Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar las células TH 17 de los linfocitos T CD cuatro positivos naï�ve. Esto se logra recolectando primero los ganglios linfáticos y el bazo de un ratón C 57 negro seis adulto. En el segundo paso, los tejidos se muelen para obtener una suspensión unicelular.

A continuación, se aíslan y cultivan los linfocitos T CD 25 positivos CD 4 negativos y se cultivan en condiciones de control de inducción o activación de TH 17. En última instancia, Q-P-C-R-E-I-S-A y la citometría de flujo se pueden utilizar para evaluar la expresión de IL 17 A. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la diferenciación de los linfocitos T CD cuatro en células T ocho 17 en ratones C 57 negro seis.

También se puede aplicar a otros modelos de ratón. La demostración de este método es fundamental ya que los ganglios linfáticos son muy pequeños, lo que dificulta los pasos de disección. Sin visualización directa de este método, al menos cuatro horas antes de agregar las células, recubra los pocillos de una nueva placa de cultivo de tejidos de micro prueba UBO de 96 pocillos con 30 microlitros de anti CD tres diluidos en PBS estéril golpee los lados de la placa para garantizar una cobertura uniforme de los pocillos y luego incube la placa a 37 grados centígrados después de cuatro horas, Refrigere el plato hasta que sea el momento de agregar las celdas.

Después de confirmar la muerte por luxación cervical, esterilizar el área de la incisión en un ratón C 57 negro seis adulto con etanol al 70%. A continuación, agarre la piel anterior a la abertura uretral y corte desde la línea media ventral hasta la zona del mentón, teniendo cuidado de no perturbar el peritoneo. A continuación, sujete la piel con alfileres para permitir el acceso a los ganglios linfáticos y al bazo para su extracción.

Ahora retire los ganglios linfáticos axilares que se encuentran cerca de la axila del ratón detrás de los músculos pectorales y coloque el tejido en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de tampón de funcionamiento AutoMax. A continuación, extirpe los ganglios linfáticos braquiales ubicados en el tejido conectivo cerca de cada axila. A continuación, extirpe los ganglios linfáticos cervicales superficiales que se encuentran en el cuello del animal, flanqueando la tráquea, y luego extraiga los ganglios linfáticos inguinales ubicados en la región de la cadera en la conjunción de los tres vasos sanguíneos.

Para acceder a los ganglios linfáticos mesentéricos, primero corte la línea media ventral a través del revestimiento peritoneal. Los ganglios linfáticos mesentéricos se encuentran profundamente dentro del mesenterio del ratón, generalmente en una cadena de cuatro a ocho ganglios que pueden aparecer como un collar de perlas. Extirpar el bazo, tirando y separándolo del páncreas.

Luego colóquelo en la placa de Petri con los ganglios linfáticos para moler los órganos. Coloque los ganglios linfáticos en el lado esmerilado de un portaobjetos de microscopio y luego frote los tejidos con el lado esmerilado de un segundo portaobjetos. Para filtrar los órganos molidos en una suspensión de una sola célula, primero doble una pieza de aproximadamente tres pulgadas por tres pulgadas de material de nailon de 40 micras varias veces y colóquela en la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Use una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 21 para aspirar las células y el tampón y luego dispense la solución celular lentamente en el nailon doblado. Teniendo cuidado de no perforar el material con la aguja. Una vez que se ha logrado una suspensión de una sola célula, la solución debe parecer consistente sin trozos visibles de tejido sólido.

Coloque esta solución sobre hielo. Después de clasificar las celdas por separación AutoMax a una pureza celular negativa de al menos 80%CD, cuatro CD positivos, 25 negativos. Cuente las células por exclusión de azul de triano y luego diluya la suspensión celular a una vez 10 a seis células por mililitro en medios de cultivo celular.

Ahora enjuague todos los pocillos de la placa recubierta anti CD tres con 200 microlitros de PBS. Cada uno desecha el lavado en un contenedor de residuos. A continuación, añada 100 microlitros del cóctel inductor TH 17 o de las mezclas de control de activación a los pocillos correspondientes por triplicado.

Finalmente, agregue 100 microlitros de células a cada pocillo e incube las células durante al menos 72 horas o hasta cinco días para lograr la diferenciación celular TH 17 para Eli SA y QPCR. Después del período de incubación, el pool triplica cada muestra en tubos de einor individuales. Después de centrifugar las células, transfiera el sobrenadante a tubos de einor separados y guárdelo a menos 20 grados Celsius para medir posteriormente la producción de IL 17 A por ELI.

A.To prepararse para la QPCR después de eliminar el sobrenadante, resuspender, los gránulos restantes en 175 microlitros, tampón de lisis de ARN para la extracción inmediata de ARN o almacenar a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para comenzar el procedimiento después del período de incubación. En preparación para la activación celular antes de IL 17, un grupo de tinción intracelular para cada una de las células de control inductoras o activadoras de TH 17 se triplica en pocillos individuales de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Agregue 400 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo.

Para aumentar el volumen total a un mililitro, agregue micina y felden A ion PMA a cada pocillo e incube las células durante cuatro horas a 37 grados Celsius para detectar la presencia de IL 17 A mediante tinción intracelular y citometría de flujo. Primero, transfiera las celdas de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a un tubo de einor separado. A continuación, gira por los tubos.

Retire los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos de celda en 200 microlitros de tampón de fax. Transfiera las células resuspendidas a una placa de citometría de flujo de 96 pocillos y vuelva a centrifugar las células después de lavar los gránulos en 200 microlitros de tampón de fax, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón de fax y agregue 100 microlitros de la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, lejos de la luz.

Después de lavar las células dos veces, incubar los gránulos en 100 microlitros de BD cyto. Fije el tampón cyto perm cubierto con papel de aluminio durante 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora lave las células dos veces en 100 microlitros de un tampón de lavado permanente X BD, y luego incube las células en 50 microlitros de mezcla de anticuerpos intracelulares cubierta con papel de aluminio durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de lavar las células de nuevo, suspenda las células en 200 microlitros de tampón de tinción BD y, a continuación, transfiera las células a tubos de citometría de flujo que contengan 200 microlitros de tampón de tinción. Almacene los tubos a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para ser leídos para el análisis citométrico de flujo de las muestras en la primera puerta de la población de células vivas. A continuación, utilice la población de células vivas para controlar la población CD cuatro positiva CD ocho negativa.

Por último, a partir de la marcha de la población CD 4 positiva CD ocho negativa en la población IL 17 A positiva para diferenciar las células TH 17, las células de ganglios linfáticos y bazo agrupadas no fraccionadas deben enriquecerse para la población de células T CD 25 negativas CD 4 positivas. En esta figura, se muestran células de ganglios linfáticos agrupadas no fraccionadas, citos SP y fracciones de células TT separadas por AutoMax teñidas con anti CD 4 y anti CD 25. Este primer diagrama de dispersión muestra un perfil representativo del porcentaje de linfocitos CD 4 positivos, CD 25 positivos y CD 4 positivos CD 25 negativos presentes en los ganglios linfáticos agrupados no fraccionados y las células del bazo.

El procedimiento de aislamiento también proporciona una población treg positiva para CD 4 CD 25 enriquecida que se puede utilizar en experimentos adicionales. En este diagrama de dispersión final, se muestra el enriquecimiento celular deseado con una población que es 84%CD, cuatro CD positivos y 25 células T negativas. Esta población de linfocitos T CD 25 negativos CD 4 positivos enriquecidos ayuda a garantizar una diferenciación más exitosa de TH 17, como se ilustra en esta figura.

Mientras que la incubación de linfocitos T CD 25 positivos para CD 4 con linfocitos T CD 3 y anti CD 28 durante cinco días produce linfocitos T CD 25 positivos, la incubación en condiciones de inducción de TH 17 produce un subconjunto de IL 17 que produce linfocitos CD 4 positivos para CD 25 positivos. El estado de diferenciación de TH 17 se puede evaluar más a fondo a través de PCR cuantitativa y Elis A: aquí se muestran datos de linfocitos T CD 4 positivos enriquecidos CD-25 negativos, incubados bajo control o condiciones inductoras de TH 17 CD-4 positivo. Los linfocitos T CD 25 negativos incubados en condiciones de TH 17 regulan al alza la IL 17 A, lo que puede determinarse mediante QPCR y ELI SA. El factor de transcripción específico TH 17 ROAR gamma T también está regulado al alza por las células T CD 4 positivas CD 25 negativas incubadas en condiciones inductoras de TH 17, como se puede medir mediante QPCR.

Mientras asiste a este procedimiento, es importante recordar que debe lograr al menos una pureza celular negativa de CD cuatro CD 25 positivos de CD 4 CD 25 antes de incubar las células en condiciones inductoras de TH 17. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar el ganglio linfático y el bazo de ratones C 57 black six, cómo incubar células en condiciones de control de activación o T 817 o cómo evaluar la diferenciación de linfocitos T CD cuatro vírgenes en células T ocho 17 sur.