Microarrays de ADN: Control de calidad de la muestra, la hibridación de la matriz y de escaneo

El objetivo general de este procedimiento es realizar un experimento de microarrays utilizando un aparato mezclador automatizado. Esto se logra analizando primero la calidad de las muestras de ARN con el bioanalizador después de la amplificación y el etiquetado del ARN. Las muestras de ARN se hibridan con los microarrays.

Finalmente, los microarrays hibridados se lavan y escanean. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la expresión diferencial de transcripciones de ARN mediante el análisis de imágenes de microarrays de fluorescencia de doble color. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de hibridación de microarrays son difíciles de aprender debido al equipo especializado.

El análisis de control de calidad comienza con la preparación del instrumento bioanalizador 2, 100 y la estación de cebado de virutas, según lo indicado en el procedimiento escrito. A continuación, la matriz de gel se filtra pipeteando 550 microlitros en un filtro de centrifugación provisto de una centrífuga kit de ARN 6.000 nano. El filtro a 1.500 RCF durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, alícuota el gel filtrado en alícuotas de 65 microlitros, que pueden almacenarse a cuatro grados centígrados hasta un mes. Agita el concentrado de tinte durante 10 segundos y añade un microlitro a una alícuota de 65 microlitros. Un gel filtrado después de agitar la mezcla en vórtice a 13.000 RCF durante 10 minutos a temperatura ambiente para procesar las muestras.

En primer lugar, coloque una viruta en la estación de cebado. En esta demostración, se utilizan 6.000 nanochips de ARN. Cargue nueve microlitros de la mezcla de tinte en gel en el pocillo marcado con una G blanca sobre el fondo negro.

Con la punta de la pipeta colocada en el fondo del pocillo. Coloque el émbolo de la jeringa en un mililitro y cierre la estación de cebado. Presione el émbolo hacia abajo lenta pero constantemente hasta que el clip lo sostenga.

Después de 30 segundos, suelte el clip y deje que el émbolo suba unos segundos. Después de que el émbolo se detenga, tire del émbolo de nuevo a la posición de un mililitro y abra la estación de cebado. Cargue nueve microlitros del troquel de gel.

Mezcle en cada uno de los dos pocillos. A continuación, introduzca cinco microlitros del marcador en el pocillo de la escalera y en cada uno de los 12 pocillos de muestra. Siguiente carga, un microlitro de la escalera desnaturalizada en el pocillo de la escalera y un microlitro de cada muestra desnaturalizada en los pocillos de muestra.

Finalmente, agregue un microlitro del marcador en cada muestra no utilizada. Bueno, una vez cargado, vórtice el chip durante un minuto a 2, 400 RPM. Después de iniciar el software experto 2, 100, coloque el chip y cierre la tapa.

Asegúrese de seleccionar el puerto correcto y ejecute el ensayo dentro de los cinco minutos posteriores a la carga de las muestras para evitar la evaporación. Los métodos para realizar la amplificación y el etiquetado de ARN se pueden encontrar en el protocolo escrito. Una vez marcado, purifique el CRNA para eliminar cualquier nucleótido no incorporado. Usando cogens r y mini columnas fáciles, el CRNA marcado se puede cuantificar con un fotómetro de espectros NanoDrop 2000.

En el modo de medición de microarrays, registro, concentración de la muestra, rendimiento y actividad específica. Para la hibridación de microarrays, es necesario lograr un rendimiento de al menos 825 nanogramos y una actividad específica de al menos ocho picomoles por microgramo al menos dos horas antes de la hibridación de microarrays. Encienda la estación de hibridación y ajústela a 65 grados centígrados.

Este protocolo describe el uso de matrices Agilent de cuatro por 40 4K con el sistema de hibridación de generación ágil de Roche y cuatro cámaras mezcladoras posteriores a la fragmentación de CRNA realizada como se describe en el protocolo escrito, preparan la cámara de hibridación. Coloque una corredera de micromatriz en el lado del código de barras de la herramienta de desmontaje de ensamblaje. Primero abra un mezclador A cuatro y exponga el adhesivo que sostiene la matriz y la herramienta de desmontaje del ensamblaje para evitar cualquier movimiento.

Coloque el mezclador A cuatro en la corredera comenzando por el extremo más alejado. Asegúrese de que esté correctamente alineado con la herramienta y adhiera el mezclador a lo largo de la matriz. Deslice el tirón desde el extremo de la batidora para quitar el conjunto de la batidora deslizante.

Con la herramienta de rebuzno, presione a lo largo de la junta adhesiva para asegurarse de que esté firmemente pegada a la corredera. Pequeñas burbujas de aire atrapadas entre el adhesivo y la corredera se pueden ver sobre el fondo oscuro. Tómese un tiempo adicional para eliminar estas burbujas con la herramienta de rebuzno.

La matriz ya está lista para cargarse. Utilice un perpeto de desplazamiento positivo para cargar 100 microlitros de la muestra de hibridación. Empuje la punta firmemente dentro del ojo de buey y dispense lenta y suavemente para que el aire no quede atrapado en el área de la matriz.

Cuando la muestra cubre todo el conjunto y el líquido comienza a salir por el puerto de ventilación, retire rápidamente la pipeta, solo suelte el émbolo. Una vez que la punta esté lejos del portaobjetos, frote suavemente el exceso de líquido en ambos puertos, teniendo cuidado de no sacar la muestra de la cámara. A continuación, cubra los ojos de buey con pegatinas con unas pinzas.

Coloque la corredera en la estación de hibridación y compruebe que los orificios de la vejiga estén correctamente colocados sobre las juntas tóricas. Esto asegurará una mezcla adecuada durante la hibridación. Cierre la tapa de la corredera y la tapa de la estación.

Configure la estación en el modo de mezcla B e hibrida el conjunto a 65 grados Celsius durante 17 horas. Una vez terminado, el plato de vidrio de llenado etiquetado como A con tampón de lavado uno, el plato debe ser lo suficientemente grande como para contener la herramienta de desmontaje de ensamblaje y permitir algunas maniobras también. Todos los lavados deben realizarse en cristalería, ya que el plástico tiende a lixiviar los compuestos, lo que da como resultado un alto fondo en la matriz.

Coloque una rejilla deslizante y una barra para revolver en un plato para teñir. Etiquetado como B, llene el plato con un tampón de lavado que cubra la rejilla y coloque el plato en una placa para revolver a temperatura ambiente. Además, agregue una barra para revolver en un plato para tinturas vacío etiquetado como C y colóquelo en una placa para revolver.

Retire la matriz de la estación de hibridación y colóquela en la herramienta de desmontaje de ensamblaje. Sumerja todo el conjunto en el plato a mientras sostiene la herramienta de desmontaje del ensamblaje y la corredera desde lados opuestos con una mano. Despegue con cuidado el mezclador A four, teniendo cuidado de no rayar el área de la matriz.

Coloque rápidamente el portaobjetos en la rejilla y el plato de tinción B. La exposición al aire debe minimizarse ya que el tinte SCI five es sensible al ozono. Lavar la goma de borrar durante un minuto removiendo a velocidad media. Llene el plato de tinción C con el tampón de lavado precalentado dos.

Transfiera los portaobjetos y lave durante un minuto. Después del lavado muy lento, retire la rejilla del portaobjetos del plato de tinción C para minimizar las gotas que quedan en el portaobjetos. Seque el portaobjetos girando durante dos minutos.

A continuación, coloque el portaobjetos en un tubo cónico de 50 mililitros y llénelo con gas argón inmediatamente utilizando el escáner de selección de genes 4, 000 B de dispositivos moleculares para evitar la pérdida de señal que se muestra. Estos son algunos ejemplos de cuatro muestras de ARN aisladas del cerebro humano. La calidad de la muestra de tejido tumoral se evaluó utilizando el bioanalizador 2,100 en un chip de ARN 6,000.

Las puntas de flecha sólidas y abiertas indican la posición de las especies 18 s y 28 S-R-R-N-A respectivamente. El número de integridad del ARN o RIN es una medida cuantitativa de la calidad del ARN buena calidad Total. Las muestras de ARN deben producir solo dos picos principales cuando se ejecutan en un bioanalizador para el control de calidad correspondiente a las dos especies principales de ARN ribosómico.

Parte de la degradación del ARN se mostrará como un frotis antes del primer pico de ARN ribosómico y un pico significativamente más bajo para 28 S-R-R-N-A severamente degradado. El ARN de baja calidad mostrará un pico amplio o una serie de picos en tiempos de retención bajos. Mientras que los dos picos de ARN ribosómico serán de una intensidad muy baja o no identificables en absoluto.

Los arreglos de buena calidad deben producir una señal alta a valores PMT relativamente bajos. Se espera que la mayoría de las transcripciones estén presentes a niveles similares en la muestra experimental y de referencia. Los cambios masivos y generalizados en la expresión génica probablemente carecerán de cualquier significado biológico.

Por lo tanto, la mayor parte de la matriz debe verse amarilla en lugar de verde o roja. Las señales de buena calidad también deben estar en un rango dinámico tal que los histogramas de la señal se superpongan completamente, como se ve en el diagrama de dispersión de la imagen de la matriz. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de microarrays utilizando un aparato de hibridación automatizado.