Name: Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprende a estimar el tiempo de eliminación de glutamato en membranas astrocíticas mediante análisis de deconvolución de corrientes de transportador. Este método electrofisiológico revela la dinámica sináptica en el hipocampo de ratón.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Programa de Investigación Intramural Stroke (NS002986). Como escribió el manuscrito y aplicado el análisis de deconvolución. JSD desarrolló la primera versión del análisis de deconvolución y comentarios sobre el texto.

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Aquí se describe un enfoque experimental para obtener los registros electrofisiológicos a partir de astrocitos, un protocolo de análisis para aislar corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y un método matemático para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de las corrientes transportador astrocíticos. El éxito del análisis se basa en la capacidad de obtener alta calidad patch clamp grabaciones a partir de astrocitos y en la exactitud de los algoritmos de ajus...

Los astrocitos son uno de los tipos de células más abundantes en el cerebro con morfología en forma de estrella y salientes de membrana fina que se extienden a lo largo de la neuropilo y llegan a la vecina contactos sináptica 1,2. Membrana celular Los astrocitos está densamente llena de moléculas transportadoras de glutamato 3. En condiciones fisiológicas, los transportadores de glutamato se unen rápidamente glutamato en el lado extracelular de la membrana y lo transfieren al citoplasma de la célula. Al hacerlo, los transportadores mantienen baja la concentración basal de glutamato en el espacio extracelular 4. Transportadores de glutamato en los procesos astrocíticos finas adyacentes a las sinapsis excitatoria están en una posición ideal para unirse glutamato liberado durante los eventos sinápticas como se difunde lejos de la hendidura sináptica. Al hacer esto, los transportadores de glutamato también limitan desbordamiento hacia peri-y extra-regiones sinápticas y en las sinapsis vecinas, la reducción de la propagación espacial de la señal excitadoras en el cerebro 5-7. Transporte de glutamato es un proceso de electrogénico estequiométricamente acoplado al movimiento de 3 Na + y 1 + H a lo largo de su gradiente electroquímico y para la lucha contra el transporte de K + 8 1. Transporte de glutamato se asocia con (pero no junto estequiométricamente a) la conductancia aniónico permeable a SCN - (tiocianato)&gt; NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, no a CH 3 SO 3 - (metano sulfonato) y C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Ambas corrientes (estequiométricas y no estequiométricas) se pueden grabar mediante la obtención de patch-clamp grabaciones de células enteras a partir de astrocitos, que se identifican visualmente bajo Dodt iluminación o diferencial de infrarrojos contraste de interferencia (IR-DIC) en acute rodajas de cerebro 12. El componente estequiométrica de la corriente asociada con el transporte de glutamato a través de la membrana se puede aislar mediante el uso de CH 3 SO 3 -, o C 6 H 11 O 7 - intracelulares basados ​​en soluciones y puede ser evocada por el glutamato flash uncaging en astrocitos 13,14, o mediante la activación de la liberación de glutamato de las sinapsis vecinas, ya sea eléctricamente 12 o con un control optogenético específica. El curso temporal de la componente de la corriente estequiométrica de transportador está formada por el curso de la vida del perfil de la concentración de glutamato en las membranas astrocíticos (por ejemplo, aclaramiento glutamato), la cinética de los transportadores de glutamato, las propiedades de la membrana pasivos de los astrocitos, y durante estimulaciones sinápticas, por la sincronía de la liberación de glutamato en las sinapsis activadas 13. A continuación se describe con todo detalle: (1) una ca experimentaloach para aislar el componente estequiométrica de corrientes de transportador de glutamato de su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos utilizando rodajas de hipocampo de ratón agudos como una preparación experimental ejemplo; (2) un enfoque analítico para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de estas grabaciones 13, 14. Estos métodos se pueden utilizar para registrar y analizar las corrientes de transportador de glutamato a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sal disódica</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sal disódica</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamato</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Electrodos de matriz opcionales</td></tr><tr><td></td><td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adhesivo instantáneo</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Xe lámpara</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivado de la evolución temporal de la liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de corrientes transporter astrocíticos

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

La mayor densidad de transportadores de glutamato en el cerebro se encuentra en astrocitos. Transportadores de glutamato par el movimiento de glutamato a través de la membrana con el co-transporte de Na + y 3 1 H + y el contador-transporte de K + 1. La corriente estequiométrica generada por el proceso de transporte se puede controlar con su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos. El curso temporal de la corriente registrada está conformado por el transcurso de tiempo del perfil de glutamato concentración a la que están expuestos los astrocitos, la cinética de los transportadores de glutamato, y las propiedades electrotonic pasivos de membranas astrocíticos. Aquí se describen los métodos experimentales y analíticos que se pueden utilizar para registrar las corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y aislar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de todos los otros factores que dan forma a la forma de onda de las corrientes transportador astrocíticos. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para estimar la vida útil of flash uncaged y glutamato liberado sinápticamente en membranas astrocíticos en cualquier región del sistema nervioso central durante la salud y la enfermedad.

El éxito del enfoque analítico descrito aquí depende de manera crítica en la obtención de los registros electrofisiológicos de alta calidad de las corrientes de transportador a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central. En cortes de hipocampo agudos ratón, los astrocitos pueden ser fácilmente identificados bajo Dodt iluminación o IR-DIC debido a su cuerpo de células pequeñas (Ø = 10 micras) y núcleo prominente (Figura 1). Su morfología distintiva en forma de estrella se puede...

Se describe un método analítico para estimar la vida útil de glutamato en las membranas de los astrocitos a partir de grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de transportador de glutamato en astrocitos.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

El objetivo general del experimento es estimar el curso temporal de la eliminación de glutamato desde las membranas astrocíticas tras su liberación a partir de sinapsis excitadoras. El primer paso en este proceso consiste en registrar la activación sináptica del transporte de glutamato procedente de astrocitos en cortes cerebrales agudos, en ausencia y en presencia de una concentración sub-saturante del antagonista de amplio espectro de los transportadores de glutamato, TBOA. El segundo paso consiste en analizar los registros para aislar las corrientes de los transportadores de glutamato activadas sinápticamente del resto de componentes de la respuesta evocada.A continuación, se estima el curso temporal del filtro analizando las corrientes del transportador registradas en presencia de TBOA mediante la desconvolución del filtro a partir de la ocurrencia del transporte registrada en condiciones controladas. Se obtiene el curso temporal de la eliminación de glutamato de las membranas astrocíticas. Los resultados muestran que en el hipocampo de ratón, los astrocitos necesitan solo unos pocos milisegundos para eliminar el glutamato liberado sinápticamente del espacio extracelular.Este enfoque proporciona una herramienta sensible para detectar cambios en la capacidad de captación de astrocitos en diferentes regiones cerebrales durante condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de este enfoque frente a otros métodos basados, por ejemplo, en el análisis de desplazamiento de antagonistas de receptores de glutamato de disociación rápida sobre indicadores fluorescentes de glutamato o en simulaciones computacionales de reacción-difusión, es que ofrece una alta resolución temporal y una lectura experimental directa de la eliminación de glutamato por los astrocitos. Este método nos permite comprender la dinámica espacial y temporal de la transmisión sináptica en el cerebro.Puede ayudarnos a interpretar los cambios fisiopatológicos en el glutamato, la difusión y la captación que pueden ocurrir en ciertos trastornos neurológicos, como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento realizando cinco cortes en un cerebro de ratón diseccionado con un bisturí. Primero, retire los bulbos olfatorios y la corteza frontal.En segundo lugar, retire el cerebelo. A continuación, retire los lóbulos temporales izquierdo y derecho. Luego, separe los dos hemisferios cerebrales mediante un corte sagital medio.A continuación, pegue la superficie lateral de cada sección cerebral a la placa base fría del vibram. El lado dorsal del cerebro debe quedar frente a la hoja del vibram y el lado ventral del cerebro debe estar en contacto con el bloque de agar, alejado de la hoja del vibrato. Luego asegure la placa base del vibrato a la cámara de disección.Establezca el grosor de la sección en 250 micrómetros y ajuste el ancho de la cuchilla antes de cortar. Una vez que la cuchilla haya atravesado la corteza y el hipocampo, utilice un escalpelo para separar la corteza hipocampal del mesencéfalo. Posteriormente, coloque una sección en la cámara de inmersión a 34 grados Celsius tras mantener las secciones a 34 grados Celsius durante 30 minutos.Déjelos enfriar hasta la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de utilizarlos para las grabaciones de electrofisiología en este procedimiento; transfiera una sección al cámara de registro. Inspeccione visualmente la sección bajo la iluminación de puntos o I-R-D-I-C. Los astrocitos pueden identificarse por su pequeño cuerpo celular y núcleo prominente para la estimulación sináptica.Coloque un electrodo bipolar de acero inoxidable a unos 100 micrómetros de distancia del astrocito que planea hacer el parche. Realice el parche del astrocito y logre la configuración de célula íntegra aplicando una succión muy suave. Luego alterne estímulos simples y emparejados cada 10 a 20 segundos para aislar las porciones facilitadas de la ocurrencia del transporte activado sinápticamente.Primero, promedie al menos 20 barridos obtenidos con estimulaciones apareadas en condiciones controladas y en presencia de 10 micromolar del antagonista de amplio espectro de transportadores de glutamato. TBOA; luego, promedie un número idéntico de barridos obtenidos con estimulaciones individuales en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA. Reste el trazado promedio obtenido con estimulaciones individuales del trazado promedio obtenido con estimulaciones apareadas. Este paso permite aislar el STO geométrico y la corriente sostenida de potasio evocada por el segundo estímulo.En el siguiente desplazamiento, reste de la respuesta promedio al segundo estímulo obtenida previamente la traza promedio obtenida con estimulaciones individuales mediante un intervalo de tiempo que coincide con el intervalo PUL utilizado para entregar pulsos apareados, desplazada en el tiempo. Este paso aísla una porción facilitada de la corriente del transportador evocada por el segundo estímulo. En la mayoría de los casos, este paso elimina por completo la corriente sostenida de potasio.Si este es el caso, el aislamiento del FSTC está completo y puede proceder con el análisis de desconvolución y obtener el curso temporal de la eliminación de glutamato por los astrocitos. En algunos casos, sin embargo, aún persiste una pequeña corriente sostenida de potasio y se requiere un análisis adicional. Mida la amplitud de la corriente sostenida de potasio que permanece tras realizarlo.El análisis descrito previamente escala la amplitud de la función monoexponencial a la amplitud de la corriente sostenida residual de potasio ajustando la amplitud de la corriente sostenida de potasio medida como a en esta ecuación. Sin embargo, la constante de tiempo de ascenso representa el valor promedio de la subida estimado en experimentos separados en los que se aísla una corriente sostenida de potasio. Farmacológicamente, utilizando una concentración saturante alta de TBOA, luego se resta la función monoexponencial resultante de la corriente total sostenida de potasio y de la corriente sostenida de potasio.Para completar el aislamiento del FSTC. Para aislar la ocurrencia del transporte activado por destello. Obtenga un promedio de al menos 20 barridos obtenidos con la trayectoria de luz abierta en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA, luego promedie el mismo número de barridos obtenidos con la trayectoria de luz cerrada en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA; reste la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz bloqueada de la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz abierta.Este paso permite eliminar el artefacto del estímulo y aislar las FTC. En este paso, ajuste la corriente de transporte, ya sea FSTC o FTC registrada en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA, utilizando una función multiexponencial. Cree una función que aumente instantáneamente y decaiga monoexponencialmente de acuerdo con esta función, y que describa mejor la fase de decaimiento de la corriente del transportador registrada en 10 micromolar de TBOA. A continuación, descomponga la función monoexponencial del ajuste de la corriente del transportador registrada en 10 micromolar de TBOA para derivar el filtro. Luego, descomponga el filtro del ajuste de la corriente del transportador en condiciones controladas.Para obtener una estimación cuantitativa del curso temporal general de la eliminación de glutamato, calcule el OID de la forma de onda mientras intenta este procedimiento. Es importante confirmar que los eventos de transporte se registren bajo condiciones experimentales en las que el filtro opere en un régimen lineal y produzca únicamente distorsiones lineales del transporte. La forma de onda de la corriente puede verificarse mediante controles que modifiquen el tamaño de la corriente de transporte.No cambie su trayectoria. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar grabaciones astrocíticas para extraer información sobre glutamato, difusión y captación en el cerebro.

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Neurociencia

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Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos (Video) | JoVE Journal

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