Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Este experimento de microscopía de fluorescencia evalúa la viabilidad de bacterias individuales asociadas con células hospedadoras y determina la viabilidad bacteriana en diferentes localizaciones subcelulares. Primero, para identificar bacterias externas, exponga las células infectadas a un reactivo fluorescente específico para la permeasa bacteriana, el hospedador infectado en presencia de colorantes fluorescentes que discriminan bacterias viables de no viables según la integridad de la membrana bacteriana. Luego, para indicar dónde se encuentran las bacterias dentro de las células hospedadoras, incube las células infectadas con un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra un marcador de interés.

Las imágenes de inmunofluorescencia resultantes pueden determinar el porcentaje de bacterias viables dentro y fuera de las células hospedadoras, así como la localización subcelular de las bacterias intracelulares viables frente a las no viables. A diferencia de los ensayos de recuento de colonias, los ensayos de protección con gentamicina y la microscopía electrónica, este método permite la evaluación directa de la viabilidad de bacterias individuales. Asimismo, puede revelar si las bacterias ubicadas en diferentes compartimentos subcelulares presentan diferencias en su viabilidad.

Este procedimiento será demostrado por Brittany Johnson, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Añada bacterias de interés a células cultivadas en cubreobjetos circulares de vidrio en placas de 24 pocillos e incube durante el tiempo deseado. Lave suavemente una vez las células infectadas. Luego añada el anticuerpo marcado con Alexa Fluor 6 4 7, o una lectina específica para bacterias, para detectar las bacterias externas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.

Después de dos lavados, aspire el medio y agregue 0,5 mililitros de solución de tinción de viabilidad que contiene citina nueve y yoduro de propidio. Incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego lave dos veces con cloruro de magnesio MOPS. Invierta los cubreobjetos con la cara hacia abajo sobre portaobjetos de vidrio.

Selle con esmalte de uñas transparente. Adquiera las imágenes dentro de los 30 minutos utilizando un microscopio de fluorescencia con juegos de filtros detallados en el protocolo del texto para etiquetar las bacterias. Añada 10 microgramos por mililitro de DPI en medio definido mors e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Ahora infecte las células adherentes con bacterias marcadas con DPI. No fije las células con aldehídos ni con disolventes orgánicos. Enjuague las células una vez.

Luego, agregue el anticuerpo o lectina marcado con Alexa Fluor 647 e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de dos lavados con tampón mops, agregue un anticuerpo marcado con Alexa Fluor 555 contra el marcador subcelular de interés e incube durante 20 minutos. Tras dos lavados con tampón mops, lave las células una vez con tampón mops de cloruro de magnesio. Luego, aspire el medio y agregue cit verde a 0,4 micromolar; incube las células durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, y lave las células dos veces con tampón mops de cloruro de magnesio.

Luego lave las células una vez más con cloruro de magnesio en MOPS durante cinco minutos. Invierta los cubreobjetos con la cara hacia abajo sobre portaobjetos de vidrio y selle con esmalte transparente; adquiera imágenes de los portaobjetos dentro de los 30 minutos en el microscopio de fluorescencia.

En este experimento, neutrófilos humanos fueron infectados con gonorrea. La lectina de soja marcada con Alexa Fluor 647 detecta la gonorrea extracelular. Luego, se añadió el colorante verde fluorescente de viabilidad y el yoduro de propidio fluorescente rojo en presencia de saponina, que sequestra el colesterol para permeabilizar preferentemente las membranas plasmáticas de la célula huésped, pero no permeabiliza la membrana de la gonorrea en células infectadas; el núcleo de la célula eucariota se tiñe con citronina y con yoduro de propidio.

Estas imágenes de neutrófilos infectados con gonorrea se generaron utilizando los colorantes de viabilidad Cyt Talk Screen y DPI. No se utilizó el colorante yoduro de propidio, ya que fluoresce en los canales rojo y ultravioleta del microscopio de fluorescencia. Todas las gonorreas se tiñen con DPI, pero solo las bacterias con membranas comprometidas se tiñen con Ox Green.

Las bacterias intracelulares no viables presentan un anillo de tinción para CD63 que rodea a la bacteria. Este anillo indica que los gránulos primarios están enriquecidos en este fagosome. La bacteria intracelular viable carece de tinción para CD63, lo que indica que los gránulos primarios no están enriquecidos en su fagosome. Tomado.

En conjunto, los datos muestran una correlación entre la viabilidad de la gonorrea y los residuos en un fagosoma negativo para gránulos primarios. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo evaluar la viabilidad de bacterias dentro de células huésped. Además, podrás determinar la viabilidad de bacterias localizadas en diferentes compartimentos de las células huésped mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra estos compartimentos subcelulares.