Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar en un chip microcanales endoteliales vivos con sección transversal circular y múltiples profundidades, que imiten la geometría tridimensional de microvasos in vivo, y que funcionen bajo flujo de perfusión continuo controlado. Esto se logra primero mediante la fabricación litográfica por luz de un molde maestro con una red de microcanales de sección transversal semicircular, utilizando una resina fotosensible positiva refluible. El segundo paso consiste en utilizar el molde maestro para replicar dos microcanales de poli(dimetilsiloxano), alinearlos y unirlos para crear una red de microcanales cilíndricos.

A continuación, las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana se siembran dentro de la red de microcanales antes de cultivar las células bajo condiciones controladas de perfusión continua de medio durante un período comprendido entre cuatro días y dos semanas. Finalmente, se desarrolla una monocapa celular confluyente, indicada por la formación de membranas y núcleos visibles bajo el microscopio, a lo largo de la superficie interna de la red de microcanales. Este sistema permite el cálculo de microvasos funcionales y podría proporcionar una plataforma para el estudio de fenómenos vasculares complejos. Sin embargo, los ensayos convencionales de microvasos individuales, como los ensayos de migración celular anso, los ensayos de formación de So2 y los ensayos de anillo endotelial, tienen limitaciones para recrear microvasos individuales en cuanto a geometría tridimensional y control de flujo continuo.

La principal ventaja de nuestras técnicas, nuestro método existente de microfabricación, es que puede fabricar convencionalmente una red de canales microfluídicos de múltiples profundidades que imita las complejas geometrías tridimensionales de microvasos in vivo que presentan secciones transversales redondeadas. También permite diseñar sistemas biomagnéticos microvasculares, que aproximadamente obedecen un flujo más lento y mantienen el flujo de fluido a un nivel requerido, de modo que la resistencia total del canal sea baja y la pérdida de flujo sea más uniforme a través de toda la red. La persona que demuestra el procedimiento será un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Este procedimiento comienza con la fabricación de un molde maestro de fotoresistente que consiste en microcanales con diámetros entre 30 micrones y 60 micrones, como se detalla en el protocolo del texto. Breve transferencia del fotoresistente de reflujo del refrigerador a cuatro grados Celsius al cuarto limpio 24 horas antes de su uso, y permita que se caliente a temperatura ambiente.

Comience aplicando por centrifugado la capa de resistencia fotográfica positiva de reflujo sobre un sustrato de silicio previamente limpio, siguiendo el procedimiento descrito en el protocolo del texto. Luego, exponga la resistencia fotográfica a luz UV a través de una máscara con patrón antes de revelar los microcanales estructurados. Finalmente, tras el reflujo, cree una red de microcanales con sección transversal semicircular.

Una vez que el molde maestro esté listo, prepare una solución de polimetil siloxano o PDMS en una proporción en peso de 10 a 1 de base respecto al agente de curado y mézclela completamente utilizando un mezclador centrífugo planetario. Vierta la solución de PDMS sobre el molde maestro de resistencia fotográfica refluída. Coloque el PDMS vertido en un desecador durante 15 minutos para desgasificarlo.

Utilice gas nitrógeno para eliminar cualquier burbuja restante si es necesario. Hornee el PDMS en un horno a una temperatura de 60 grados Celsius durante tres horas para permitir que se cure. Luego, retire la capa de PDMS curada del molde maestro.

Utilice un punzón afilado para crear orificios de entrada y salida perforando agujeros en la red de canales. Limpie la superficie del PDMS utilizando gas de nitrógeno. Trate dos capas de PDMS con plasma de oxígeno durante 30 segundos dentro de un limpiador de plasma a una presión de operación de 45 milatorr y una velocidad de flujo de oxígeno de 3,5 pies cúbicos por minuto.

Luego, alinee manualmente las superficies del PDMS bajo un microscopio óptico. Utilice una gota de agua si es necesario para un mejor control del alineamiento. Finalmente, caliente el dispositivo en un horno a 60 grados Celsius durante 30 minutos para lograr un enlace permanente.

Células endoteliales primarias de vena umbilical humana o VE en medio de cultivo con L-glutamina suplementado con 10% de suero bovino fetal. Trate el dispositivo con plasma de oxígeno durante cinco minutos con una presión de operación de 45 militorr y un caudal de oxígeno de 3,5 pies cúbicos por minuto. A continuación, cargue el dispositivo con agua desionizada y trátelo con luz ultravioleta durante ocho horas en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar para esterilización.

Un día antes de que las células estén listas, lave el dispositivo con solución salina tamponada con fosfato o PBS y luego recubra con fibronectina. Incube en el refrigerador a cuatro grados Celsius durante la noche. Una vez que las células estén confluentes, recójalas primero enjuagando las células con solución salina tamponada con HEPES, y luego trate las células con tripsina EDTA tras la adición de tripsina.

Incube las células durante dos a seis minutos a 37 grados Celsius. Una vez que la tripsinización esté completa, neutralice la tripsina-EDTA con la solución neutralizante de tripsina. Cuente las células y luego céntrifugelas antes de la resuspensión.

Se suspende en medio de cultivo con 8 % de dextrina, ya que la dextrina se utiliza para aumentar la viscosidad del medio y facilitar una mejor adhesión y asentamiento celular tras el recubrimiento con FI enc ENC. Lave el dispositivo con un XPBS y luego cargue el dispositivo con medio de cultivo antes de incubar a una temperatura de 37 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, se cargan células en medio de cultivo con 8 % de dextrina a una concentración de tres a cuatro millones de células por mililitro en el dispositivo.

Coloque una gota de 20 microlitros de células en una entrada del dispositivo e inclínelo para introducir las células en el canal microfluídico. Después de 15 a 20 minutos, las células comenzarán a adherirse a las paredes laterales de los canales. Gire el dispositivo cada 15 minutos para crear una distribución más uniforme de células.

Si es necesario, se puede realizar una carga adicional. Después de cinco a seis horas de cultivo estático, las células adheridas comenzarán a extenderse completamente. Configure la perfusión a largo plazo utilizando un sistema de bomba de jeringa controlado a distancia con un flujo constante de 10 microlitros por hora; la perfusión puede ajustarse a un flujo más alto y puede durar entre cuatro días y dos semanas.

Cuando las células alcancen confluencia dentro del dispositivo, primero lave el dispositivo con un XPBS para eliminar completamente el medio. A continuación, cargue el dispositivo con colorante rojo diluido tras la incubación del dispositivo a oscuras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lávelo con medio de cultivo para detener la tinción.

La incubación prolongada del colorante puede causar toxicidad celular y desadhesión. A continuación, cargue el dispositivo con colorante azul diluido en un XPBS e incube en la oscuridad durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de lavar minuciosamente el dispositivo con un XPBS. Examine la tinción celular bajo un microscopio óptico invertido.

Si la tinción es buena, cargue los microcanales con medio de fijación, luego sumerja el dispositivo en medio de fijación y cúbralo completamente con papel de aluminio. Almacene el dispositivo en el refrigerador a una temperatura de cuatro grados Celsius para evitar que se seque. El dispositivo fijado ya está listo para la imagen confocal, que puede realizarse mediante un microscopio confocal de barrido láser, microscopía electrónica de barrido y microscopía óptica. Se utilizaron para caracterizar la refluencia del fotolitógrafo y el canal de PDMS replicado antes y después del progreso de la refluencia.

Se caracterizaron y muestran aquí las características geométricas de la red de microcanales de PDMS. Las secciones transversales circulares de los moldes de PDMS muestran las dimensiones del canal en cada nivel de bifurcación. Los resultados indican que la técnica de reflujo de la resistencia fotosensible puede crear redes de canales con múltiples profundidades de manera más conveniente mediante técnicas de reflujo de resistencia fotosensible, y permiten el diseño de sistemas biomiméticos microvasculares, que obedecen aproximadamente la ley de Murray. Aquí se muestran imágenes de microscopía utilizando un tinte fluorescente de membrana celular en rojo y un tinte nuclear en azul.

Las vistas transversales circulares revelaron que el VE revestía la superficie interna de una red de microcanales cilíndricos en diferentes regiones de ramificación. Debido a las geometrías complejas de la microvasculatura in vivo, el monitoreo en tiempo real de estos vasos pequeños es difícil. El chip desarrollado basado en PDMS ofrece buenas propiedades ópticas y permite imágenes de alta calidad y en tiempo real de los microcanales endoteliales, como se muestra en esta película confocal del revestimiento celular a lo largo de la red de canales circulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar el reflujo para este modo masivo. Cree una red de microcanales de PDMS con sección transversal circular, cargue las células endoteliales en los dispositivos y establezca una perfusión prolongada de medio. En resumen, los microcanales endoteliales en serie desarrollados sobre un chip proporcionan un enfoque rápido y reproducible para crear redes de microcanales con sección transversal circular y múltiples profundidades, que imitan la geometría de los microvasos en vivo.

Este procedimiento ilustra el uso de capacidades únicas en microfabricación avanzada y tecnologías microfluídicas para crear un modelo microvascular con control de perfusión continua a largo plazo, así como con alta calidad y capacidad de imagen en tiempo real, con una utilidad creciente de los canales microfluídicos en aplicaciones de biología celular, ingeniería de tejidos e ingeniería biomédica. Los canales microfluídicos serializados en un chip representan un ensayo potencial para la investigación microvascular.