A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos materiales a base de gel de soul para la fabricación de microarreglos y utilizarlos en ensayos de enzimas a nano volumen. Esto se logra primero identificando materiales que tengan tiempos de ation suficientemente largos para evitar la gelificación en la punta de impresión del microarreglo durante el proceso de impresión. El segundo paso consiste en evaluar los materiales con tiempos de ation prolongados según su capacidad de impresión como microarreglos, reproducibilidad, resistencia a la fisuración, calidad de adhesión, separación de fases indeseable y, finalmente, actividad elevada para enzimas atrapadas.

A continuación, la enzima de interés se imprime como un microarreglo utilizando los materiales óptimos, y se evalúa su capacidad para superponer el punto con la solución de ensayo y generar una respuesta enzimática medible. El paso final consiste en evaluar los materiales según su capacidad para proporcionar ensayos altamente reproducibles utilizando la enzima de interés y generar datos cuantitativos. Luego se selecciona el material final para la fabricación del arreglo.

En última instancia, las matrices microscópicas de proteínas derivadas del gel soul se utilizan para identificar moléculas pequeñas que reducen la actividad enzimática. La principal ventaja de este método frente a métodos existentes como la cribado basado en placas es que permite examinar un gran número de materiales de forma sistemática y muy rápida utilizando volúmenes bajos de reactivos. En general, las personas nuevas en esta técnica suelen tener dificultades porque es posible que los materiales se gelifiquen dentro de las puntas de impresión.

Si luego se limpian adecuadamente, esto dará como resultado áreas omitidas que pueden interpretarse como materiales no imprimibles. Para comenzar, prepare las diversas soluciones aditivas según se describe en el protocolo de texto adjunto. Muchas de las soluciones pueden prepararse con antelación y almacenarse durante un mes o más bajo las condiciones adecuadas, pero otras deben prepararse el mismo día del experimento.

Mezcle las sierras a base de silicato de sodio inmediatamente antes de usarlas y asegúrese de mantenerlas sobre hielo. El SOS debe utilizarse dentro de una hora de haber agregado el agua, ya que períodos de espera más largos resultan en tiempos de DATION reducidos e inconsistentes. A continuación, prepare diversas combinaciones de tampones, polímeros salans y vías orgánicas según se indica en el protocolo de texto adjunto, con el fin de identificar qué combinaciones pueden utilizarse como material imprimible con tiempos de dilatación superiores a 2,5 horas.

Una vez identificadas varias combinaciones, ajuste la humedad dentro de la cámara de impresión al 80–90 %. Una humedad inferior al 80 % puede provocar evaporación de la muestra e inconsistencias en la impresión debido a los pequeños volúmenes de deposición con la impresora. Ahora, listo para comenzar, organice los patrones de matriz que se imprimirán utilizando el programa Chip Writer Pro. Establezca la velocidad de desplazamiento en las direcciones XY en 10 milímetros por segundo y la velocidad de aproximación de la muestra en la dirección Z en 2 milímetros por segundo, con un tiempo de carga de muestra de 2,5 segundos, utilizando las combinaciones de gel de sierra identificadas previamente.

Prepare 25 microlitros de los materiales base combinando los polímeros, organo-cadenas y aditivos de molécula pequeña identificados mediante el proceso de preselección. Utilice acumulaciones de 50 milimoles con un pH de 8,0 en pozos individuales de una placa microtituladora de 384 pozos. Luego, someta a ultrasonido hasta cuatro alambres ranurados de 100 micrones de diámetro en agua doblemente destilada.

Después de 15 minutos, pruébelos bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, use un limpiador de tubos para eliminar la humedad residual dentro del soporte del pasador y coloque cuidadosamente el pasador en la cabeza de impresión del robot de impresión por contacto con pasadores. La falta de eliminación de la humedad residual puede impedir que el pasador se mueva libremente con el soporte, lo que resulta en puntos omitidos.

Luego, agregue 25 microlitros del respectivo SA al pocillo justo antes de la impresión. Mezcle la solución mediante un movimiento de pipeteo ascendente y descendente repetido 50 veces al mezclar con pipeta. Minimice la cantidad de aire incorporado en la solución.

Las burbujas de aire impiden la carga completa de la muestra dentro del pin. A continuación, cargue el pin introduciéndolo en la muestra. Una vez cargados los pins, inicie el proceso de impresión e imprima la muestra sobre la superficie de un portaobjetos.

Pausar el proceso de impresión antes de añadir sal a la placa fuente siguiente. Con el proceso pausado, retirar el pin de impresión utilizando un imán y colocar un limpiador de tubos en la cabeza de impresión para evitar la acumulación de humedad. Luego, enjuagar el pin de impresión con agua doblemente destilada y someterlo a ultrasonido en agua doblemente destilada limpia durante 30 segundos.

A continuación, seque la punta de impresión bajo una corriente de nitrógeno y luego coloque la punta nuevamente en la cabeza de impresión. Continúe mezclando, imprimiendo y limpiando para todas las muestras restantes en la placa fuente; hasta 12.000 puntos, de 100 micrones de diámetro, pueden depositarse en un solo portaobjetos. Una vez finalizada la impresión, deje envejecer el arreglo durante un mínimo de 30 minutos y hasta 24 horas dentro de la cámara de impresión a una humedad del 80 al 90 %.

Prepare 50 microlitros del control positivo justo antes de usar combinando 25 microlitros de yoduro de acetilcolina uno milimolar, 0,14 microlitros de bodi pi, FIL cisteína cinco milimolar y 25 milimolar de tris a pH 7,0 con 4 % de glicerol en el pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos. Pipetee la solución lentamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar sin crear burbujas. A continuación, prepare los controles negativos justo antes de usar combinando 0,14 microlitros de boai PI FIL cisteína cinco milimolar con 49,86 microlitros de tris 25 milimolar a pH 7,0 con 4 % de glicerol en otro pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos y mezcle suavemente. Imprima los controles sobre las micromatrices envejecidas utilizando los mismos procedimientos descritos en la sección anterior. Sin embargo, en lugar de las puntas de 100 micrones de diámetro, utilice puntas ranuradas con un diámetro de 235 micrones.

Esto asegura que las soluciones cubran completamente los puntos depositados previamente. Los puntos envejecen las matrices en una humedad del 80 al 90 % durante una hora a temperatura ambiente debido a la hidrólisis espontánea de la acetilcolina. Tiempos de incubación más largos pueden provocar resultados falsos positivos debido a la actividad enzimática aumentada.

Asegúrese de que el lector de microarreglos Alpha Innotech Novo esté encendido y equipado con un filtro de excitación de 478 más o menos 17 nanómetros y un filtro de emisión de 538 más o menos 21 nanómetros para la medición de los microarreglos de acetilcolinesterasa. Luego, coloque el portaobjetos en el soporte con las manchas hacia arriba. Establezca el número de secciones de vista previa de modo que al menos una en cada lado del portaobjetos sea vista con una resolución mínima de cuatro micrómetros utilizando la exposición automática.

Una vez que los parámetros sean considerados aceptables, adquiera una imagen de la preparación y guárdela como un archivo TIFF. A continuación, abra la imagen adquirida de la preparación en ImageJ 64. Haga clic en la herramienta de selección ovalada y seleccione cada punto.

Seleccione una región ligeramente más grande que el punto observado y asegúrese de utilizar un tamaño consistente entre los puntos para reducir la subjetividad de Image J. Luego, mida la intensidad de la señal de cada punto utilizando la opción de medición, bajo la pestaña Analizar. Promedie la intensidad de 25 puntos de control positivo similares y divídala por la intensidad promedio de 25 puntos de control negativo similares para obtener las relaciones de control positivo respecto al control negativo para las composiciones individuales de los materiales.

Se muestra aquí un ejemplo del rango dinámico de las micromatrices resultantes preparadas utilizando estos métodos. Los controles altos dieron lugar a regiones verde brillante, mientras que los controles bajos produjeron manchas mucho más tenues. La intensidad medida por Image J 64 muestra que los controles altos promedian aproximadamente 22.000 unidades relativas de fluorescencia, y los controles bajos promediaron cerca de 8.000.

Las líneas punteadas representan tres desviaciones estándar respecto a la media. A continuación se muestran ejemplos de microarreglos para un análisis de cribado en arreglo de honor de análogos sintéticos de alcaloides ameral sier identificados como compuesto uno y compuesto dos. Ambos ejes representan el porcentaje de enzima determinado mediante la señal fluorescente.

En duplicado, la proximidad de los puntos respecto a la diagonal representa una alta reproducibilidad del ensayo. Aquí se muestran las curvas de IC50 de dos posibles inhibidores diferentes. El compuesto uno arrojó un valor de IC50 de 16 micromolares, mientras que el IC50 del compuesto dos fue de 21 micromolares. Por encima se muestran puntos representativos para ilustrar las diferencias en la señal proporcionales a las concentraciones de los inhibidores.

La matriz mostrada aquí se imprimió con cuatro quinasas diferentes: quinasa p38 MAP, EGFR y GSK, y se sobrimprimió con tampón solo, tampón que contenía ATP y tampón que contenía ATP y estrosporina, un inhibidor de la actividad enzimática. Los resultados muestran un efecto significativo del inhibidor de quinasas estrosporina, basado en las intensidades de fluorescencia resultantes, como se describe aquí. La mayor diferencia observada a la concentración de estrosporina utilizada en este caso se obtuvo en los puntos correspondientes a p38.

Aquí se muestran puntos representativos de un microarreglo P 30 8:00 AM BP, que fueron sobrepipeteados con concentraciones variables de stor sporin. Como se indica, la IC 50 de esta molécula se determinó en un micromolar y se muestra en el gráfico de la derecha una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como ensayos inmunológicos o ensayos de interacción de proteínas, también pueden realizarse para responder preguntas adicionales relacionadas con diagnósticos o el descubrimiento de moléculas pequeñas.