Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

El objetivo general del experimento es estimar el curso temporal de la eliminación de glutamato desde las membranas astrocíticas tras su liberación a partir de sinapsis excitadoras. El primer paso en este proceso consiste en registrar la activación sináptica del transporte de glutamato procedente de astrocitos en cortes cerebrales agudos, en ausencia y en presencia de una concentración sub-saturante del antagonista de amplio espectro de los transportadores de glutamato, TBOA. El segundo paso consiste en analizar los registros para aislar las corrientes de los transportadores de glutamato activadas sinápticamente del resto de componentes de la respuesta evocada.

A continuación, se estima el curso temporal del filtro analizando las corrientes del transportador registradas en presencia de TBOA mediante la desconvolución del filtro a partir de la ocurrencia del transporte registrada en condiciones controladas. Se obtiene el curso temporal de la eliminación de glutamato de las membranas astrocíticas. Los resultados muestran que en el hipocampo de ratón, los astrocitos necesitan solo unos pocos milisegundos para eliminar el glutamato liberado sinápticamente del espacio extracelular.

Este enfoque proporciona una herramienta sensible para detectar cambios en la capacidad de captación de astrocitos en diferentes regiones cerebrales durante condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de este enfoque frente a otros métodos basados, por ejemplo, en el análisis de desplazamiento de antagonistas de receptores de glutamato de disociación rápida sobre indicadores fluorescentes de glutamato o en simulaciones computacionales de reacción-difusión, es que ofrece una alta resolución temporal y una lectura experimental directa de la eliminación de glutamato por los astrocitos. Este método nos permite comprender la dinámica espacial y temporal de la transmisión sináptica en el cerebro.

Puede ayudarnos a interpretar los cambios fisiopatológicos en el glutamato, la difusión y la captación que pueden ocurrir en ciertos trastornos neurológicos, como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento realizando cinco cortes en un cerebro de ratón diseccionado con un bisturí. Primero, retire los bulbos olfatorios y la corteza frontal.

En segundo lugar, retire el cerebelo. A continuación, retire los lóbulos temporales izquierdo y derecho. Luego, separe los dos hemisferios cerebrales mediante un corte sagital medio.

A continuación, pegue la superficie lateral de cada sección cerebral a la placa base fría del vibram. El lado dorsal del cerebro debe quedar frente a la hoja del vibram y el lado ventral del cerebro debe estar en contacto con el bloque de agar, alejado de la hoja del vibrato. Luego asegure la placa base del vibrato a la cámara de disección.

Establezca el grosor de la sección en 250 micrómetros y ajuste el ancho de la cuchilla antes de cortar. Una vez que la cuchilla haya atravesado la corteza y el hipocampo, utilice un escalpelo para separar la corteza hipocampal del mesencéfalo. Posteriormente, coloque una sección en la cámara de inmersión a 34 grados Celsius tras mantener las secciones a 34 grados Celsius durante 30 minutos.

Déjelos enfriar hasta la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de utilizarlos para las grabaciones de electrofisiología en este procedimiento; transfiera una sección al cámara de registro. Inspeccione visualmente la sección bajo la iluminación de puntos o I-R-D-I-C. Los astrocitos pueden identificarse por su pequeño cuerpo celular y núcleo prominente para la estimulación sináptica.

Coloque un electrodo bipolar de acero inoxidable a unos 100 micrómetros de distancia del astrocito que planea hacer el parche. Realice el parche del astrocito y logre la configuración de célula íntegra aplicando una succión muy suave. Luego alterne estímulos simples y emparejados cada 10 a 20 segundos para aislar las porciones facilitadas de la ocurrencia del transporte activado sinápticamente.

Primero, promedie al menos 20 barridos obtenidos con estimulaciones apareadas en condiciones controladas y en presencia de 10 micromolar del antagonista de amplio espectro de transportadores de glutamato. TBOA; luego, promedie un número idéntico de barridos obtenidos con estimulaciones individuales en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA. Reste el trazado promedio obtenido con estimulaciones individuales del trazado promedio obtenido con estimulaciones apareadas. Este paso permite aislar el STO geométrico y la corriente sostenida de potasio evocada por el segundo estímulo.

En el siguiente desplazamiento, reste de la respuesta promedio al segundo estímulo obtenida previamente la traza promedio obtenida con estimulaciones individuales mediante un intervalo de tiempo que coincide con el intervalo PUL utilizado para entregar pulsos apareados, desplazada en el tiempo. Este paso aísla una porción facilitada de la corriente del transportador evocada por el segundo estímulo. En la mayoría de los casos, este paso elimina por completo la corriente sostenida de potasio.

Si este es el caso, el aislamiento del FSTC está completo y puede proceder con el análisis de desconvolución y obtener el curso temporal de la eliminación de glutamato por los astrocitos. En algunos casos, sin embargo, aún persiste una pequeña corriente sostenida de potasio y se requiere un análisis adicional. Mida la amplitud de la corriente sostenida de potasio que permanece tras realizarlo.

El análisis descrito previamente escala la amplitud de la función monoexponencial a la amplitud de la corriente sostenida residual de potasio ajustando la amplitud de la corriente sostenida de potasio medida como a en esta ecuación. Sin embargo, la constante de tiempo de ascenso representa el valor promedio de la subida estimado en experimentos separados en los que se aísla una corriente sostenida de potasio. Farmacológicamente, utilizando una concentración saturante alta de TBOA, luego se resta la función monoexponencial resultante de la corriente total sostenida de potasio y de la corriente sostenida de potasio.

Para completar el aislamiento del FSTC. Para aislar la ocurrencia del transporte activado por destello. Obtenga un promedio de al menos 20 barridos obtenidos con la trayectoria de luz abierta en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA, luego promedie el mismo número de barridos obtenidos con la trayectoria de luz cerrada en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA; reste la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz bloqueada de la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz abierta.

Este paso permite eliminar el artefacto del estímulo y aislar las FTC. En este paso, ajuste la corriente de transporte, ya sea FSTC o FTC registrada en condiciones de control y en 10 micromolar de TBOA, utilizando una función multiexponencial. Cree una función que aumente instantáneamente y decaiga monoexponencialmente de acuerdo con esta función, y que describa mejor la fase de decaimiento de la corriente del transportador registrada en 10 micromolar de TBOA. A continuación, descomponga la función monoexponencial del ajuste de la corriente del transportador registrada en 10 micromolar de TBOA para derivar el filtro. Luego, descomponga el filtro del ajuste de la corriente del transportador en condiciones controladas.

Para obtener una estimación cuantitativa del curso temporal general de la eliminación de glutamato, calcule el OID de la forma de onda mientras intenta este procedimiento. Es importante confirmar que los eventos de transporte se registren bajo condiciones experimentales en las que el filtro opere en un régimen lineal y produzca únicamente distorsiones lineales del transporte. La forma de onda de la corriente puede verificarse mediante controles que modifiquen el tamaño de la corriente de transporte.

No cambie su trayectoria. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar grabaciones astrocíticas para extraer información sobre glutamato, difusión y captación en el cerebro.