Name: El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a aislar y cuantificar la neurotoxina botulínica en matrices complejas como alimentos y muestras ambientales mediante inmunoprecipitación con perlas magnéticas y ensayo fluorimétrico.

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Los autores desean agradecer a H. Olivares y D. Ruge para las discusiones y consejos valiosos. Esta investigación fue financiada en parte por un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) y un Departamento de Defensa contrato (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin y WC Tucker son empleados o propietarios de BioSentinel Inc. BioSentinel actualmente fabrica y ha comercializado algunos de los reactivos que se presentan en este informe.

Este protocolo describe los procedimientos para la cuantificación de BoNT / A complejo holotoxina o Clostridium sobrenadante de cultivo en matrices complejas. El protocolo es el mismo, sin embargo, al probar otra serotipos de BoNT (por ejemplo BoNT / B, E y F) con sus respectivos ensayos Matrix 56,60, aunque la sensibilidad del ensayo variará según los serotipos y ensayos. Este protocolo no tiene en cuenta para cada tipo de muestra posible y algunas modificaciones puede ser necesaria dependi...

Neurotoxinas botulínicas (BoNT) son las sustancias más letales conocidos, con dosis letales intravenosas humanos estiman en 3.1 ng / kg 1,2. Siete serotipos de BoNT estructuralmente similares, etiquetadas A a la G, de existir, consistiendo cada uno en un dominio de cadena pesada responsable de la unión celular, la absorción, y la translocación en el citosol y una cadena ligera que codifica una endopeptidasa de zinc 3-5. La exquisita toxicidad de BoNT resulta de, en parte, de su entrada obligatoria y específica en las neuronas motoras en la unión neuromuscular 6. Una vez dentro de la neurona, la endopeptidasa de la cadena ligera escinde específicamente uno o más de la N-etilmaleimida-sensible receptor soluble de proteína de fijación del factor (SNARE) proteínas necesarias para la fusión de vesículas, la inhibición de la liberación de neurotransmisores y que conduce a parálisis flácida 7-14. Comúnmente conocida como la enfermedad &quot;botulismo&quot; parálisis del diafragma y los músculos intercostales por BoNT en última instancia se traduce ense reciben insuficiencia respiratoria y la muerte a menos que el diagnóstico y tratamiento tempranos. Botulismo alimentario humano es más comúnmente asociado con BoNT serotipos A, B, E y F (BoNT / D, BoNT / B, etc) y por lo general resulta de la ingestión de alimentos contaminados 15,16, aunque, varios casos de botulismo por heridas fueron reportados entre los usuarios de drogas por vía intravenosa 17,18. En los Estados Unidos, el botulismo infantil como resultado de la ingestión de esporas de Clostridium por los niños menores de uno es la forma más común de botulismo 19-21. Sin embargo, se reportaron brotes de origen alimentario BoNT resultantes de conservas caseras impropio y el procesamiento de alimentos, tanto en Estados Unidos como en el extranjero. Entre 2000-2009, se reportaron al menos 338 casos de botulismo transmitido por alimentos en todo el mundo incluyendo a seis víctimas mortales 22. La capacidad de detectar rápidamente y con sensibilidad brotes de botulismo de origen alimentario es un indicador crítico que podría ayudar al diagnóstico precoz 23,24. Por otra parte, los métodos de detección que permiten rentable y las pruebas de rutina de alimentos dará lugar a una mejora de la seguridad alimentaria. Especificidad neuronal de BoNT y larga vida media biológica también lo convierte en un potente terapéutico. En los Estados Unidos, los medicamentos basados ​​en la NTBo están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de afecciones cosméticas y trastornos relacionados neuromusculares incluidas las líneas del entrecejo, distonía cervical, dolores de cabeza por migraña, la vejiga hiperactiva, y estrabismo. Numerosas aplicaciones &quot;off-label&quot; están documentados, incluyendo los tratamientos de dosis alta para la disfunción muscular severa 25-28. Cuantificación de toxinas precisa es fundamental para la dosificación correcta, ya que una dosis insuficiente puede dar lugar a un tratamiento ineficaz, mientras que una sobredosis pone a los pacientes en riesgo de efectos secundarios potencialmente dañinos. Desafortunadamente, no existe un protocolo ensayo de potencia normalizada se comparte entre los fabricantes, lo que resulta en desigualdades de definición de unidad entre productores de medicamentos a base de BoNT29-31 cts. La prueba estándar para la NTBo es el bioensayo en ratones en los que las muestras que contienen NTBo se inyectan por vía intraperitoneal en ratones, y el número de muertes registradas más de 1-7 días 16,32,33. El bioensayo en ratones es muy sensible a los límites de detección (LOD) de 5-10 pg de BoNT / A 34, sin embargo, las preocupaciones éticas sobre el uso de animales, el alto costo de la capacitación del personal y el mantenimiento de instalaciones de los animales, los tiempos de ensayo de largo, y la falta de protocolos estandarizados resultaron en llamadas a desarrollar, las pruebas estandarizadas BoNT libre de productos animales y métodos de cuantificación 35-39. Recientemente, varios métodos alternativos de cuantificación BoNT fueron desarrollados que ofrecen ratón o casi ratón sensibilidad bioensayo 40-49. Estos métodos suelen utilizar la fluorescencia, la espectrometría de masa, o métodos inmunológicos y ofrecen tiempos de ensayo considerablemente más corto que el bioensayo en ratones sin el uso de animales. Mass-espectrometría de enfoques combinados con techniq inmunológicaues, se mostró a detectar y cuantificar BoNT contenida en los alimentos y otras muestras complejas, sin embargo, los requisitos de capacitación de personal y equipo especializado límite de estos ensayos de 50-55. La mayoría de los otros ensayos alternativos no son fácilmente aplicables a la prueba de la muestra compleja o carecen del rendimiento necesarios para las pruebas de rutina BoNT. La naturaleza altamente variable de la viscosidad de la muestra de alimentos, pH, contenido de sal, y constituyentes de la matriz presenta un desafío especialmente difícil cuando se trata de desarrollar métodos de ensayo in vitro con sensibilidad para que coincida con la potencia extrema de la NTBo. Por otra parte, incluso los sistemas de amortiguación simples y relativamente benignas, como las que resultan de la resuspensión de los productos farmacéuticos a base de BoNT, contienen sal, albúmina, azúcar y estabilizantes (por ejemplo, excipientes) que impactan significativamente in vitro BoNT potencia 56. Se requiere la purificación de toxinas de las pruebas de actividad precisa de todos pero la más sencilla de las muestras 56-59. LaBoTest ensayos de Matrix fue diseñada para una rápida y de alto rendimiento, y la cuantificación consistente de BoNT a partir de muestras de alta complejidad utilizando equipos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de investigación 56,60. Estos ensayos utilizan perlas paramagnéticas unidas covalentemente a los anticuerpos anti-BoNT específicos de serotipo de atar y secuestrar BoNT de una muestra y luego eliminar la interferencia de compuestos de matriz mediante lavado. Después del lavado, atado actividad proteolítica BoNT se cuantifica entonces en un tampón de reacción optimizado utilizando un reportero compatible con el serotipo BoNT está probando. Estos reporteros son proteínas fluorogénicos que consisten en una proteína fluorescente cian N-terminal (PPC) y un resto derivado de la proteína fluorescente amarilla C-terminal de resto (Venus) unidos por un sustrato de BoNT, residuos de SNAP25 141 a 206 o los residuos de sinaptobrevina 33-94 que constituye la BoTest A / E o B / D / reporteros F / G, respectivamente 45. Reportero escisión por BoNT se vigila por medio de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET). Cuando tque el reportero está intacta, la excitación de CFP se traduce en FRET a Venus, apagando emisión PPC y emocionante emisión Venus. La escisión del reportero por BoNT impide FRET, lo que lleva a un aumento en la emisión de PPC y disminución en la emisión de Venus. La actividad de BoNT se puede medir cuantitativamente utilizando la relación de las emisiones de la PPC y Venus. LOD por debajo de 3 pg son posibles a partir de una amplia gama de alimentos utilizando un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento 56. Aumento de la sensibilidad se puede conseguir utilizando volúmenes de muestra más grandes ya que el ensayo permite la concentración de la toxina en la superficie de la perla. Los ensayos de Matrix BoTest para BoNTs A, B, E y F se desarrollaron y probaron con alimentos, productos farmacéuticos, y las muestras ambientales 56,60. Aquí se describe los procedimientos para la ejecución de estos ensayos para la detección de la NTBo en baja complejidad (por ejemplo, productos farmacéuticos, la NTBo en la memoria intermedia) y alta complejidad (por ejemplo, alimentos, medio ambiente) muestras. Métodos de procesamiento específicospara se abordan varios tipos de muestras en este protocolo y tipos de muestras que no se describen aquí por lo general se pueden adaptar usando una combinación de los métodos presentados. El protocolo fue desarrollado y probado con BoNT / A, pero se puede adaptar a otros serotipos de NTBo utilizando sus respectivos ensayos como se ha demostrado en otras partes 56,60.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A Kit de detección de neurotoxinas botulínicas BioSentinel</td><td></td><td>A1015</td><td>También están disponibles kits de detección para BoNT/B y F.</td></tr><tr><td>Lector de microplacas de fluorescencia Varioskan Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>Se pueden utilizar la mayoría de las unidades basadas en monocromadores o filtros con excitación de 434 nm y capacidad de emisión de 470 nm y 526 nm.</td></tr><tr><td>Placa de separación magnética de cordón de 96 pocillos</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H Se</td><td>pueden usar otras placas magnéticas, pero la placa debe estar diseñada para separar las cuentas hacia el costado del pozo.</td></tr><tr><td>Lavadora de placas magnética compatible con cordones</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>Opcional, solo se requiere para el lavado automatizado de placas. También se pueden usar otras arandelas de placa compatibles con cordones magnéticos, pero deben probarse antes de usarlas.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>Opcional, solo se requiere para muestras que necesitan centrifugación.</td></tr><tr><td>Mezclador de placas MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> orbital <td>Utilizado a temperatura ambiente o a 25 & grados; C Si se dispone de control</td></tr><tr><td>de temperatura, Comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Solo se requiere para pruebas alimentarias o ambientales. Los inhibidores de la proteasa deben estar libres de EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiológicos</td><td></td><td>Opcional, solo necesario para fines de estandarización y cuantificación</td></tr><tr><td>Negro, de fondo plano Placas de 96 pocillos</td><td>Las placas de 237105 NUNC</td><td></td><td>no deben tratarse</td></tr><tr><td>Cinta de sellado de placas de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica a partir de matrices complejas utilizando el botest matrix ensayos

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Se requiere la detección y cuantificación de la neurotoxina botulínica (NTBo) en matrices complejas precisa para la industria farmacéutica, medioambiental, y las pruebas de muestra de alimento. Se necesita prueba rápida BoNT de los productos alimenticios durante el forense del brote, el diagnóstico del paciente, y las pruebas de seguridad de los alimentos mientras que se requiere la prueba de potencia precisa para la fabricación de productos de fármacos basado en la NTBo y la seguridad del paciente. El bioensayo en ratón ampliamente utilizado para la prueba de BoNT es altamente sensible, pero carece de la precisión y el rendimiento necesario para la prueba rápida y rutinaria de BoNT. Además, el uso del bioensayo de los animales ha dado lugar a los llamados de las autoridades reguladoras de medicamentos y productos proponentes derechos de los animales en los EE.UU. y en el extranjero para sustituir el bioensayo en ratones para probar la NTBo. Varios ensayos in vitro de recambio en se han desarrollado que funciona bien con purificada de BoNT en tampones simples, pero la mayoría no han demostrado ser aplicable a prueba en matrices muy complejas. Aquí, un protocolo para la detección deNTBo en matrices complejas utilizando la matriz de ensayos BoTest se presenta. El ensayo consta de tres partes: La primera parte implica la preparación de las muestras para las pruebas, la segunda parte es un paso inmunoprecipitación usando anti-BoNT recubiertas de anticuerpos perlas paramagnéticas para purificar la NTBo de la matriz, y la tercera parte cuantifica proteolítica de la BoNT aislado actividad utilizando un reportero fluorogenic. El protocolo está escrito para las pruebas de alto rendimiento en placas de 96 pocillos utilizando matrices de ambos líquidos y sólidos y requiere alrededor de 2 h de preparación manual con tiempos de ensayo total de 4-26 horas dependiendo del tipo de muestra, la carga de la toxina, y la sensibilidad deseada. Los datos se presentan para las pruebas de BoNT / A con solución salina tamponada con fosfato, un producto farmacéutico, el sobrenadante del cultivo, 2% de leche, y tomates frescos e incluye la discusión de los parámetros críticos para el éxito del ensayo.

Un diagrama que resume los pasos en el protocolo descrito se muestra en la Figura 2. El ensayo requiere entre 4-26 horas en completarse, dependiendo del tipo de muestra y la sensibilidad del ensayo deseado, pero sólo ~ 2 horas de tiempo de práctica. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y, dependiendo del tipo de prueba que se lleva a cabo, permite realizar pruebas por triplicado de hasta 20 muestras incluidas las normas por placa. La Figura 3 muestr...

La neurotoxina botulínica Matriz BoTest (BoNT) ensayos de detección de purificar y cuantificar rápidamente BoNT a partir de una variedad de matrices de muestras. Aquí, se presenta un protocolo para la detección y cuantificación de BoNT a partir de matrices tanto sólidos como líquidos y demostrar el ensayo con BOTOX ®, los tomates y la leche.

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad proteolítica de la neurotoxina botulínica en matrices complejas, como muestras farmacéuticas, ambientales y alimentarias. Esto se logra primero procesando, si es necesario, las muestras de prueba y las muestras de la curva patrón para establecer condiciones adecuadas de pH y viscosidad. A continuación, la neurotoxina botulínica se inmunoprecipita a partir de las muestras utilizando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos.Luego, las perlas magnéticas se lavan exhaustivamente para eliminar cualquier compuesto interferente y se resuspenden en un tampón de reacción optimizado. Finalmente, las perlas lavadas se incuban con un reportero proteico y se mide espectroscópicamente la escisión del reportero a lo largo del tiempo. En última instancia, la comparación de la escisión del reportero en las muestras de prueba frente a las muestras de la curva patrón se utiliza para cuantificar la actividad de la toxina botulínica en las muestras de prueba con una sensibilidad cercana a la del bioensayo en ratón.Las principales ventajas de esta técnica frente a otros métodos, como el bioensayo con ratón, métodos inmunológicos

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Investigación

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Este video muestra un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples objetivos de citocinas en una muestra. Se utiliza una mezcla de distintas microesferas conjugadas con anticuerpos específicos de citocinas para unirse a las citocinas presentes en la muestra. Los reporteros marcados con estreptavidina se inmovilizan en las citocinas unidas mediante anticuerpos de detección biotinilados. La citometría de flujo identifica las citocinas unidas en función de los tamaños únicos y...

Un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples dianas citocinas

La cadena ligera de la neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A LC) es una metaloproteasa que entra en las neuronas motoras, escinde su sustrato SNAP-25 e interrumpe la neurotransmisión, lo que provoca una parálisis flácida. Utilizando un ensayo basado en FRET compatible con alto rendimiento, se pueden examinar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas para determinar su impacto en la actividad enzimática de BoNT/A LC.

Una plataforma basada en FRET compatible con alto rendimiento para la identificación y caracterización de moduladores de cadena ligera de neurotoxina botulínica

La neurotoxina botulínica es una de las toxinas más potentes entre los agentes de bioamenaza de categoría A, sin embargo, no se dispone de una terapéutica posterior a la exposición. El enfoque de imágenes de alto contenido es una metodología poderosa para identificar nuevos inhibidores, ya que permite el cribado multiparamétrico utilizando neuronas motoras biológicamente relevantes, el objetivo principal de esta toxina.

Un alto contenido de imágenes de Ensayo para la Identificación de la neurotoxina botulínica Inhibidores

Se describe un protocolo personalizado para diferenciar células madre embrionarias de ratón en poblaciones definidas de neuronas de alta pureza que exhiben sinapsis funcionales y comportamiento de red emergente. El análisis electrofisiológico demuestra la pérdida de la transmisión sináptica tras la exposición a los serotipos de neurotoxina botulínica /A-/G y neurotoxina tetánica.

Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

Este protocolo presenta un método validado de cromatografía líquida-movilidad iónica-espectrometría de masas de alta resolución para determinar la presencia de alcaloides del cornezuelo de centeno en los alimentos en cumplimiento del Reglamento (UE) 2023/915 de la Comisión recientemente publicado.

Detección de alcaloides de cornezuelo de centeno regulados en matrices alimentarias por cromatografía líquida-espectrometría de movilidad iónica atrapada-espectrometría de masas de tiempo de vuelo

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Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

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Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Este artículo describe un sistema de cultivo neuronal que se puede utilizar para obtener grandes cantidades de muestras axonales puras para análisis bioquímicos e inmunocitoquímicos. Esta técnica permitirá una mejor comprensión de la fisiología axonal normal y de las vías de señalización que conducen a la neurodegeneración.

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cultivos neuronales son un buen modelo para el estudio de las técnicas de estimulación del cerebro emergentes a través de su efecto sobre las neuronas individuales o una población de neuronas. Aquí se presentan los diferentes métodos para la estimulación de cultivos neuronales estampadas por un campo eléctrico producido directamente por los electrodos de baño o inducida por un campo magnético variable en el tiempo.

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Aprende a aislar y cuantificar la neurotoxina botulínica en matrices complejas como alimentos y muestras ambientales mediante inmunoprecipitación con perlas magnéticas y ensayo fluorimétrico.

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos (Video) | JoVE Journal

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

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