparación y guárdela como un archivo TIFF. A continuación, abra la imagen adquirida de la preparación en ImageJ 64. Haga clic en la herramienta de selección ovalada y seleccione cada punto.Seleccione una región ligeramente más grande que el punto observado y asegúrese de utilizar un tamaño consistente entre los puntos para reducir la subjetividad de Image J. Luego, mida la intensidad de la señal de cada punto utilizando la opción de medición, bajo la pestaña Analizar. Promedie la intensidad de 25 puntos de control positivo similares y divídala por la intensidad promedio de 25 puntos de control negativo similares para obtener las relaciones de control positivo respecto al control negativo para las composiciones individuales de los materiales.Se muestra aquí un ejemplo del rango dinámico de las micromatrices resultantes preparadas utilizando estos métodos. Los controles altos dieron lugar a regiones verde brillante, mientras que los controles bajos produjeron manchas mucho más tenues. La intensidad medida por Image J 64 muestra que los controles altos promedian aproximadamente 22.000 unidades relativas de fluorescencia, y los controles bajos promediaron cerca de 8.000.Las líneas punteadas representan tres desviaciones estándar respecto a la media. A continuación se muestran ejemplos de microarreglos para un análisis de cribado en arreglo de honor de análogos sintéticos de alcaloides ameral sier identificados como compuesto uno y compuesto dos. Ambos ejes representan el porcentaje de enzima determinado mediante la señal fluorescente.En duplicado, la proximidad de los puntos respecto a la diagonal representa una alta reproducibilidad del ensayo. Aquí se muestran las curvas de IC50 de dos posibles inhibidores diferentes. El compuesto uno arrojó un valor de IC50 de 16 micromolares, mientras que el IC50 del compuesto dos fue de 21 micromolares. Por encima se muestran puntos representativos para ilustrar las diferencias en la señal proporcionales a las concentraciones de los inhibidores.La matriz mostrada aquí se imprimió con cuatro quinasas diferentes: quinasa p38 MAP, EGFR y GSK, y se sobrimprimió con tampón solo, tampón que contenía ATP y tampón que contenía ATP y estrosporina, un inhibidor de la actividad enzimática. Los resultados muestran un efecto significativo del inhibidor de quinasas estrosporina, basado en las intensidades de fluorescencia resultantes, como se describe aquí. La mayor diferencia observada a la concentración de estrosporina utilizada en este caso se obtuvo en los puntos correspondientes a p38.Aquí se muestran puntos representativos de un microarreglo P 30 8:00 AM BP, que fueron sobrepipeteados con concentraciones variables de stor sporin. Como se indica, la IC 50 de esta molécula se determinó en un micromolar y se muestra en el gráfico de la derecha una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como ensayos inmunológicos o ensayos de interacción de proteínas, también pueden realizarse para responder preguntas adicionales relacionadas con diagnósticos o el descubrimiento de moléculas pequeñas.

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