Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar microcanales endoteliales de sección transversal circular de múltiples profundidades en un chip, que imita la geometría 3D de los microvasos in vivo y funciona bajo un flujo de profusión continuo controlado. Esto se logra fabricando primero fotolitográficamente un molde maestro con una red de microcanales de sección transversal semicircular utilizando fotorresistencia reajustable positiva. El segundo paso es utilizar el molde maestro para replicar dos microcanales de polidimetil soano, alinearlos y unirlos para crear una red de microcanales cilíndricos.

A continuación, las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana se asientan dentro de la red de microcanales antes de cultivar las células en condiciones controladas de perfusión continua del medio durante un período de tiempo de entre cuatro días y dos semanas. En última instancia, se desarrolla una monocapa de células de confluencia indicada por la posición de la membrana y los núcleos situados bajo los microscopios a lo largo de la superficie interna de la red de microcanales Cálculo de microvasos funcionales en la que podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejos. Sin embargo, los ensayos convencionales de microvasos individuales, como los ensayos de migración de células anso y los ensayos de formación de dos células, y los ensayos de anillo derecho y mástico, se limitan a recrear microvasos individuales con respecto a la geometría tridimensional y el control de flujo continuo.

La principal ventaja de nuestras técnicas, nuestro método de microfabricación existente, es que puede fabricar convencionalmente una red de canales microfluídicos de múltiples profundidades que imita las complejas geometrías 3D de microrecipientes in vivo que tienen secciones transversales redondeadas. También permite diseñar sistemas biomagnéticos microvasculares, que aproximadamente obedecen más lentamente y mantienen el flujo de fluido a un nivel requerido para que el canal general resistente sea bajo y el flujo que perdemos sea más uniforme en toda la red, demostrando el procedimiento será un estudiante graduado de mi laboratorio. Este procedimiento comienza con la fabricación de un molde maestro fotorresistente que consta de micro canales con diámetros entre 30 micras y 60 micras como se detalla en el protocolo de texto, transfiera brevemente el fotorresistente de reflujo desde el refrigerador a cuatro grados Celsius a la sala limpia 24 horas antes de su uso y deje que se caliente a temperatura ambiente.

Comience por centrifugar la capa fotorresistente de reflujo positivo sobre un sustrato de silicona prelimpio siguiendo el procedimiento del protocolo de texto. A continuación, exponga la fotorresistencia a la luz ultravioleta a través de una máscara estampada antes de revelar los microcanales estampados. Finalmente, después del reflujo, cree una red de microcanales de sección transversal semicircular.

Una vez que el molde maestro esté listo, prepare la solución de polimetilsoana o PDMS en una proporción de peso de 10 a una base por agente de curado y mezcle bien con un mezclador centrífugo planetario. Coloque la solución PDMS en el molde maestro fotorresistente refluido. Coloque el PDMS fundido en un desecado durante 15 minutos para desgasificar.

Use gas nitrógeno para eliminar las burbujas restantes si es necesario. Hornee el PDMS en un horno a una temperatura de 60 grados centígrados durante tres horas para permitir que se cure. A continuación, retire la capa de PDMS curada del molde maestro.

Utilice un perforador afilado para crear orificios de entrada y salida perforando orificios en la red de canales. Limpie la superficie del PDMS con gas nitrógeno. Trate dos capas de PDMS con plasma de oxígeno durante 30 segundos dentro de un limpiador de plasma a una presión de funcionamiento de 45 milato y un caudal de oxígeno de 3,5 pies cúbicos por minuto.

A continuación, alinee las superficies del PDMS manualmente bajo un microscopio óptico. Utilice una gota de agua si es necesario para un mejor control de la alineación. Finalmente, hornee el dispositivo en un horno a 60 grados centígrados durante 30 minutos para lograr un cultivo de unión permanente.

Células endoteliales primarias de la vena umbilical humana o VE en medio de cultivo con L-glutamina suplementada con suero bovino fetal al 10%. Trate el dispositivo con plasma de oxígeno durante cinco minutos con una presión de funcionamiento de 45 milit y un caudal de oxígeno de 3,5 pies cúbicos por minuto. A continuación, cargue el dispositivo con agua desionizada y trátelo con luz ultravioleta durante ocho horas en una campana laminar de bioseguridad para su esterilización.

Un día antes de que las células estén listas, lave el dispositivo con una solución salina tamponada con fosfato o PBS y luego cúbralo con fibronectina. Incubar en el refrigerador a cuatro grados centígrados durante la noche. Una vez que las células estén confluentes, recójalas enjuagando primero las células con una solución salina tamponada y luego tratando las células con tripsina EDTA después de la adición de tripsina.

Incubar las células durante dos a seis minutos a 37 grados centígrados. Una vez completada la tripsina, neutralice los tripsinas EDTA con una solución neutralizante de tripsinas. Cuente las células, luego centrifugue antes de resus.

Suspensión en medio de cultivo con 8% de dextrina La dextrina se utiliza para aumentar la viscosidad del medio para ayudar a un mejor asentamiento y unión de las células siguiendo el recubrimiento FI enc ENC. Lave el dispositivo con un XPBS y luego cargue el dispositivo con medio de cultivo antes de incubar a una temperatura de 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, se cargan en el dispositivo células en un medio de cultivo de dextrina al 8% a una concentración de tres a 4 millones de células por mililitro.

Coloque una gota de 20 microlitros de células en una entrada del dispositivo e inclínela para introducir las células en el canal microfluídico. Después de 15 a 20 minutos, las células comenzarán a adherirse a las paredes laterales de los canales. Gire el dispositivo cada 15 minutos para crear una distribución más uniforme de las células.

Si es necesario, se puede realizar una carga adicional. Después de cinco a seis horas de cultivo estático, las células adheridas comenzarán a extenderse por completo. Configure la perfusión a largo plazo utilizando un sistema de bomba de jeringa controlado a distancia con un flujo constante de 10 microlitros por hora, la perfusión se puede ajustar para un caudal más alto y puede durar un período de tiempo de entre cuatro días y dos semanas.

Cuando las células alcancen la confluencia dentro del dispositivo, primero, lave el dispositivo con un XPBS para eliminar completamente el medio. A continuación, cargue el dispositivo con colorante rojo diluido después de la incubación del dispositivo en la oscuridad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lávelo con medio de cultivo para detener las manchas.

La incubación prolongada del tinte puede causar toxicidad celular y desadherencia. A continuación, cargue el dispositivo con tinte azul diluido con un XPBS, incube en la oscuridad durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de lavar a fondo el dispositivo con un XPBS. Examine la tinción celular bajo un microscopio óptico invertido.

Si la tinción es buena, cargue los microcanales con medio de fijación, luego sumerja el dispositivo en el medio de fijación y cúbralo completamente con papel de aluminio. Guarde el dispositivo en el refrigerador a una temperatura de cuatro grados centígrados para evitar que el dispositivo se seque y blanquee, el dispositivo fijo ahora está listo para la obtención de imágenes confocal, que se pueden realizar con un microscopio confocal de barrido láser, microscopía electrónica de barrido y microscopía óptica. Se utilizaron para caracterizar la fotorresistencia al reflujo y el canal PDMS replicado antes y después del progreso del reflujo.

Aquí se caracterizaron y mostraron las características geométricas de la red de microcanales PDMS. Las secciones transversales circulares de los moldes PDMS muestran las dimensiones del canal en cada nivel de ramificación. Los resultados muestran que la técnica de reflujo fotorresistente puede crear redes de canales ramificados de profundidad múltiple en un enfoque más conveniente mediante técnicas de reflujo fotorresistente y permitir el diseño de los sistemas biomiméticos microvasculares, que aproximadamente obedecen a la ley de Murray, donde se muestran imágenes de microscopía utilizando tinte de membrana celular fluorescente en rojo y colorante nuclear celular en azul.

Las vistas transversales circulares revelaron que el VE revestía la superficie interna de una red de microcanales cilíndricos en diferentes regiones de ramificación. Debido a las complejas geometrías de la microvasculatura in vivo, el seguimiento en tiempo real de estos pequeños vasos es difícil. El chip desarrollado basado en P DM S ofrece buenas propiedades ópticas y permite obtener imágenes de alta calidad y en tiempo real de los microcanales endoteliales, como se muestra en esta película confocal del revestimiento celular a lo largo de la red de canales circulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar el reflujo para este modo de masa. Cree una red de microcanales PDMS de sección transversal circular, cargue las células endo en los dispositivos y configure la profusión de medios a largo plazo. En resumen, los microcanales endoserializados desarrollados en un chip proporcionan un enfoque rápido y reproducible para crear redes de microcanales de múltiples profundidades de sección transversal circular, que imita la geometría de los microrecipientes InVivo.

Este procedimiento ilustra el uso de capacidades únicas en microfabricación avanzada y tecnologías microalimentarias para crear un modelo microvascular con un control de perfusión continuo a largo plazo, así como alta calidad y capacidad de imágenes en tiempo real con la creciente utilidad de los canales microalimentarios para aplicaciones de biología celular, ingeniería de tejidos y bioingeniería. Los micro canales endo serializados en un chip son un ensayo potencial para la investigación microvascular.