Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

El objetivo general del experimento es estimar el curso temporal de la eliminación de glutamato de las membranas astrocíticas después de su liberación de las sinapsis excitatorias. El primer paso en este proceso es registrar la ocurrencia de transporte de glutamato activado sinápticamente desde astrocitos en cortes agudos de cerebro en ausencia y presencia de una concentración subsaturante del antagonista transportador de glutamato de amplio espectro, TBOA. El segundo paso es analizar las grabaciones para aislar las corrientes transportadoras de glutamato activadas sinápticamente de todos los demás componentes de la respuesta evocada.

A continuación, se estima el curso del tiempo del filtro analizando las corrientes del transportador registradas en presencia de TBOA mediante la participación del filtro de la ocurrencia de transporte registrada en condiciones controladas. Se obtiene el curso temporal del aclaramiento de glutamato de las membranas astrocíticas. Los resultados muestran que en el hipocampo del ratón, los astrocitos requieren solo unos pocos milisegundos para eliminar el glutamato liberado sinápticamente de la base del espacio extracelular.

Este enfoque proporciona una herramienta sensible para detectar cambios en la capacidad de absorción astrocítica en diferentes regiones del cerebro durante condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de este enfoque sobre otros métodos basados, por ejemplo, en el análisis de desplazamiento de antagonistas de receptores de glutamato que se disocian rápidamente en indicadores fluorescentes de glutamato o en simulaciones informáticas de reacciones de difusión, es que proporciona una lectura experimental directa de alta resolución temporal del aclaramiento de glutamato de los astrocitos. Este método nos permite comprender la dinámica espacial y temporal de la transmisión sináptica en el cerebro.

Puede ayudarnos a interpretar los cambios fisiopatológicos en el glutamato, la difusión y la absorción que pueden ocurrir en ciertos trastornos neurológicos como la enfermedad de Alzheimer. Comience este procedimiento haciendo cinco cortes en un cerebro de ratón disecado con un bisturí. En primer lugar, retira los bulbos olfativos y la corteza frontal.

En segundo lugar, extirpa el cerebelo. A continuación, elimine los lóbulos temporales izquierdo y derecho. A continuación, separa los dos hemisferios cerebrales con un corte sagital medio.

A continuación, pega la superficie lateral de cada sección del cerebro a la placa base de vibram frío. El lado dorsal del cerebro debe estar orientado hacia la cuchilla de Vibram y el lado ventral del cerebro debe estar en contacto con el bloque de agar lejos de la hoja de vibrato. A continuación, fije la placa base del vibrato a la cámara de disección.

Establezca el grosor de la rebanada en 250 micrómetros y ajuste el ancho de la cuchilla antes de cortar. Una vez que la cuchilla haya pasado a través de la corteza y el hipocampo, use un bisturí para cortar el hipocampo de la corteza desde el mesencéfalo. Posteriormente, coloque una rebanada en la cámara de inmersión a 34 grados centígrados después de mantener las rodajas a 34 grados centígrados durante 30 minutos.

Deje que se enfríen a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlos para los registros de electrofisiología en este procedimiento, transfiera una rebanada a la cámara de registro. Inspeccione visualmente el corte bajo la iluminación de puntos o I-R-D-I-C. Los astrocitos se pueden identificar por su cuerpo celular pequeño y su núcleo prominente para la estimulación sináptica.

Coloque un electrodo bipolar de acero inoxidable a unos 100 micrómetros de distancia del astrocito que planea parchear. Parchear el astrocito y romper toda la configuración celular aplicando una succión muy suave. A continuación, alterne estímulos individuales y emparejados cada 10 a 20 segundos para aislar las partes facilitadas de la ocurrencia de transporte activada sinápticamente.

Primer promedio de al menos 20 barridos obtenidos con estimulaciones emparejadas en condiciones controladas, y en presencia de 10 antagonistas transportadores de glutamato de amplio espectro micromolar. A continuación, el TBOA promedia un número idéntico de barridos obtenidos con estimulaciones individuales en condiciones de control y en 10 micromolares el traza media obtenida con estimulaciones individuales del rastro medio obtenido con estimulaciones pareadas. Este paso permite aislar la geometría STO y la corriente de potasio sostenida evocada por el segundo estímulo.

En el siguiente turno, la traza promedio obtenida con estimulaciones individuales por un intervalo de tiempo que coincide con el intervalo PUL utilizado para administrar pulsos emparejados resta la respuesta promedio desplazada en el tiempo obtenida con estimulaciones individuales de la respuesta promedio al segundo estímulo obtenida anteriormente. Este paso aísla una porción facilitada de la corriente transportadora evocada por el segundo estímulo. En la mayoría de los casos, este paso elimina por completo la corriente de potasio sostenida.

Si este es el caso, el aislamiento del FSTC es completo y puede continuar con el análisis de deconvolución y llegar al curso temporal de la eliminación de glutamato de los astrocitos. En algunos casos, sin embargo, todavía hay una pequeña corriente de potasio sostenida y se requiere un análisis más detallado. Mida la amplitud de la corriente de potasio sostenida que queda después de realizar.

El análisis descrito anteriormente escala la amplitud de la función monoexponencial a la amplitud de la corriente de potasio sostenida residual estableciendo la amplitud de la corriente de potasio sostenida medida como a en esta ecuación. Pero la constante de tiempo de aumento representa el valor promedio de aumento estimado en experimentos separados en los que se aísla una corriente de potasio sostenida. Farmacológicamente, utilizando una alta concentración de saturación de TBOA, luego reste la función monoexponencial resultante del FSTC y la corriente de potasio sostenida.

Para completar el aislamiento del FSTC. Para aislar la incidencia de transporte activada por flash. Promedie al menos 20 barridos obtenidos con la trayectoria de luz abierta en condiciones de control y en 10 TBOA micromolares luego promedie el mismo número de barridos obtenidos con la trayectoria de luz cerrada en condiciones de control, y en 10 TBOA micromolares reste la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz bloqueada de la traza promedio obtenida con la trayectoria de luz abierta.

Este paso permite eliminar el artefacto estímulo y aislar los FTCs en este paso ajustar la corriente de transporte ya sea FSTC o FTC registrada en condiciones de control y en 10 micromolares TBOA y ajustarlos con una función multi exponencial, crear una función instantáneamente ascendente que decae mono exponencialmente de acuerdo a esta función y que mejor describe la fase de decaimiento del transportador Corriente registrada a 10 micromolares TBOA. A continuación, devolvamos la función monoexponencial a partir del ajuste de la corriente del transportador registrada en TBOA de 10 micromolares para derivar el filtro. A continuación, devuelva el filtro desde el ajuste de la corriente del transportador en condiciones controladas.

Para obtener una estimación cuantitativa del curso de tiempo general del aclaramiento de glutamato, calcule el OID de la forma de onda mientras intenta este procedimiento. Es importante confirmar que la ocurrencia de transporte se registra en condiciones experimentales en las que el filtro opera en un régimen lineal e introduce solo distorsiones lineales del transporte. La onda de corriente de estos se puede hacer verificando las manipulaciones que cambian el tamaño de la corriente de transporte.

No cambie el curso de su sello. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar las grabaciones astrocíticas para extraer información sobre el glutamato, la difusión y la absorción en el cerebro.