Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Este experimento de microscopía de fluorescencia evalúa la viabilidad de bacterias individuales asociadas con células huésped y determina la viabilidad bacteriana en diferentes ubicaciones subcelulares. En primer lugar, para identificar las bacterias externas, exponga las células infectadas a un reactivo fluorescente que sea específico de la permea bacteriana, el huésped infectado en presencia de tintes fluorescentes que discriminen las bacterias viables de las no viables en función de la integridad de la membrana bacteriana. Luego, para indicar dónde se encuentran las bacterias dentro de las células huésped, incube las células infectadas con un anticuerpo acoplado con fluorescencia a un marcador de interés.

Las imágenes inmunofluorescentes resultantes pueden determinar el porcentaje de bacterias viables dentro y fuera de las células huésped y la localización subcelular de las bacterias intracelulares viables frente a las no viables. A diferencia de los ensayos de recuento de colonias, los ensayos de protección de gentamicina y la microscopía electrónica, este método permite la evaluación directa de la viabilidad de bacterias individuales. También puede revelar si las bacterias en diferentes compartimentos subcelulares tienen diferencias en su viabilidad.

Demostrando este procedimiento estará Brittany Johnson, una estudiante graduada de mi laboratorio, Atory a las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio circulares en 24, las placas de pocillos agregan bacterias de interés e incuban durante el tiempo deseado. Enjuague las células infectadas una vez suavemente. A continuación, añada el anticuerpo acoplado Alexa Fluor 6 4 7, o una lectina específica bacteriana para detectar bacterias externas e incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

Después de dos enjuagues, aspire el medio y agregue 0,5 mililitros de solución de tinción de muertos vivos que contenga cyto nine y yodo propidio. Incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego enjuagar dos veces con trapeadores de cloruro de magnesio. Invierta los deslizamientos de la cubierta boca abajo sobre portaobjetos de vidrio.

Selle con esmalte de uñas transparente. Adquiera las imágenes en 30 minutos utilizando un microscopio fluorescente con conjuntos de filtros detallados en el protocolo de texto para etiquetar las bacterias. Añadir 10 microgramos por mililitro de DPI en medio más definido e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Ahora infecte las células adherentes con bacterias marcadas con DPI. No fije las células con aldehídos o disolventes orgánicos. Enjuague las células una vez.

Luego agregue Alexa Fluor 6, 4, 7 anticuerpo acoplado o lectina e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de dos enjuagues con tampón de fregona, agregue un anticuerpo acoplado Alexa Fluor 5 5, 5 contra el marcador subcelular de interés e incube durante 20 minutos Después de dos, RIN con tampón de mopa, lave las células una vez con cloruro de magnesio de mopas. A continuación, aspire el medio y añada 0,4 micromolares cyt verde incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, reformar las células dos veces en fregonas, cloruro de magnesio.

A continuación, lave las células. Una vez más en las fregonas de cloruro de magnesio durante cinco minutos. Invierta los deslizamientos de la cubierta boca abajo sobre portaobjetos de vidrio, selle con esmalte de uñas transparente, obtenga imágenes de los portaobjetos dentro de los 30 minutos en el microscopio de fluorescencia.

En este experimento, los neutrófilos humanos fueron infectados con gonorrea. La lectina de soja acoplada Alexa Fluor 6 4 7 detecta la gonorrea extracelular. Luego, la viabilidad fluorescente verde muere, y el yoduro de propidio fluorescente rojo se agrega en presencia de saponina, que secuestra el colesterol para permear preferentemente las membranas plasmáticas de la célula huésped, pero no permea la membrana de gonorrea en las células infectadas, el núcleo de la célula eucariota se tiñe con citonueve y yoduro de propidio.

Estas imágenes de neutrófilos infectados con gonorrea se generaron utilizando los colorantes de viabilidad cyt talk screen y dpi. No se utilizó el colorante de yoduro de propidio, ya que emite fluorescencia en los canales rojo y ultravioleta en el microscopio de fluorescencia. Todas las gonorreas se tiñen con dpi, pero solo las bacterias con membranas comprometidas se tiñen con verde buey.

La bacteria intracelular no viable tiene un anillo de tinción para CD 63 que rodea a la bacteria. Este anillo indica que los gránulos primarios están enriquecidos en este fagosoma. La bacteria intracelular viable carece de tinción para CD 63, lo que indica que los gránulos primarios no están enriquecidos en su fagosoma. Tomado.

En conjunto, los datos muestran una correlación entre la viabilidad de la gonorrea y los residentes en un fagosoma gránulo primario negativo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la viabilidad de las bacterias en las células huésped. Además, podrá determinar la viabilidad de las bacterias localizadas en diferentes compartimentos de las células huésped mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra estos compartimentos subcelulares.