El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad proteolítica de la neurotoxina botulínica en matrices complejas, como muestras farmacéuticas, ambientales y alimentarias. Esto se logra primero procesando, si es necesario, las muestras de prueba y las muestras de la curva patrón para establecer condiciones adecuadas de pH y viscosidad. A continuación, la neurotoxina botulínica se inmunoprecipita a partir de las muestras utilizando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos.

Luego, las perlas magnéticas se lavan exhaustivamente para eliminar cualquier compuesto interferente y se resuspenden en un tampón de reacción optimizado. Finalmente, las perlas lavadas se incuban con un reportero proteico y se mide espectroscópicamente la escisión del reportero a lo largo del tiempo. En última instancia, la comparación de la escisión del reportero en las muestras de prueba frente a las muestras de la curva patrón se utiliza para cuantificar la actividad de la toxina botulínica en las muestras de prueba con una sensibilidad cercana a la del bioensayo en ratón.

Las principales ventajas de esta técnica frente a otros métodos, como el bioensayo con ratón, métodos inmunológicos y otros métodos fluorescentes, son que este ensayo no requiere el uso de animales y se ha demostrado útil en matrices altamente complejas presentes en muestras de alimentos, ambientales y farmacéuticas. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se requiere un procesamiento y dilución cuidadosos de las muestras. Este procedimiento será demostrado por el Dr. Mark Dunning, científico de Bio Sentinel.

Prepare los tampones según el protocolo descrito para generar una curva patrón para la cuantificación de muestras de prueba; pese 10 ± 0,01 gramos de muestra de alimento sólido en un tubo cónico de 50 mililitros y reserve esta muestra, que se utilizará como diluyente. En un segundo tubo, pese 2 ± 0,01 gramos de muestra de alimento sólido. Añada neurotoxina botulínica o bot al superficie de la muestra de alimento de 2 gramos hasta alcanzar una concentración final de 30 000 MLD50 por gramo de alimento. Incube las muestras diluyente y enriquecida a temperatura ambiente o a 4 grados Celsius durante dos horas para permitir que la toxina interactúe con la matriz del alimento.

Imitando una contaminación natural, consulte el protocolo escrito para tipos adicionales de muestras. A continuación, agregue un mililitro de GPB por gramo de alimento a las muestras inoculadas y no inoculadas, y utilice un pistilo para homogeneizar hasta que estén completamente mezcladas. Extrapolé el volumen total de la muestra de dos gramos inoculada a partir del volumen total aproximado de la muestra de diluyente de 10 gramos.

Luego, agregue un volumen de una décima parte de tampón de neutralización 10x a la muestra de diluyente de 10 gramos y a la muestra enriquecida de dos gramos, en función de sus volúmenes totales. Mezcle bien las muestras mediante inversión, y clarifique parcialmente ambas muestras mediante centrifugación durante 10 minutos a 6.000 × g y 4 °C. A continuación, retire inmediatamente los sobrenadantes y transfiera a tubos nuevos, utilizando la muestra enriquecida como D1 y la muestra no enriquecida como diluyente, y genere las muestras restantes para la curva patrón en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros.

Para preparar muestras de alimentos sólidos, comience pesando dos más o menos 0,01 gramos de muestra sólida desconocida en un tubo cónico de 50 mililitros. Añada dos mililitros de GPB y utilice un pistilo para homogeneizar la muestra. A continuación, añada una décima parte del volumen de tampón de neutralización 10x a la muestra y mezcle bien mediante inversión, después de clarificar parcialmente la muestra mediante centrifugación durante 10 minutos a 6.000 × g y 4 grados Celsius; inmediatamente transfiera al menos 750 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga.

Esta es la dilución desconocida uno. Añada 675 microlitros del diluyente a dos tubos etiquetados como dilución desconocida dos y tres. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de la curva patrón.

Utilice la dilución uno para realizar una dilución en serie, transfiriendo 75 microlitros de la dilución uno al tubo de dilución dos y mezclando. Luego, transfiera 75 microlitros de la dilución dos al tubo de dilución tres y mezcle. Para clarificar las muestras, centrifúgelas durante cinco minutos a al menos 14,000 ×g.

Retire inmediatamente los sobrenadantes y transfiéralos a nuevos tubos para preparar una placa para las muestras; agregue 20 microlitros de tampón de enlace 10 x a cada pocillo. Cada muestra desconocida y las muestras de la curva patrón D uno a D ocho requieren tres pocillos, y la muestra D nueve requiere seis pocillos. Agregue 200 microlitros de cada muestra a los pocillos respectivos y utilice un mezclador para microplacas para mezclar la placa durante 10 segundos. Vortexee las perlas IPA durante 10 segundos a velocidad máxima o hasta que estén completamente resuspendidas.

Luego pipetee 20 microlitros de las perlas en cada pocillo de muestra y mezcle la placa durante 30 segundos. Incube la placa en un incubador rotatorio durante dos horas a 750 RPM y 25 grados Celsius o temperatura ambiente para lavar la placa utilizando un lavador automático de placas. Después de ejecutar el programa de cebado, coloque la placa sobre la placa de separación de perlas magnéticas de 96 pocillos en el lavador de placas.

Luego, ejecute el programa de lavado principal. Cuando el programa haya finalizado, retire la placa del lavador. Añada 50 microlitros de tampón de reacción al 1 x a cada pocillo de muestra y mezcle durante 30 segundos.

Para iniciar el ensayo de matriz de bot, agregue 50 microlitros de reportero AE 0,5 micromolar. Para cada pozo de muestra y prevenir efectos de borde, agregue 100 microlitros de agua a cada pozo no utilizado. Use cinta adhesiva para sellar la placa, protéjala de la luz e incúbela a 750 RPM y 25 grados Celsius o a temperatura ambiente.

En cada momento de lectura, retire la placa del incubador. Retire la cinta superior e inmediatamente coloque la placa sobre la placa de separación magnética de perlas de 96 pocillos y deje que las perlas se separen durante dos minutos. Coloque la placa en el lector de microplacas y mida las emisiones a aproximadamente 470 y aproximadamente 526 nanómetros bajo excitación a aproximadamente 434 nanómetros.

Si se desean tiempos adicionales de lectura, después de resuspender las perlas durante 30 segundos en el mezclador de microplacas, vuelva a sellar la placa y regrese esta al incubador. Aquí se muestran los resultados del ensayo utilizando holotoxina bot introducida en PBS y analizada tras incubar durante dos, cuatro y 24 horas con el reportero AE. La escisión del reportero por bot se mide como una reducción en la relación de emisión registrada por nuestro lector de placas, que pasa de aproximadamente 2,7 para el reportero intacto a cerca de 0,7 para el reportero completamente escindido.

Los valores específicos serán diferentes entre lectores de placas, como se observa por el desplazamiento hacia la izquierda en la curva; un tiempo de incubación prolongado con el reportero resulta en un aumento de la escisión del reportero. Los puntos de datos probados por triplicado muestran una baja desviación estándar de la media y siguen la tendencia esperada de aumento en la relación de emisión con una disminución en la carga de toxina. El hecho de que el ensayo no siga esta tendencia esperada podría indicar un error durante la generación de diluciones o al graficar los datos; las relaciones de emisión de los controles que no contienen bot A también permanecen estables durante la incubación, lo que indica la ausencia de actividad proteasa no específica.

Esta figura demuestra la metodología general utilizada para detectar o cuantificar cualquier muestra desconocida frente a una curva estándar y cuantifica muestras farmacéuticas de bot. Se generó una curva estándar en PBS con bot purificada, una holotoína, y se procesó en paralelo con diluciones del producto farmacéutico obtenidas de un solo vial de 100 unidades de Botox liofilizado rehidratado en solución salina al 0,9 %. En este ensayo, la porción lineal de la curva estándar se encuentra entre una relación de emisión de 2,11 y 1,05, y está indicada por el cuadro punteado en la figura. Las concentraciones de las tres muestras desconocidas que caen dentro de este rango lineal se interpolaron entonces a partir de la curva estándar.

En este experimento, se utilizaron tomates frescos y leche al 2 % como matrices alimenticias sólida y líquida, y se contaminaron con bot A, un complejo compuesto por la holotoxina central, la toxina y las proteínas asociadas a la neurotoxina. Esta combinación fue seleccionada porque se asemeja a la toxina producida durante una contaminación natural por Clostridium, como se muestra aquí. Se observó la recuperación de bot A en ambas matrices.

Además, un mayor tiempo de incubación con el marcador aumenta la sensibilidad del ensayo, pero no provoca una disminución en las relaciones de emisión para los controles sin toxina, lo que indica que la escisión observada se debe a la botulina A y no a una proteasa inespecífica residual proveniente de los alimentos en el ensayo. En esta tabla se resumen la bot A-L-O-D-L-O-Q y la CE 50 para ambos alimentos en cada punto temporal mostrado. El LDD y el LDC se definen como la muestra de menor concentración con una relación de emisión inferior a tres y diez desviaciones estándar por debajo del fondo, respectivamente.

Se espera cierta variabilidad entre matrices en los valores de LOD y LOQ, ya que los efectos de la matriz pueden influir en la unión de la toxina a las perlas y en la recuperación de las perlas durante el lavado. Aunque los datos parecen indicar una mayor recuperación de toxina en leche al 2 % que en tomates, gran parte de esta diferencia se debe a la dilución adicional necesaria para homogeneizar las muestras de tomate en GPB. Además de ser una matriz alimentaria sólida, los tomates representan un tipo de muestra destacable en el que el ajuste de pH y de fuerza iónica es fundamental para el éxito del ensayo.

Esta figura ilustra las respuestas del ensayo al probar tomates con o sin la inclusión del tampón de neutralización 10x. La omisión del tampón provoca una recuperación deficiente de la toxina bot A a partir de las muestras, lo que se demuestra mediante una relación de emisión constante en todas las concentraciones de bot A ensayadas. La adición del tampón de neutralización 10x, sin embargo, permite una detección sensible de la toxina. Las proteasas inespecíficas pueden ser endógenas a la muestra alimenticia o introducidas al utilizar preparaciones no purificadas de bot, como sobrenadantes de cultivo de Clostridium, y pueden escindir el reportero AE, provocando resultados falsos positivos. Este ejemplo demuestra la actividad de proteasas inespecíficas encontradas en sobrenadantes de cultivo de Clostridium bot A, utilizando un reportero modificado que ya no es escindido por la bot A. Los altos niveles de escisión del reportero indican la presencia de actividad proteolítica en el cultivo.

El sobrenadante contiene actividad proteasa significativa, que se anula eficazmente mediante la adición de inhibidores de proteasas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un tiempo total de ensayo comprendido entre cuatro y veintiséis horas, dependiendo del tipo de muestra y de la carga de toxina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cuantificar la neurotoxina botulínica a partir de muestras complejas utilizando inmunoprecipitación en un sistema de reportero proteico basado en fluorescencia.

No olvide que trabajar con neurotoxinas botulínicas puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como el uso de guantes, códigos de laboratorio, y cabinas de seguridad química y biológica al realizar este procedimiento.