Name: Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a identificar inhibidores de la cadena ligera de neurotoxina botulínica tipo A mediante un ensayo FRET de alto rendimiento. Este método permite evaluar la potencia relativa de compuestos y acelerar el descubrimiento de fármacos.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (AI082190 a T.J.D.) y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (TB1-01186 y CL1-00502).

Cribado manual o Determinación IC50
Este protocolo se puede utilizar para determinar la potencia relativa de un compuesto (valor IC50) mediante la preparación de una serie de diluciones del compuesto, o para detectar manualmente inhibidores de moléculas pequeñas a una sola concentración.
1. Preparación de tampones, reactivos e instrumentación requerida
<ol>
	<li>Preparar 50 ml de tampón de ensayo (40 mM HEPES, pH 7,4 y 0,01% Tween-20) y filtrar la esterilización. El tampón puede almacenarse a temperatura ambiente (RT) durante varios meses.</li>
	<li>Prepare una dilución de trabajo de 70 nM de cadena ligera recombinante de neurotoxina botulínica/A (LC/A (1-425))17 en tampón de ensayo, suavemente en vórtice y almacene en hielo. Las pruebas de cada compuesto requieren al menos 120 μl de dilución de trabajo LC/A.</li>
	<li>Prepare una dilución de trabajo de sustrato BoNT/A LC a base de FRET de 7 μM en un tampón de ensayo que contenga un 10% de DMSO. Inicialmente, diluya una solución madre de 5 mM del sustrato en un volumen adecuado de 100% de DMSO, luego agregue lentamente (gota a gota) el tampón de ensayo mientras mezcla suavemente. Envuelva en papel de aluminio y almacene en hielo. Las pruebas de cada compuesto requieren al menos 130 μl de dilución de trabajo del sustrato.</li>
	<li>Configure un lector de placas de microtitulación de fluorescencia para agitar la placa a velocidad media durante 10 segundos, luego monitoree la fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 490 nm y 523 nm, respectivamente, cada 5 minutos (modo cinético) durante 90 minutos a RT. Tenga en cuenta que la formación del producto (es decir, el aumento de la fluorescencia) es lineal a lo largo de este período de tiempo (Figura 1A).</li>
</ol>
2. Preparación de series de dilución de compuestos
<ol>
	<li>Determine el rango de concentración del compuesto (es decir, el número de diluciones en la serie de dilución y el factor de dilución); el rango de concentración se elige en función del valor esperado de IC50 para garantizar un ajuste óptimo de la curva. En el caso de los compuestos con un IC50 desconocido, utilice un compuesto sin diluir como la concentración más alta de compuesto.</li>
	<li>Etiquete los tubos con el nombre y la concentración de compuesto apropiados.</li>
	<li>Alícuota 100% DMSO a todos los tubos para prepararlos para la dilución en serie de compuestos. Se recomienda un volumen de dilución final mínimo de 2 μl, donde se utiliza 1 μl de cada concentración por pocillo en la placa de ensayo. Por ejemplo, una serie de dilución estándar 1:3 requiere mezclar 2 μl de compuesto con 4 μl de DMSO por tubo.</li>
	<li>Prepare diluciones en serie de compuestos y vórtices o mezcle manualmente entre cada dilución; cambie las puntas de las pipetas entre cada dilución. Para la serie de dilución estándar 1:3, agregue 2 μl del compuesto sin diluir a 4 μl de DMSO en el primer tubo de la serie de dilución y mezcle bien. Con una nueva punta de pipeta, retire 2 μl de la primera dilución y agregue 4 μl de DMSO en el segundo tubo; mezclar bien. Repita para las diluciones restantes. Asegúrese de mezclar bien las diluciones de compuestos para asegurarse de que las concentraciones de compuestos sean precisas.</li>
	<li>Cubra los tubos compuestos y reserve en RT.</li>
</ol>
3. Preparación de placas y manchado (Tabla 1)
<ol>
	<li>Obtenga una placa negra de 96 pocillos de fondo plano, opaca. Consulte la configuración de placa recomendada en la Tabla 1, donde cada serie de dilución compuesta tiene el formato de filas de una placa de 96 pocillos. Dispensar manualmente 1 μl de la dilución compuesta respectiva directamente en el fondo de cada pocillo correspondiente (pocillos 1-9). Dispensar 1 μl de la concentración más alta del compuesto que se va a analizar hasta el pocillo 11 (control de fluorescencia intrínseca del compuesto).</li>
	<li>Dispense manualmente 1 μl de un inhibidor potente conocido al pocillo 12 (control positivo) y 1 μl de DMSO al 100% al pocillo 10 (control negativo).</li>
	<li>Con una pipeta automática, dispense 79 μl de tampón de ensayo al lado de los pocillos 1-10 y 12 (diluciones compuestas y control positivo) y 89 μl al lado del pocillo 11 (control de fluorescencia intrínseca compuesto). Asegúrese de no tocar la punta con el fondo del pozo donde hay compuesto para no contaminar los pocillos. </li>
	<li>Agite la dilución de trabajo de LC/A y use una pipeta automatizada para agregar 10 μl al costado de cada pocillo, excepto para el pocillo 11 (control de fluorescencia intrínseca compuesta). Golpee suavemente la placa para asegurarse de que toda la enzima agregada vaya al fondo del pocillo.</li>
	<li>Mezcle, cubra e incube suavemente la placa durante 5 minutos a RT. Esta incubación proporciona un paso de preequilibrio para que los compuestos se unan al LC/A antes de la adición del sustrato.</li>
</ol>
4. Adición de sustrato y medición de fluorescencia
<ol>
	<li>Agite suavemente el sustrato BoNT/A LC y, con una pipeta automática, agregue 10 μl de sustrato al otro lado de cada pocillo. Asegúrese de agregar el sustrato al lado del pocillo opuesto a donde se agregó la enzima anteriormente.</li>
	<li>Golpee suavemente la placa para mezclar los reactivos, colóquela inmediatamente en el lector de placas y comience la medición de fluorescencia con los ajustes especificados anteriormente en el paso 1.4.</li>
	<li>Las velocidades de la enzima se calculan a partir de la pendiente de la línea generada mediante el gráfico de la unidad de fluorescencia relativa (RFU) frente al tiempo durante el período lineal de la reacción.</li>
</ol>
Tabla 1.Disposición sugerida de la placa de ensayo.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Pozo #</th>
			<th>Descripción del pozo</th>
			<th>compuesto</th>
			<th>Tampón de ensayo</th>
			<th>sustrato</th>
			<th>Lc</th>
			<th>Dmso</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dosis compuesta 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número arábigo</td>
			<td>Dosis compuesta 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dosis compuesta 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dosis compuesta 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Dosis compuesta 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Dosis compuesta 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Dosis compuesta 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Dosis compuesta 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Dosis compuesta 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Control negativo 
			(Actividad 100% LC)</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Control de fluorescencia intrínseca compuesta</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Control positivo 
			(0% de actividad LC)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Operación automatizada para el cribado de alto rendimiento
5. Preparación de tampones, reactivos, placas compuestas, códigos de barras e instrumentación requerida
<ol>
	<li>Descongele las placas de compuesto selladas a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.</li>
	<li>Prepare 500 ml (o más, dependiendo del número de compuestos a analizar) del tampón de ensayo (40 mM HEPES, pH 7,4 y 0,01% Tween-20) y filtre la esterilización. El tampón de ensayo filtrado puede almacenarse en RT durante varios meses.</li>
	<li>Prepare una dilución de trabajo de 8,75 nM de BoNT/A LC (1-425) recombinante en tampón de ensayo, vórtice y almacene en hielo. Cada pocillo en una placa de 384 pocillos de bajo volumen requiere 8 μl. Prepare un exceso del 10-15%, o aproximadamente 3,7 ml o cada placa de 384 pocillos de bajo volumen.</li>
	<li>Prepare una dilución de trabajo de sustrato BoNT/A LC a base de FRET de 3,5 μM en tampón de ensayo que contenga un 10% de DMSO. Inicialmente, diluya la solución madre de 5 mM del sustrato directamente en el volumen adecuado de 100% de DMSO, luego agregue lentamente (gota a gota) el tampón de ensayo mientras mezcla suavemente. Envuelva en papel de aluminio y almacene en hielo. Cada pocillo en una placa de 384 pocillos de bajo volumen requiere 2 μl. Prepare un exceso del 10-15%, o aproximadamente 1 ml por cada placa de 384 pocillos de bajo volumen.</li>
	<li>Prepare códigos de barras para cada placa de microtitulación negra, de 384 pocillos y bajo volumen [placa de ensayo] y adhiera la etiqueta directamente al lado de la placa donde el escáner de código de barras pueda leerla; asegúrese de que la etiqueta no se extienda sobre el lado de la placa, ya que podría interferir con la manipulación y el apilamiento de la placa. Apila los platos en orden numérico y déjalos a un lado. Cubra la placa superior. Tenga en cuenta que este paso es opcional, pero facilita el seguimiento de los resultados a los compuestos correspondientes cuando se utilizan varias placas.</li>
	<li>Centrifugar las placas de compuesto original descongeladas y selladas a 200 x g durante 30 segundos en RT. Retire con cuidado el sello de la placa, asegúrese de eliminar cualquier adhesivo restante y cubra la placa con una tapa de plástico limpia para evitar la evaporación. Tenga en cuenta que si hay algún adhesivo en la superficie de la placa, puede interferir con la transferencia automática de la tapa y el apilamiento de la placa. Coloque la placa cubierta en un hotel conectado al manipulador de líquidos. No mantenga las placas descubiertas o se producirá evaporación.</li>
	<li>Configure un lector de placas de microtitulación de fluorescencia apiladas para leer la fluorescencia de cada placa de ensayo a longitudes de onda de excitación y emisión de 490 nm y 523 nm, respectivamente, cada 30 min (modo cinético) durante 3-6 ciclos en RT.</li>
</ol>
6. Preparación de la herramienta de alfileres
<ol>
	<li>Inspeccione visualmente la herramienta de pasador de 384 cabezales en busca de anomalías, incluidas deformaciones, astillas o residuos grandes.</li>
	<li>Llene tres bandejas separadas con aproximadamente 1 pulgada de metanol al 100 % (grado de HPLC), isopropanol al 100 % (grado de HPLC) y solución de limpieza de herramientas de alfiler diluida en agua ultrapura.</li>
	<li>Llene la estación de limpieza en un manipulador de líquidos con 100% DMSO.</li>
	<li>Apila 2 o 3 pedazos de papel secante nuevo y limpio en una bandeja. Es importante calibrar el robot en el eje z para que los pines entren en contacto con el papel secante, pero no lo perforen.</li>
	<li>Asegure un accesorio de ventilador al área de trabajo para secar los alfileres después del lavado.</li>
	<li>Conecte la herramienta de alfileres al brazo robótico del manipulador de líquidos y limpie previamente los alfileres sumergiéndolos en DMSO, secándolos en papel secante, remojándolos durante 2 minutos en solución de limpieza, secándolos en papel secante, sumergiéndolos en isopropanol, secándolos en papel secante, sumergiéndolos en metanol, secándolos en papel secante y, finalmente, secándolos sobre el ventilador.</li>
</ol>
7. Preparación de dispensador de líquido de bajo volumen
<ol>
	<li>Conecte un casete de bajo volumen (1-10 μl) al dispensador de líquido y conecte una línea de desagüe a un recipiente apropiado.</li>
	<li>Inspeccione visualmente las boquillas dispensadoras del casete y compruebe que no estén deformadas, rotas o bloqueadas. Es importante mantener limpios los canales y las boquillas, ya que la precipitación o los residuos influirán en la distribución del líquido.</li>
	<li>Prepare los canales haciendo correr 30 ml de agua ultrapura, 30 ml de etanol al 70% y luego 30 ml de agua ultrapura nuevamente directamente en el recipiente de desechos.</li>
	<li>Coloque una placa de ensayo de 384 pocillos de bajo volumen en el dispensador de líquido y agregue un volumen conocido de agua a cada pocillo. Inspeccione visualmente para asegurarse de que cada pozo reciba el volumen correcto y que no haya derrames ni solución dispensada entre los pocillos.</li>
	<li>Prepare los tubos con aire durante aproximadamente 5 segundos para eliminar el agua y secar los canales.</li>
</ol>
8. Dispensación de la cadena ligera BoNT/A en la placa de ensayo
<ol>
	<li>Sumerja la línea de entrada del dispensador de líquido en la solución de trabajo BoNT/A LC, CEBE para eliminar el aire y dispense 8 μl en cada pocillo de una placa de ensayo de 384 pocillos de bajo volumen. Tenga en cuenta que las placas se pueden colocar manualmente en el área de trabajo del manipulador de líquidos, o se pueden colocar y volver a apilar automáticamente mediante un hotel de placas adjunto.</li>
	<li>Cubra cada placa con una tapa de plástico limpia y apílela en una columna diferente del hotel de placas adjunta al manipulador de líquidos. No mantenga las placas sin sellar o se evaporará.</li>
	<li>Limpie el dispensador de líquido haciendo correr 30 ml de agua ultrapura, 30 ml de etanol al 70%, 30 ml de agua ultrapura directamente en el recipiente de desechos.</li>
	<li>Prepare los tubos con aire durante aproximadamente 5 segundos para secar los canales.</li>
</ol>
9. Estampación de compuestos en la placa de ensayo
<ol>
	<li>Asigne áreas en la plataforma del manipulador de líquidos para las placas compuestas, las placas de ensayo y los recipientes con soluciones de limpieza.</li>
	<li>Programe el manipulador de líquidos para colocar las placas compuestas y las placas de ensayo en las posiciones designadas y retire las tapas de las placas antes de estampar.</li>
	<li>Estampar 50 nl del compuesto directamente en la placa de ensayo que contiene 8 μl de BoNT/A LC. Al calibrar el programa de estampado, asegúrese de que los pines estén sumergidos, pero no raye la parte inferior de la placa de ensayo. Tenga en cuenta que la adición de compuestos en DMSO al 100% puede crear una zona local de desnaturalización de la enzima a medida que se dispersa. Por lo tanto, se debe tener cuidado de evaluar el nivel de desnaturalización de la enzima comparando el control solo de DMSO con el control no tratado (es decir, la enzima sin la adición de DMSO).</li>
	<li>Limpie los alfileres después de cada plato sumergiéndolos en DMSO, secándolos en papel secante, sumergiéndolos en isopropanol, secándolos en papel secante, sumergiéndolos en metanol, secándolos en papel secante y, finalmente, secándolos con el ventilador.</li>
	<li>Después de que los compuestos se hayan estampado en la placa de ensayo con la enzima, apile por separado las placas de compuesto base y las placas de ensayo. Cubra la placa de ensayo superior de la pila para evitar la evaporación y reserve. Asegúrese de incubar LC con compuestos durante al menos 5 min en RT; Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos cuando se estampa un gran número de placas.</li>
</ol>
10. Dosificación de sustrato en la placa de ensayo
<ol>
	<li>Sumerja la línea de entrada del manipulador de líquidos en la solución de trabajo del sustrato BoNT/A LC y protéjala de la luz. Revise las boquillas dispensadoras para asegurarse de que estén secas y no bloqueadas. Cebre los canales para eliminar todas las burbujas de aire.</li>
	<li>Desapilar las placas de ensayo y dispensar 2 μl de dilución de trabajo del sustrato en cada pocillo. Compruebe que el sustrato se dispensa directamente en cada pocillo. Apile las placas y coloque una placa de ensayo vacía encima de la primera placa y una placa vacía debajo de la placa inferior de la pila para evitar la evaporación durante la lectura y el reapilado en el lector de placas.</li>
</ol>
11. Mediciones de fluorescencia
<ol>
	<li>Cargue inmediatamente la pila de placas de ensayo en un lector de placas de fluorescencia.</li>
	<li>Comience la medición de fluorescencia con los ajustes especificados anteriormente en el paso 5.7. La velocidad de ensayo para cada compuesto se calcula a partir de un gráfico de la unidad de fluorescencia relativa (RFU) a lo largo del tiempo. Tenga en cuenta que es importante incluir un control negativo (DMSO) para obtener una tasa desinhibida; También se puede agregar un control positivo con un inhibidor conocido a cada placa. En la Figura 2 se muestra una salida representativa de un solo punto de tiempo.</li>
</ol>
12. Limpiando
<ol>
	<li>Selle cada placa de material compuesto con un sello de aluminio con un rodillo y almacene a -80 °C.</li>
	<li>Después de leer cada placa de ensayo, deseche las placas, cualquier LC/A restante o diluciones de sustrato en los desechos de riesgo biológico.</li>
</ol>

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<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de LC BoNT/A basado en FRET descrito aquí representa un método atractivo para identificar y caracterizar moléculas pequeñas que modulan la actividad de la LC BoNT/A. La naturaleza basada en soluciones del ensayo hace que este protocolo sea susceptible de detección de alto rendimiento descrita en la sección Operación automatizada del texto del protocolo. El factor Z se utiliza a menudo para determinar la idoneidad de un ensayo para campañas HTS18. Determinado como Z = 1 – 3 (σp + σn</s...

La neurotoxina botulínica A (BoNT/A), la toxina más potente conocida actualmente (LD50 ~1 ng/kg)1, es una potente neurotoxina producida por la bacteria Clostridium botulinum. Dentro de un huésped afectado, la BoNT/A interrumpe la neurotransmisión en la unión neuromuscular al unirse a las neuronas motoras, internalizarse en el citosol y, en última instancia, escindir las proteínas neuronales que son esenciales para la exocitosis de acetilcolina. Una vez dentro de una neurona, la NTBo/A puede persistir hasta varios meses2. La inhibición a largo plazo de la liberación de acetilcolina dificulta la contracción muscular normal y provoca parálisis flácida, que, en casos graves, puede provocar insuficiencia cardíaca y/o respiratoria. Debido a su extrema potencia, facilidad de producción y efectos a largo plazo dentro del huésped, los CDC han etiquetado a todos los serotipos de BoNT como agentes de bioterrorismo de alto riesgo.
El mecanismo de acción de la toxina implica numerosos pasos, incluyendo la unión a los receptores de la superficie neuronal, la absorción celular a través de la endocitosis mediada por receptores y la translocación al citosol de la neurona. La NTBo/A se compone de dos cadenas, una pesada y otra ligera, y ambas cadenas son necesarias para la toxicidad. La cadena pesada (HC) contiene dominios de unión y translocación, mientras que la cadena ligera (LC) es una metaloproteasa dependiente de zinc que se transloca desde el endosoma hasta el citoplasma. Una vez dentro del citosol, la metaloproteasa LC/A se localiza en la membrana citoplasmática interna y escinde la proteína huésped SNAP-25 unida a la membrana. SNAP-25 es un miembro de la familia de proteínas SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), que desempeña un papel crucial en la exocitosis de acetilcolina (revisado en la referencia3). La escisión LC/A de SNAP-25 afecta la función del complejo SNARE, que inhibe la liberación de neurotransmisores acetilcolina y perjudica la contracción muscular.
Actualmente, el tratamiento para el botulismo es limitado y a menudo incluye la administración de un anticuerpo neutralizante equino4; sin embargo, debido a que la toxina se internaliza rápidamente en las neuronas, el anticuerpo tiene una ventana de tiempo estrecha de administración. Por lo tanto, muchos investigadores creen que el BoNT/A LC puede ser un mejor objetivo terapéutico. Debido a que la LC es una metaloproteasa dependiente de zinc, un enfoque para inhibir la actividad de LC/A ha sido desarrollar compuestos que quelan el ion de zinc del sitio activo. Por ejemplo, los compuestos de hidroxamato quelan el zinc del sitio activo y tienen una excelente potencia in vitro (Ki del mejor inhibidor de molécula pequeña de BoNT/A LC hasta la fecha es de 77 nM)5. Sin embargo, muchas moléculas pequeñas no logran avanzar como terapéuticas debido a diversos problemas ex vivo o in vivo, como la escasa solubilidad acuosa, el metabolismo rápido y/o la alta citotoxicidad. Por lo tanto, se necesitan nuevos compuestos con propiedades farmacológicas y farmacocinéticas mejoradas. La identificación de compuestos de moléculas pequeñas a menudo implica un cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar andamios nuevos. Los métodos iniciales para el cribado de la actividad de LC BoNT/A se basaron en la detección por HPLC de la escisión corta del sustrato peptídico, que requiere mucho tiempo y no es susceptible de aplicaciones HTS6-8. Posteriormente, Schmidt y sus colegas9 desarrollaron un ensayo de actividad de LC BoNT/A de alto rendimiento que utiliza un sustrato peptídico marcado con fluoresceína unido covalentemente a una placa de microtitulación. El BoNT/A LC escinde el sustrato y libera fluoresceína, que se puede cuantificar con un fluorómetro. El formato en placa de este ensayo permite cribar numerosos compuestos simultáneamente; Sin embargo, el ensayo requiere el marcaje de péptidos sintéticos con fluoresceína y el recubrimiento de las placas de ensayo con moléculas de sustrato derivatizadas, que son técnicas engorrosas. Schmidt et al. describieron posteriormente un método mucho más sencillo para detectar la actividad de la LC BoNT/A a bajas concentraciones, en el que se utilizaron una serie de sustratos fluorogénicos para monitorizar la actividad de la LC BoNT en tiempo real10. Las técnicas adicionales descritas en la literatura incluyen un ensayo basado en la transferencia de energía de despolarización después de la resonancia para detectar y cuantificar la actividad de BoNT en extractos crudos; este método se puede utilizar para aplicaciones de alto rendimiento10,11, aunque requiere equipos sofisticados para medir la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y las señales de polarización. Por último, se han presentado varios modelos basados en células para la intoxicación por NTBo (revisados en la referencia11) que permitirán a los investigadores estudiar las propiedades a menudo limitantes de los compuestos mencionados anteriormente, incluida la citotoxicidad, la permeabilidad celular y la estabilidad. Sin embargo, la mayoría de los ensayos basados en células existentes no son susceptibles de HTS y requieren mucho trabajo y tiempo.
Aquí, describimos un protocolo detallado para un método HTS que utiliza el sustrato LC BoNT/A BASADO EN FRET disponible comercialmente. El sustrato se basa en la secuencia de escisión SNAP-25 y es un péptido sintético de 13 meros que contiene un fluoróforo terminal y un extinguidor. La escisión BoNT/A separa el fluoróforo y el extintor, aboliendo el FRET y aumentando la fluorescencia medida, que se puede medir continuamente en un lector de placas de fluorómetro. El ensayo se utiliza de forma rutinaria en nuestro laboratorio, así como en otros, para identificar nuevas clases de inhibidores de la LC BoNT/A o para determinar la potencia relativa de los compuestos5,12-15 previamente identificados. Este ensayo es adecuado para HTS debido a su simplicidad, potencial de automatización, bajo costo de materiales y capacidad para cribar numerosos compuestos simultáneamente (ver referencia16; Caglič y otros, presentados; Bompiani et al., en preparación). Además de HTS, este ensayo se puede utilizar para comparar la potencia relativa de los compuestos mediante la determinación del valor IC50 (concentración necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la LC BoNT/A) de un compuesto. El ensayo se puede realizar manualmente en un formato de 96 pocillos (sección de Cribado Manual del Texto del Protocolo) o puede automatizarse en un formato de 384 pocillos para HTS (sección de Operación Automatizada del Texto del Protocolo).

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grado HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (grado HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Placa de ensayo negra</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384 pocillos Placa de ensayo negra de bajo volumen</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide Lista de sustratos FITC/Dabcyl</td><td>Biological Laboratories</td><td>521</td><td>Sustrato BoNT/A LC A BASE DE FRET</td></tr><tr><td>Solución de limpieza de pines</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Papel secante sin pelusa</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Sello y muestra Tapas de papel de aluminio</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

una plataforma basada en fret compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

La neurotoxina botulínica (NTBo) es una toxina bacteriana potente y potencialmente letal que se une a las neuronas motoras del huésped, se internaliza en la célula y escinde proteínas intracelulares que son esenciales para la liberación de neurotransmisores. La NTBo está compuesta por una cadena pesada (HC), que media la unión e internalización de la célula huésped, y una cadena ligera (LC), que escinde las proteínas intracelulares del huésped esenciales para la liberación de acetilcolina. Mientras que las terapias que inhiben la unión/internalización de toxinas tienen una pequeña ventana de tiempo de administración, los compuestos que se dirigen a la actividad intracelular de LC tienen una ventana de tiempo de administración mucho mayor, particularmente relevante dada la vida media extremadamente larga de la toxina. En los últimos años, las moléculas pequeñas han sido ampliamente analizadas como potenciales inhibidores de la LC en función de su mayor permeabilidad celular en relación con las terapias más grandes (péptidos, aptámeros, etc.). La identificación de pistas a menudo implica el cribado de alto rendimiento (HTS), en el que se examinan grandes bibliotecas de moléculas pequeñas en función de su capacidad para modular la función de la diana terapéutica. Aquí describimos un ensayo basado en FRET con un sustrato comercial de LC BoNT/A y LC recombinante que puede automatizarse para HTS de posibles inhibidores de BoNT. Además, describimos una técnica manual que se puede utilizar para el cribado secundario de seguimiento, o para comparar la potencia de varios compuestos candidatos.

El ensayo FRET basado en BoNT/A LC puede realizarse manualmente de manera de bajo rendimiento para caracterizar inhibidores conocidos o cribar bibliotecas pequeñas; alternativamente, el protocolo puede miniaturizarse y automatizarse para cribado de alto rendimiento (HTS) con bibliotecas grandes con el objetivo de identificar nuevos inhibidores de BoNT/A LC. Independientemente del enfoque utilizado, se debe observar un aumento en la fluorescencia a lo largo del tiempo cuando BoNT/A LC se incuba con el sustrato (Fi...

La cadena ligera de la neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A LC) es una metaloproteasa que entra en las neuronas motoras, escinde su sustrato SNAP-25 e interrumpe la neurotransmisión, lo que provoca una parálisis flácida. Utilizando un ensayo basado en FRET compatible con alto rendimiento, se pueden examinar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas para determinar su impacto en la actividad enzimática de BoNT/A LC.

Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar moléculas pequeñas en busca de neurotoxina botulínica, una inhibición de cadenas ligeras. Esto se logra preparando primero una serie de diluciones de compuestos con alta exactitud y precisión. El segundo paso es transferir las diluciones compuestas a una placa negra de 96 pocillos.A continuación, se añade una enzima de cadena ligera diluida a la placa y la enzima se incuba con el compuesto durante cinco minutos a temperatura ambiente. El paso final es la adición del sustrato del traste de la cadena ligera para iniciar la reacción, que se monitorea con un lector de placas de fluorescencia. En última instancia, se deben emplear cribados secundarios que utilicen un sustrato peptídico no fluorescente para confirmar la actividad del compuesto y determinar constantes cinéticas más rigurosas, como la constante de disociación del inhibidor o ki.La principal ventaja de este ensayo sobre los métodos existentes, como los métodos basados en HPLC o basados en células, es que es fácil de realizar, fácilmente automatizable y se puede utilizar para comparar la potencia relativa de varios compuestos. Las personas pueden tener dificultades cuando son nuevas en este método al preparar una serie de diluciones compuestas y mezclar adecuadamente la placa una vez que se agregan todos los componentes. Comience este procedimiento preparando los tampones y los reactivos como se describe en el protocolo de texto.Configure el lector de placas para agitar la placa a velocidad media durante 10 segundos y, a continuación, para controlar la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 490 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 523 nanómetros cada cinco minutos en modo cinético durante una hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Después de determinar el rango de concentración del compuesto, etiquete los tubos con el nombre y la concentración apropiados del compuesto, Eloqua, 100% de óxido de sulfilo de dimetilo o DMSO en todos los tubos para prepararlos para la dilución de cereales compuestos. A continuación, prepare la dilución en serie de los compuestos para la serie estándar de una a tres diluciones.Añada dos microlitros del compuesto sin diluir a cuatro microlitros de DMSO en el primer tubo de la serie de dilución y mezcle bien con una nueva punta de pipeta. Retire dos microlitros de la primera dilución y agregue cuatro microlitros de DMSO en la mezcla del segundo tubo. Y repita para las diluciones restantes.Asegúrese de mezclar bien las diluciones de compuestos para asegurarse de que las concentraciones de compuestos sean precisas. Cubra los tubos compuestos y déjelos a un lado A temperatura ambiente, obtenga una placa de 96 pocillos negra opaca de fondo plano. Usando la configuración de placa recomendada que se puede encontrar en el protocolo de texto.Dispensar manualmente un microlitro de la dilución del compuesto respectivo directamente al fondo de cada pocillo correspondiente para los pocillos del uno al nueve, dispense un microlitro de la concentración más alta de compuesto que se va a probar al pozo.11. Para servir como control de fluorescencia intrínseca compuesto. Este control consiste en determinar si los propios compuestos son fluorescentes o afectan a la hidrólisis del sustrato.Dispense manualmente un microlitro de un inhibidor potente conocido al pocillo, 12 como control positivo y un microlitro de 100% DMSO al pocillo. 10 como control negativo con una dispensación de pipeta automatizada. 79 microlitros de tampón de ensayo al lado de los pocillos, uno a través de 10 y 12 y 89 microlitros al lado del pocillo, 11.Asegúrese de no tocar la punta con el fondo del pozo donde está presente el compuesto para evitar la contaminación cruzada de los pocillos. Vortex, la enzima de cadena ligera diluida, y use un pipeteador automatizado para agregar 10 microlitros de la enzima al costado de cada pocillo, excepto el pocillo 11. Golpee suavemente la placa para asegurarse de que el volumen total de la enzima agregada vaya al fondo del pocillo, mezcle, cubra e incube suavemente la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente.Esta incubación proporciona un paso de equilibrio de presa para que los compuestos se unan a la cadena ligera. Antes de la adición de sustrato, vórtice suavemente la neurotoxina botulínica, un sustrato de cadena ligera. Luego, con una pipeta automática, agregue 10 microlitros de sustrato al costado de cada uno.Bueno, asegúrese de agregar el sustrato al lado del pozo opuesto a donde se agregó la enzima anteriormente. Golpee suavemente la placa para mezclar los reactivos inmediatamente. Coloque la placa en un lector de placas de microtitulación de fluorescencia y comience el programa previamente configurado.Una vez finalizado el programa, calcule las velocidades de la enzima graficando la unidad de fluorescencia relativa frente al tiempo y calculando la pendiente de la línea durante el período lineal de la reacción. Prepararse para la operación automatizada para el cribado de alto rendimiento como se describe en el protocolo de texto, Demostrar una parte del protocolo de cribado de alto rendimiento será de joven un postdoc en mi laboratorio. Mostrará cómo se transfieren los compuestos a las placas para el cribado de alto rendimiento utilizando equipos de automatización de laboratorio Después de dispensar neurotoxina botulínica diluida, una enzima de cadena ligera en la placa de ensayo.Asigne áreas en la plataforma del manipulador de líquidos para las placas compuestas, las placas de ensayo y los recipientes con soluciones de limpieza. Programe el manipulador de líquidos para colocar las placas compuestas y las placas de ensayo en las posiciones designadas y retire las tapas de las placas antes de estampar. Calibre el software del programa de estampación y asegúrese de que las clavijas de estampación estén sumergidas, pero sin rayar la parte inferior de la placa de ensayo.Estampe 50 nanolitros del compuesto directamente en la placa de ensayo que contiene ocho microlitros de neurotoxina botulínica. Una cadena ligera. Limpie los alfileres después de cada plato sumergiéndolos en DMSO y luego sequándolos en papel secante y repitiendo este proceso con isopropanol y metanol.Finalmente, seque los alfileres sobre el ventilador después de que los compuestos se hayan estampado en las placas de ensayo con enzima. Por separado, apile las placas de compuesto de stock y las placas de ensayo cubren la placa de ensayo superior en la pila para evitar la evaporación y reserve. Asegúrese de incubar la cadena ligera con compuestos durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente.Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos cuando se estampa un gran número de placas. Por último, dispense el sustrato en las placas de ensayo y mida la fluorescencia como se describe en el protocolo de texto. Ya sea que se realice un ensayo de cadena ligera con neurotoxina botulínica basada en trastes de bajo rendimiento o de alto rendimiento, se debe observar un aumento de la fluorescencia con el tiempo cuando la neurotoxina botulínica, una cadena ligera, se incuba con el sustrato.Si se prueban diluciones en serie de un compuesto, a menudo se obtiene una serie de líneas con diferentes pendientes. Aquí. La concentración final de un compuesto a base de hidroxiato se enumera en unidades micromolares. Bueno, 10 en el diseño de placa descrito aquí sirve como un control negativo donde solo se agrega el vehículo.La tasa de esta reacción se define como 100% de actividad enzimática y las tasas en presencia de compuesto se pueden normalizar a esta tasa para obtener la tasa relativa o el porcentaje de inhibición. Cuando el ensayo se realiza con diluciones en serie de un compuesto, se puede utilizar un gráfico de la velocidad de la reacción frente a la concentración del inhibidor para determinar la concentración inhibitoria máxima media o IC 50. El rango de dilución debe elegirse de manera que el gráfico tenga forma sigmoidea para un ajuste óptimo de la curva.El valor IC 50 es una medida relativa de potencia que se describe mejor como un valor aparente de KI, ya que depende de la concentración de enzima presente en el ensayo. Este valor se puede utilizar para comparar y clasificar la potencia de varios compuestos si se prueban. Paralelamente, la mezcla adecuada de la placa después de agregar cada componente es crucial para obtener un aumento lineal suave de la fluorescencia a lo largo del tiempo, lo cual es necesario para determinar con precisión las velocidades iniciales.Este gráfico muestra un experimento representativo en el que no hubo suficiente mezcla y la tasa de formación del producto no es lineal a lo largo del tiempo. Análisis de datos confusos Una vez dominada esta técnica, se puede realizar en menos de dos horas para hasta ocho compuestos. Después de este experimento, se pueden realizar otros ensayos con sustratos peptídicos no fluorescentes para confirmar que los compuestos inhiben la neurotoxina botulínica, la cadena ligera y la actividad somática.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la potencia relativa de los inhibidores de cadenas ligeras de la neurotoxina botulínica. El protocolo se llevó a cabo en tres etapas. En primer lugar, la preparación de una serie de diluciones compuestas.En segundo lugar, la adición de una enzima de cadena ligera recombinante, y en tercer lugar, la adición de un sustrato fluorescente y la posterior medición en un lector de placas fluorescentes.

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Una plataforma compatible con alto rendimiento basada en FRET para la identificación y caracterización de moduladores de la cadena ligera de la neurotoxina botulínica

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Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica (Video) | JoVE Journal

Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica

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