Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

El objetivo general de este procedimiento es detectar la simulación y la ubiquitinación de las proteínas cinéticas del núcleo de la levadura en ciernes, NDC 10 y NDC 80. Esto se logra cosechando primero células de levadura que expresan la bandera de silbido etiquetada con SMT 3 y MT marcada con NDC 10 o NDC 80, y haciendo extractos de proteínas a partir de estas células. El segundo paso es purificar tres conjugados SMT marcados con bandera silbada para la detección de sumatoria o inmunoprecipitar proteínas cinéticas mik tagg para la detección de ubiquitinación.

Posteriormente, la suma o ubiquitinación se detecta mediante el análisis de Western blot. En última instancia, la presencia de un patrón de escalonamiento para NDC 10 y NDC 80 confirma que estas proteínas son simuladas y ubiquitinadas. El método de purificación de proteínas descrito permite la detección tanto de simulación como de ubiquitinación de las proteínas connico ND C 10 y NDC 80 en la levadura sacro en ciernes.

Mi cci. La principal ventaja de esta técnica es que la cepa que hemos creado tiene dos ataques de epítopos, uno sobre la proteína de prueba y otro que permite la detección de la simulación. El uso de estas etiquetas reduce el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa con frecuencia cuando se utilizan suero policlonal.

La demostración de este procedimiento será realizada por Canero Uni, un becario de investigación en mi laboratorio. Las proteínas de interés se extraerán de gránulos de células de levadura preparados previamente y almacenados a menos 20 grados centígrados. Resus, suspenda las células en 0,5 mililitros de tampón helado.

Use tampón de guina si el extracto es para un ensayo desplegable con nitrilo de níquel, ácido triacético o perlas de superflujo de níquel NTA. Utilice el tampón A si el extracto es para inmunoprecipitación. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.

Transfiera las suspensiones de celdas a dos mililitros. Enrosca el tapón de dos en dos a cada tubo. Agregue un volumen de perlas de vidrio igual al volumen de la perla de suspensión de celdas.

Batir las celdas en un mini batidor de cuentas durante dos minutos a temperatura ambiente y luego colocar los tubos en hielo durante dos o tres minutos. Repita el batido de cuentas y el glaseado tres veces. Vórtice a alta velocidad a cuatro grados centígrados durante 30 a 60 minutos.

Verifique las células mediante la visualización bajo el microscopio para asegurarse de que las células estén lisadas. Las células lisadas aparecerán como fantasmas oscuros y carecerán de un límite o forma definida. Lo ideal es que al menos el 80% de las células estén mentidas.

A continuación, use un alfiler para perforar un agujero en la parte inferior del tubo. Coloque el tapón de rosca sin apretar y coloque el tubo en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 1000 veces G durante un minuto.

Para recolectar el lisado, transfiera el lisado a una centrífuga de tubo de microcentrífuga a 15, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para recolectar las proteínas extraídas. Después de medir la concentración de las proteínas extraídas con un kit de ensayo de proteínas, normalice todos los extractos para que cada uno contenga la misma cantidad de proteína. Lleve el volumen total a un mililitro con el tampón adecuado.

Aproximadamente cinco miligramos de proteína total se obtienen de 50 OD 600 de células. Guarde 50 microlitros de la proteína extraída como el extracto de célula entera. Los 950 microlitros restantes de extracto proteico se utilizarán posteriormente para la purificación de proteínas o la inmunoprecipitación de proteínas marcadas con MT.

Agregue 50 microlitros de dos tampones de muestra x laly a los 50 microlitros de extracto de célula entera. Incubar las muestras a 100 grados Celsius en un bloque de calor durante tres a cinco minutos antes de analizarlas mediante Western blot. Comience este procedimiento preparando las perlas de superflujo NTA de níquel necesarias para la purificación.

Obtenga la cantidad de perlas necesarias mediante centrifugación a baja velocidad durante un minuto. Retire el sobrenadante y lave las cuentas con PBS. Agregue un mililitro de PBS e invierta el tubo de arriba hacia abajo hasta que las cuentas se vuelvan a suspender.

Recoja las perlas por centrifugación a baja velocidad y elimine el sobrenadante. Lave las cuentas de esta manera un total de cinco veces. Suspender las perlas en un mililitro de tampón de guine y alícuotas en el número de tubos correspondientes a las muestras a procesar.

Recoja las perlas por centrifugación a baja velocidad y retire el sobrenadante de cada muestra. Añade 950 microlitros del extracto de célula entera. Preparado antes a 100 microlitros de las cuentas.

Incubar en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas o toda la noche. Centrifugar a 800 a 1500 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. Guarde 50 microlitros del sobrenadante.

Agregue 50 microlitros de tampón de muestra de dos x laly a este sobrenadante e incube a 100 grados Celsius en un bloque de calor durante tres a cinco minutos. Posteriormente se analizarán 10 microlitros de cada muestra mediante Western blot. Lave las perlas de níquel NTA superflow una vez con un mililitro de tampón de guine durante cinco a 10 minutos en una plataforma mecedora a temperatura ambiente.

A continuación, lave las perlas cinco veces con un mililitro de tampón de rotura, después del lavado final con tampón de rotura, vuelva a suspender las perlas en 90 microlitros de tampón de muestra de dos x laly. Agregue 10 microlitros de un molar para ayudar a disociar la proteína marcada de la NT de níquel. Las perlas se incuban a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante tres a cinco minutos. A continuación, el vórtice centrifuga a 13.000 veces G durante 30 segundos.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Para comenzar este procedimiento, obtenga la cantidad necesaria de anticuerpo en gel anti cmic aero affinity mediante centrifugación a baja velocidad. Retirar el sobrenadante, lavar la resina con tampón A Añadir un mililitro de tampón A e invertir de arriba hacia abajo hasta que la resina se vuelva a suspender.

Recoja la resina por centrifugación a baja velocidad y elimine el sobrenadante. Lavar un total de cinco veces. Suspender la resina en un mililitro de tampón A y alícuota en el número de tubos correspondientes a las muestras a procesar.

Recoja la resina por centrifugación a baja velocidad y elimine el sobrenadante. Añadir 950 microlitros de extracto de célula entera a 25 microlitros de resina Incubar en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente. Centrifugar a 800 a 1500 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados.

Guarde 50 microlitros del sobrenadante. Agregue 50 microlitros de tampón de muestra de dos x lam ly a este sobrenadante e incube a 100 grados Celsius en un bloque de calor durante tres a cinco minutos. Lavar la resina con tampón y añadir un mililitro de tampón, una inversión de arriba sobre abajo hasta que la resina se vuelva a suspender.

Recoja la resina por centrifugación a baja velocidad y elimine el sobrenadante después de eliminar el sobrenadante del lavado final. Vuelva a suspender la resina en 100 microlitros de tampón de muestra de suma, incube a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante tres a cinco minutos. A continuación, el vórtice centrifuga a 13.000 veces G durante 30 segundos.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Por último, cargue todas las muestras recopiladas de este protocolo. En una página de SDS, gel para el análisis de Western blot, se utilizaron cepas de levadura que expresan la bandera de polihistamina marcada con SMT tres o HF SMT tres y MT con NDC 80 y NDC 10 para detectar la simulación de proteínas cinéticas.

Los tres sustratos HF SMT se purificaron por afinidad utilizando perlas de níquel y se detectaron con un anticuerpo Anti-Flag. Se detectó NDC 80 en los tres sustratos de HF SMT cuando se probó con un anticuerpo antimicrófono. La ausencia de proteínas modificadas en las cepas de control sin HF SMT tres indica la especificidad de la interacción entre HF SMT tres y sus proteínas diana.

Además, la suma de NDC 80 y NDC 10 se reduce en las células tratadas con NOCO desole para detectar la ubiquitinación de NDC 80 y NDC 10. El análisis de Western blot se realizó con anticuerpos anti MIC y anti ubiquitina, el análisis del extracto de células enteras y el sobrenadante confirmaron la expresión de NDC 80 M y NDC 10 M, las muestras inmunoprecipitadas sondeadas con anti MIC mostraron múltiples bandas de alto peso molecular, lo que sugiere que NDC 80 y NDC 10 contienen modificaciones postraduccionales. Un patrón de escalonamiento de muestras inmunoprecipitadas sondeadas con anti ubiquitina mostró que ND C 80 y ND C 10 son ubiquitinadas.

Los patrones de escalonamiento de NDC 80 y NDC 10 se mejoraron con el tratamiento con un inhibidor del proteasoma MG 1 32. Confirmando aún más que estos representan poliubiquitinación Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la técnica de purificación de proteínas que permite la detección de mación y la vacunación de NN de murciélago.