Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

El objetivo general de este enfoque basado en la microscopía es observar un proceso central durante el crecimiento de las células bacterianas. Este método nos permite abordar cuestiones importantes en bacteriología, como la forma en que se coordinan los procesos esenciales durante el crecimiento y la división de las células bacterianas. La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizar reactivos fluorescentes para visualizar las superficies y estructuras de las células bacterianas en las células vivas.

Aquí, utilizamos este método para proporcionar información sobre los procesos esenciales en Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, este proceso también podría adoptarse a otras bacterias para estudiar su crecimiento. Para empezar, utilice un palo de madera estéril o una punta de pipeta para inocular tres mililitros de medio de crecimiento ATGN, con una sola colonia de una cepa silvestre o mutante de A. Tumifaciens.

Cultive el cultivo a 28 grados centígrados y 225 RPM durante la noche. Al día siguiente, utilice un espectrofotómetro para medir el OD600. A continuación, diluya el cultivo celular hasta una OD600 de aproximadamente 0,2 y continúe cultivando las células hasta una OD600 de 0,6.

Dispense un mililitro de cultivo exponencial en tres tubos de microfuga. Y peletizar las células en una centrífuga de sobremesa a 7.000 x g durante cinco minutos. Vuelva a suspender cada pellet de celda en un mililitro de PBS y luego agregue un microlitro de solución madre DMSO Orange o solución madre DAPI.

Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar las células resuspendidas en la oscuridad durante cinco minutos. Granular las células por centrifugación a 7.000 x g durante cinco minutos y volver a suspender el pellet en un mililitro de PBS para eliminar el exceso de reactivo. Luego, lave las celdas dos veces más y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de PBS o medio.

Para obtener imágenes simultáneas de lapso de tiempo, combine diez microlitros de células de cada tratamiento en un nuevo tubo de microfuga. Para preparar almohadillas de agarosa para la obtención de imágenes celulares, use un cubreobjetos como guía y corte un cuadrado de 22 por 22 milímetros de película de laboratorio pasando un bisturí alrededor de los bordes. Corta un cuadrado en el centro de la película de laboratorio, dejando un borde de aproximadamente dos a cinco milímetros para que sirva como junta para la almohadilla de agarosa.

Luego, desecha el recorte central. Coloque la junta de película en un portaobjetos de vidrio, limpiado con un limpiador sin amoníaco y alcohol. Y use un bloque de calor ajustado a 70 grados centígrados o una llama para calentar el portaobjetos hasta que la película se derrita ligeramente sobre el vidrio.

A continuación, prepare la solución de agarosa mezclando aproximadamente 0,075 gramos de agarosa y cinco mililitros de medio en un matraz pequeño. Caliente la solución en un microondas con remolinos periódicos para mezclar, hasta que la agarosa se disuelva y la solución esté clara. Mantenga la solución de agarosa a 55-70 grados centígrados y utilícela para la construcción de múltiples almohadillas de agarosa dentro de las 48 horas.

Pipetee el medio de agarosa caliente en el centro de la junta. Luego, coloque un cubreobjetos sobre la junta para distribuir uniformemente la agarosa. Coloque el portaobjetos sobre una superficie fría y nivelada para que se solidifique durante aproximadamente dos minutos.

Ahora, deslice con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa, luego deje que la almohadilla de agarosa se seque al aire durante uno o dos minutos a temperatura ambiente, hasta que la superficie de la almohadilla parezca seca. La construcción adecuada de la almohadilla de agarosa es crucial para adquirir imágenes de alta calidad. No intentes crear imágenes en una almohadilla defectuosa.

Si la almohadilla de agarosa se seca, se ondula o se rasga, es mejor no ser perezoso y, en su lugar, hacer una nueva almohadilla. Luego, con un bisturí, retire una pequeña tira de agarosa para crear una bolsa de aire de aproximadamente dos por siete a diez milímetros. Las células de Tumefacien tienden a crecer mejor cerca de la bolsa de aire.

Localiza de 0,8 a 1 microlitro de células en la almohadilla de agarosa. A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos sobre la parte superior de la almohadilla de agarosa para distribuir las células por la superficie de la almohadilla. Para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, use Valap derretido para sellar los bordes del cubreobjetos.

Asegúrese de sellar a lo largo de todos los bordes y esquinas del cubreobjetos con Valap. Si no lo hace, puede resultar en una deriva durante la toma de imágenes de lapso de tiempo de la almohadilla de agarosa. Para llevar a cabo la microscopía de epifluorescencia, coloque aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el portaobjetos invertido en el portaobjetos de la platina.

Utilice los mandos de enfoque para enfocar las celdas. Adquiera imágenes en fase, o DIC y fluorescencia, utilizando el filtro de fluorescencia deseado para imágenes de fluorescencia. Opcionalmente, adquiera múltiples posiciones x, y seleccionando aleatoriamente diez campos de celdas muy cerca de la bolsa de aire de las almohadillas de agarosa.

Configure la adquisición de la secuencia de tiempo a la imagen en fase, o DIC, en el intervalo de tiempo deseado. Como se muestra aquí, las células se obtuvieron directamente del cultivo después del lavado por centrifugación y después de incubar las células con 0,1 por ciento de DMSO, los resultados mostraron que el DMSO solo no afecta la morfología celular. Tanto el ADN marcado con Orange como con el DAPI dentro de las células vivas de A. Tumefaciens.

En las células predivisionales tardías, se observan dos nucleoloides distintos con tinción de Orange, mientras que el marcaje del ADN parece más difuso con tinción con DAPI. En este experimento de lapso de tiempo con una proporción igual de A. Tumefaciens de tipo salvaje sin marcar, marcados con DAPI y marcados con naranja, todas las células crecieron cuando se obtuvieron imágenes con microscopía de contraste de fase, lo que indica que ninguna de las tinciones perjudicó el crecimiento celular. Las células también crecieron bajo contraste de fase en microscopía de efluorescencia utilizando el filtro TRITC.

Sin embargo, cuando se obtuvieron imágenes con el filtro DAPI, las células dejaron de crecer en una hora. Siguiendo métodos similares, también se pueden utilizar otros reactivos fluorescentes para visualizar la pared celular o las membranas bacterianas. Además, muchos de estos tintes fluorescentes se pueden combinar para proporcionar una imagen completa de la superficie celular bacteriana.

La visualización de procesos esenciales en bacterias vivas es emocionante, porque abre la posibilidad de estudiar estos procesos en mutantes condicionales o bacterias no modelo. Esto nos permite mejorar nuestros estudios de diversas especies bacterianas.