El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad proteolítica de la neurotoxina botulínica en matrices complejas como muestras farmacéuticas, ambientales y alimentarias. Esto se logra mediante la prueba de procesamiento primero y las muestras de curva estándar si es necesario, para establecer las condiciones adecuadas de pH y viscosidad. A continuación, la neurotoxina botulínica se inmunoprecipita a partir de las muestras utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos.

A continuación, las perlas magnéticas se lavan a fondo para eliminar cualquier compuesto que interfiera y se vuelven a suspender en un tampón de reacción optimizado. Finalmente, las perlas lavadas se incuban con un reportero de proteínas y miden espectroscópicamente la escisión del reportero a lo largo del tiempo. En última instancia, la comparación de la escisión reportera en las muestras de prueba con las muestras de curva estándar se utiliza para cuantificar la actividad de la toxina botulínica en las muestras de prueba con sensibilidad de bioensayo de ratón a ratón cercano.

Las principales ventajas de esta técnica sobre otros métodos como el ratón, el bioensayo, el inmunológico y otros métodos fluorescentes son que este ensayo no requiere el uso de animales y se ha demostrado su uso en matrices altamente complejas que se encuentran en muestras alimentarias, ambientales y farmacéuticas. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se requiere un procesamiento y dilución cuidadosos de la muestra. El Dr. Mark Dunning, científico de Bio Sentinel, demostrará este procedimiento.

Prepare tampones de acuerdo con el protocolo de texto para generar una curva estándar para cuantificar muestras de prueba, pese 10 más o menos 0.01 gramos de muestra de alimentos sólidos en un tubo cónico de 50 mililitros y reserve, esta muestra se utilizará como diluyente en un segundo tubo, pese dos más o menos 0.01 gramos de muestra de alimentos sólidos. Añadir neurotoxina botulínica o comprada a la superficie de la muestra de alimento de dos gramos hasta una concentración final de 30.000 MLD 50 por gramo de alimento. Incube el diluyente y las muestras enriquecidas a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados durante dos horas para que el robot tenga tiempo de interactuar con la matriz alimentaria.

Imitando una contaminación natural, consulte el protocolo de texto para conocer los tipos de muestras adicionales. A continuación, agregue un mililitro de GPB por gramo de alimento a las muestras con y sin pico, y use un mortero para homogeneizar hasta que estén completamente mezcladas. Extrapola el volumen total de la muestra de dos gramos de una muestra enriquecida del volumen total aproximado de la muestra de diluyente de 10 gramos.

A continuación, añada una décima parte del volumen de 10 tampón de neutralización a la muestra de diluyente de 10 gramos y dos gramos compraron una muestra enriquecida en función de sus volúmenes totales. Mezcle bien las muestras por inversión, clarifique parcialmente ambas muestras centrifugando durante 10 minutos a 6.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados. A continuación, retire inmediatamente los sobrenadantes y transfiéralos a nuevos tubos utilizando el bot, una muestra enriquecida como D uno y la muestra no enriquecida como diluyente genera las muestras de curva estándar restantes en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Para preparar muestras de alimentos sólidos, comience pesando dos más o menos 0,01 gramos de muestra sólida desconocida en un tubo cónico de 50 mililitros. Añadimos dos mililitros de GPB y utilizamos un mortero para homogeneizar la muestra. A continuación, agregue una décima parte del volumen de tampón de neutralización 10 x a la muestra y mezcle bien por inversión después de clarificar parcialmente la muestra por centrifugación durante 10 minutos a 6, 000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius, transfiera inmediatamente al menos 750 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga.

Esta es la dilución desconocida uno. Agregue 675 microlitros del diluyente a dos tubos marcados como dilución desconocida dos y tres. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de curvas estándar.

Use la dilución uno para hacer una dilución en serie transfiriendo 75 microlitros de dilución uno al tubo de dilución dos y mezclando. Luego transfiera 75 microlitros de dilución dos al tubo de dilución tres y mezcle. Para clarificar las muestras, centrifugarlas durante cinco minutos al menos 14.000 veces. Gravedad.

Retire inmediatamente los sobrenadantes y transfiéralos a nuevos tubos para configurar una placa para las muestras, agregue 20 microlitros de tampón aglutinante de 10 x a cada pocillo, cada muestra desconocida y las muestras curvas estándar D uno a D ocho requieren tres pocillos y la muestra D nueve requiere seis pocillos. Agregue 200 microlitros de cada muestra a los pocillos respectivos y use un mezclador de microplacas para mezclar la placa durante 10 segundos. Agite las cuentas de IPA durante 10 segundos a la velocidad más alta o hasta que se vuelvan a suspender por completo.

A continuación, pipetee 20 microlitros de las perlas en cada pocillo de la muestra y mezcle la placa durante 30 segundos. Incube la placa en una incubadora de placas giratorias durante dos horas a 750 RPM y 25 grados Celsius o temperatura ambiente para lavar la placa con una lavadora de placas automatizada. Después de ejecutar el programa principal, coloque la placa en la placa de separación de cordón magnético de 96 pocillos en la arandela de placas.

A continuación, ejecute el programa de lavado maestro. Cuando se complete el programa, retire la placa de la lavadora. Agregue 50 microlitros de un tampón de reacción x a cada pocillo de muestra y mezcle durante 30 segundos.

Para iniciar el ensayo de la matriz de prueba del bot, agregue 50 microlitros de 0,5 micromolares AE reportero. A cada pocillo de muestra para evitar efectos de borde, agregue 100 microlitros de agua a cada uno que no use. Bueno, use cinta de techo para sellar la placa, protegerla de la luz e incubarla a 750 RPM y 25 grados centígrados o temperatura ambiente.

En cada vez que lea, retire la placa de la incubadora. Retire la cinta del techo e inmediatamente coloque la placa En la placa de separación de cuentas magnética de 96 pocillos, deje que las cuentas se separen durante dos minutos. Coloque la placa en el lector de microplacas y mida las emisiones a unos 470 y a unos 526 nanómetros bajo excitación a unos 434 nanómetros.

Si se desean tiempos de lectura adicionales, después de volver a suspender las perlas durante 30 segundos en el mezclador de microplacas, vuelva a sellar la placa y devuélvala a la incubadora. A continuación se muestran los resultados de los ensayos en los que se utilizó un toin holográfico introducido en PBS y se probó después de incubaciones de dos, cuatro y 24 horas con el informador de EA. La escisión del reportero por el bot se mide como una reducción en la relación de emisión medida por nuestro lector de placas de aproximadamente 2,7 para el reportero intacto a aproximadamente 0,7 para el reportero completamente escindido.

Los valores específicos serán diferentes entre los lectores de placas, como se ve por el desplazamiento hacia la izquierda en la curva, el tiempo de incubación prolongado con el reportero da como resultado un aumento de la división del reportero. Los puntos de datos probados por triplicado muestran una desviación estándar baja de la media y siguen la tendencia esperada de aumento de la relación de emisión con disminución de la carga de toxinas. El hecho de que el ensayo no siga esta tendencia esperada puede indicar un error durante la generación de dilución o el trazado de datos, las relaciones de emisión de los controles que no contienen bot A también permanecen estables durante la incubación, lo que indica la falta de actividad proteasa no específica.

Esta figura muestra la metodología general utilizada para detectar o cuantificar cualquier muestra desconocida contra una curva estándar y cuantifica las muestras farmacéuticas. Se generó una curva estándar en PBS con un bot purificado, un holo toin y se procesó en paralelo con diluciones de productos farmacéuticos generados a partir de un solo vial de 100 unidades de Botox liofilizado rehidratado en solución salina al 0,9% en este ensayo, la parte lineal de la curva estándar se encuentra entre una relación de emisión de 2,11 y 1,05, y se indica mediante el cuadro discontinuo en la figura. Las concentraciones de las tres incógnitas que caen dentro de este rango lineal se interpolaron a partir de la curva estándar.

En este experimento, se utilizaron tomates frescos y leche al 2% como matrices de alimentos sólidos y líquidos y se enriquecieron con un complejo compuesto por las proteínas centrales asociadas al hollo, toin y neurotoxinas. Esta combinación fue seleccionada porque se asemeja a la toxina producida durante una contaminación natural por clostridium, como se muestra aquí. La recuperación del bot A se observa con ambas matrices.

Además, el aumento del tiempo de incubación con el reportero aumenta la sensibilidad del ensayo, pero no da lugar a una disminución de las tasas de emisión para los controles sin toxinas, lo que indica que la escisión observada es el resultado de bot A y no de la arrastre de proteasa inespecífica del alimento en el ensayo. En esta tabla se resumen el bot A-L-O-D-L-O-Q y EC 50 para ambos alimentos en cada punto de tiempo mostrado. El LOD y el LOQ se definen como la muestra de concentración más baja con una relación de emisión inferior a tres y 10 desviaciones típicas por debajo del nivel de fondo, respectivamente.

Se espera cierta variabilidad de matriz a matriz en LOD y LOQ, ya que los efectos de la matriz pueden influir en la unión de la toxina a las perlas y la recuperación de las perlas durante el lavado. Si bien parecería que hubo más recuperación de toxinas de la leche al 2% que de los tomates a partir de los datos, gran parte de esta diferencia se debe a la dilución adicional requerida para homogeneizar las muestras de tomate en GPB. Además de ser una matriz alimenticia sólida, los tomates son un tipo de muestra notable en el que el ajuste del pH y la fuerza iónica es fundamental para el éxito del ensayo.

Esta figura ilustra las respuestas del ensayo cuando se prueban tomates con o sin la inclusión del tampón de neutralización 10x. La falta de adición del tampón da lugar a una recuperación deficiente del bot A de las muestras y se demuestra mediante una relación de emisión constante en todas las concentraciones de bot A analizadas mediante la adición del tampón de neutralización 10 veces, sin embargo, da lugar a una detección sensible de toxinas, las proteasas no específicas pueden ser endógenas a la muestra de alimento o introducidas cuando se utilizan preparaciones de bot no purificadas, como el cultivo de Clostridium, sobrenadantes, y pueden escindir el reportero de EA dando lugar a resultados falsos positivos. Este ejemplo demuestra la actividad de la proteasa inespecífica encontrada en sobrenadantes de cultivo de Clostridium bot a utilizando un reportero modificado que ya no es escindido por bot A. Los altos niveles de escisión del reportero indican el cultivo.

El sobrenadante contiene una actividad proteasa significativa, que se anula eficazmente mediante la adición de inhibidores de la proteasa. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un tiempo total de ensayo de entre cuatro y 26 horas, dependiendo del tipo de muestra y la carga de toxinas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cuantificar la neurotoxina botulínica a partir de muestras complejas utilizando inmunoprecipitación en un sistema reportero de proteínas basado en fluorescencia.

No olvide que trabajar con neurotoxinas botulínicas puede ser extremadamente peligroso y se deben usar precauciones como guantes, códigos de laboratorio y cabinas de seguridad química y biológica mientras se realiza este procedimiento.