Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica

El objetivo general de este procedimiento es detectar moléculas pequeñas en busca de neurotoxina botulínica, una inhibición de cadenas ligeras. Esto se logra preparando primero una serie de diluciones de compuestos con alta exactitud y precisión. El segundo paso es transferir las diluciones compuestas a una placa negra de 96 pocillos.

A continuación, se añade una enzima de cadena ligera diluida a la placa y la enzima se incuba con el compuesto durante cinco minutos a temperatura ambiente. El paso final es la adición del sustrato del traste de la cadena ligera para iniciar la reacción, que se monitorea con un lector de placas de fluorescencia. En última instancia, se deben emplear cribados secundarios que utilicen un sustrato peptídico no fluorescente para confirmar la actividad del compuesto y determinar constantes cinéticas más rigurosas, como la constante de disociación del inhibidor o ki.

La principal ventaja de este ensayo sobre los métodos existentes, como los métodos basados en HPLC o basados en células, es que es fácil de realizar, fácilmente automatizable y se puede utilizar para comparar la potencia relativa de varios compuestos. Las personas pueden tener dificultades cuando son nuevas en este método al preparar una serie de diluciones compuestas y mezclar adecuadamente la placa una vez que se agregan todos los componentes. Comience este procedimiento preparando los tampones y los reactivos como se describe en el protocolo de texto.

Configure el lector de placas para agitar la placa a velocidad media durante 10 segundos y, a continuación, para controlar la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 490 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 523 nanómetros cada cinco minutos en modo cinético durante una hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Después de determinar el rango de concentración del compuesto, etiquete los tubos con el nombre y la concentración apropiados del compuesto, Eloqua, 100% de óxido de sulfilo de dimetilo o DMSO en todos los tubos para prepararlos para la dilución de cereales compuestos. A continuación, prepare la dilución en serie de los compuestos para la serie estándar de una a tres diluciones.

Añada dos microlitros del compuesto sin diluir a cuatro microlitros de DMSO en el primer tubo de la serie de dilución y mezcle bien con una nueva punta de pipeta. Retire dos microlitros de la primera dilución y agregue cuatro microlitros de DMSO en la mezcla del segundo tubo. Y repita para las diluciones restantes.

Asegúrese de mezclar bien las diluciones de compuestos para asegurarse de que las concentraciones de compuestos sean precisas. Cubra los tubos compuestos y déjelos a un lado A temperatura ambiente, obtenga una placa de 96 pocillos negra opaca de fondo plano. Usando la configuración de placa recomendada que se puede encontrar en el protocolo de texto.

Dispensar manualmente un microlitro de la dilución del compuesto respectivo directamente al fondo de cada pocillo correspondiente para los pocillos del uno al nueve, dispense un microlitro de la concentración más alta de compuesto que se va a probar al pozo.11. Para servir como control de fluorescencia intrínseca compuesto. Este control consiste en determinar si los propios compuestos son fluorescentes o afectan a la hidrólisis del sustrato.

Dispense manualmente un microlitro de un inhibidor potente conocido al pocillo, 12 como control positivo y un microlitro de 100% DMSO al pocillo. 10 como control negativo con una dispensación de pipeta automatizada. 79 microlitros de tampón de ensayo al lado de los pocillos, uno a través de 10 y 12 y 89 microlitros al lado del pocillo, 11.Asegúrese

de no tocar la punta con el fondo del pozo donde está presente el compuesto para evitar la contaminación cruzada de los pocillos. Vortex, la enzima de cadena ligera diluida, y use un pipeteador automatizado para agregar 10 microlitros de la enzima al costado de cada pocillo, excepto el pocillo 11. Golpee suavemente la placa para asegurarse de que el volumen total de la enzima agregada vaya al fondo del pocillo, mezcle, cubra e incube suavemente la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Esta incubación proporciona un paso de equilibrio de presa para que los compuestos se unan a la cadena ligera. Antes de la adición de sustrato, vórtice suavemente la neurotoxina botulínica, un sustrato de cadena ligera. Luego, con una pipeta automática, agregue 10 microlitros de sustrato al costado de cada uno.

Bueno, asegúrese de agregar el sustrato al lado del pozo opuesto a donde se agregó la enzima anteriormente. Golpee suavemente la placa para mezclar los reactivos inmediatamente. Coloque la placa en un lector de placas de microtitulación de fluorescencia y comience el programa previamente configurado.

Una vez finalizado el programa, calcule las velocidades de la enzima graficando la unidad de fluorescencia relativa frente al tiempo y calculando la pendiente de la línea durante el período lineal de la reacción. Prepararse para la operación automatizada para el cribado de alto rendimiento como se describe en el protocolo de texto, Demostrar una parte del protocolo de cribado de alto rendimiento será de joven un postdoc en mi laboratorio. Mostrará cómo se transfieren los compuestos a las placas para el cribado de alto rendimiento utilizando equipos de automatización de laboratorio Después de dispensar neurotoxina botulínica diluida, una enzima de cadena ligera en la placa de ensayo.

Asigne áreas en la plataforma del manipulador de líquidos para las placas compuestas, las placas de ensayo y los recipientes con soluciones de limpieza. Programe el manipulador de líquidos para colocar las placas compuestas y las placas de ensayo en las posiciones designadas y retire las tapas de las placas antes de estampar. Calibre el software del programa de estampación y asegúrese de que las clavijas de estampación estén sumergidas, pero sin rayar la parte inferior de la placa de ensayo.

Estampe 50 nanolitros del compuesto directamente en la placa de ensayo que contiene ocho microlitros de neurotoxina botulínica. Una cadena ligera. Limpie los alfileres después de cada plato sumergiéndolos en DMSO y luego sequándolos en papel secante y repitiendo este proceso con isopropanol y metanol.

Finalmente, seque los alfileres sobre el ventilador después de que los compuestos se hayan estampado en las placas de ensayo con enzima. Por separado, apile las placas de compuesto de stock y las placas de ensayo cubren la placa de ensayo superior en la pila para evitar la evaporación y reserve. Asegúrese de incubar la cadena ligera con compuestos durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente.

Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos cuando se estampa un gran número de placas. Por último, dispense el sustrato en las placas de ensayo y mida la fluorescencia como se describe en el protocolo de texto. Ya sea que se realice un ensayo de cadena ligera con neurotoxina botulínica basada en trastes de bajo rendimiento o de alto rendimiento, se debe observar un aumento de la fluorescencia con el tiempo cuando la neurotoxina botulínica, una cadena ligera, se incuba con el sustrato.

Si se prueban diluciones en serie de un compuesto, a menudo se obtiene una serie de líneas con diferentes pendientes. Aquí. La concentración final de un compuesto a base de hidroxiato se enumera en unidades micromolares. Bueno, 10 en el diseño de placa descrito aquí sirve como un control negativo donde solo se agrega el vehículo.

La tasa de esta reacción se define como 100% de actividad enzimática y las tasas en presencia de compuesto se pueden normalizar a esta tasa para obtener la tasa relativa o el porcentaje de inhibición. Cuando el ensayo se realiza con diluciones en serie de un compuesto, se puede utilizar un gráfico de la velocidad de la reacción frente a la concentración del inhibidor para determinar la concentración inhibitoria máxima media o IC 50. El rango de dilución debe elegirse de manera que el gráfico tenga forma sigmoidea para un ajuste óptimo de la curva.

El valor IC 50 es una medida relativa de potencia que se describe mejor como un valor aparente de KI, ya que depende de la concentración de enzima presente en el ensayo. Este valor se puede utilizar para comparar y clasificar la potencia de varios compuestos si se prueban. Paralelamente, la mezcla adecuada de la placa después de agregar cada componente es crucial para obtener un aumento lineal suave de la fluorescencia a lo largo del tiempo, lo cual es necesario para determinar con precisión las velocidades iniciales.

Este gráfico muestra un experimento representativo en el que no hubo suficiente mezcla y la tasa de formación del producto no es lineal a lo largo del tiempo. Análisis de datos confusos Una vez dominada esta técnica, se puede realizar en menos de dos horas para hasta ocho compuestos. Después de este experimento, se pueden realizar otros ensayos con sustratos peptídicos no fluorescentes para confirmar que los compuestos inhiben la neurotoxina botulínica, la cadena ligera y la actividad somática.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la potencia relativa de los inhibidores de cadenas ligeras de la neurotoxina botulínica. El protocolo se llevó a cabo en tres etapas. En primer lugar, la preparación de una serie de diluciones compuestas.

En segundo lugar, la adición de una enzima de cadena ligera recombinante, y en tercer lugar, la adición de un sustrato fluorescente y la posterior medición en un lector de placas fluorescentes.