Name: Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a detectar sumoilación y ubiquitinación de proteínas Ndc10 y Ndc80 en Saccharomyces cerevisiae mediante purificación proteica y análisis de western blot. Este método permite estudiar modificaciones postraduccionales en cinetocoros.

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Agradecemos al Dr. Oliver Kerscher por su apoyo y consejos y a los miembros del laboratorio Basrai por su apoyo y comentarios sobre el artículo. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Crecimiento de células de levadura <ol><li> Inocular células de levadura en 30 ml de YPD (Tabla 1) en un matraz pequeño. Incubar a 30 ° C durante la noche con agitación. </li><li> Diluir las células a una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0,2) en 50 ml de YPD y se incuba a 30 ° C con agitación. </li><li> Mantener el cultivo a una densidad óptica de 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1,0). </li><li> Centrifugar las células durante 5 minutos a 2.000 xg y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 40 ml de agua estéril y centrifugar durante 5 min a 2000 xg para lavar las células. Descartar el sobrenadante y el sedimento celular almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Extracción de Proteínas <ol><li> Resuspender las células en 0,5 ml de tampón enfriado con hielo de guanidina (Tabla 1) para el ensayo de pull-down usando perlas Superflow Ni-NTA o tampón A (Tabla 1) para la inmunoprecipitación. Mantenga los tubos en hielo en todo momento. </li><li> Transferencia a 2 ml tubo de tapón de rosca. </li><li> Añadir el mismo volumen de cuentas de vidrio (Tabla de Materiales). </li><li> Bolas de batir las células en un mini batidor grano (Tabla de Materiales) durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego se coloca en hielo durante 2-3 minutos. Repita esto tres veces. </li><li> Vortex a velocidad alta a 4 ° C durante 30-60 minutos. Compruebe las células mediante visualización bajo el microscopio para asegurar que las células se lisan. Nota: Las células lisadas aparecerán fantasmas oscuros y carecen de un límite o forma definida. De manera óptima al menos 80% de las células debe ser lisadas. </li><li> Perforar un agujero en la parte inferior del tubo utilizando un alfiler y el lugar en una colección de 15 ml tubo cónico (tapón de rosca debe ser suelta). </li><li> Centrifugar a 1000 xg durante 1 min para recoger el lisado. </li><li> Transferir el lisado a un tubo de micro centrífuga. </li><li> Centrifugar a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para recoger las proteínas extraídas. </li><li> Medir la concentración de las proteínas extraídas mediante el assa proteínay kit (Tabla de Materiales) y normalizar todos los extractos para contener la misma cantidad de proteína. Llevar el volumen total a 1 ml con tampón apropiado. Nota: Alrededor de 5 mg de proteína total se obtiene de 50 OD 600 células. </li><li> Ahorre 50 l (g de proteína 250 si la proteína total extraído de paso 2,10 es 5 mg) en forma de extracto de células enteras (EBB). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x (Tabla 1) y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot). </li></ol> 3. Purificación de HF-Smt3 conjugados <ol><li> Obtener las perlas Superflow Ni-NTA (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (100 l de granos por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg) durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lave las perlas de 5x con 1 ml de PBS (Tabla de Materiales): Invertir top-sobre-inferior hasta que se vuelven a suspender las cuentas, recoger perlas por centrifugación a baja velocidad, y retire el sobrenadante. </li><li> Suspender perlas en 1 ml de tampón de guanidina (Tabla 1) y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger los granos mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. Mezclar los granos bien invirtiendo arriba sobre la parte inferior. Nota: Mezclar los granos bien invirtiendo bottom top-over. </li><li> Para cada muestra, añadir 950 l de la WCE restante (del Paso 2.11: Extracción de proteínas) a 100 l de perlas de Ni-NTA Superflow. </li><li> Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante al menos 4 horas o durante la noche. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: anal Western blotanalysis). </li><li> Perlas Lavar una vez con 1 ml de tampón de guanidina para 5-10 minutos sobre una plataforma oscilante. </li><li> Lavar las perlas de 5x con 1 ml de tampón de ruptura (Tabla 1) durante 5-10 minutos en una plataforma oscilante. </li><li> Perlas de resuspender en 90 l de tampón de muestra Laemmli 2x. </li><li> Añadir 10 l de 1 M imidazol. Nota: imidazol ayuda a disociar la proteína marcada con His de las perlas de Ni-NTA debido a la interacción que compiten entre imidazol y las perlas. </li><li> Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot). Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE. </li></ol> 4. La inmunoprecipitación de etiquetado-Myc proteínas cinetocoro <ol><li> Obtener-c-Myc contra afinidad de agarosa un geltibody (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (25 l de resina por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg). Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. </li><li> Suspender resina en 1 ml de tampón A y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger resina mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. Nota: Mezclar la resina bien invirtiendo top-sobre-fondo. </li><li> Añadir 950 l de la EBB restante (del Paso 2.11: La extracción de proteínas) a 25 l de resina. </li><li> Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante la noche. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Load 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot). </li><li> Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender la resina en 100 l de tampón de muestra SUMEB (Tabla 1). Nota: tampón de muestra SUMEB contiene urea 8 M y SDS al 1% (fuerte condición de desnaturalización). </li><li> Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot). Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE. </li></ol> 5. Western Blot Analysis <ol><li> Cargue los extractos de proteínas de 4-12% Bis-Tris geles (Tabla de Materiales) y perfelectroforesis orm a 120 V durante 90 min (Ejecución de búfer: Tabla de Materiales). </li><li> Transferencia de las proteínas a partir de gel a una membrana de nitrocelulosa (Tabla de Materiales) usando un aparato de transferencia a 30 V durante 90 minutos (tampón de transferencia: Tabla de Materiales). </li><li> Bloquear la membrana en 5% leche / TBST 1x (Tabla 1) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante la noche a 4 ° C. Para los anticuerpos primarios, utilizar una dilución de 1: 1000 (anticuerpos anti-Flag y anti-UB) o 1: 5000 (anticuerpo anti-Myc). </li><li> Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice una dilución 1: 5000 de anticuerpos secundarios. </li><li> Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST. </li><li> Incubar la membrana con ECL workisolución ng (Tabla de Materiales) durante 5 min. </li><li> Exponer la membrana sensible al azul película de rayos X (Tabla de Materiales) y desarrollar el uso de un programador automático (Tabla de Materiales). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
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<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
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<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Etiquetas de epítopo tales como HA, Myc, Flag, GST y son ampliamente utilizados para el análisis bioquímico de las proteínas. Construcción de cepas con HF-Smt3 y kinetochore proteínas etiquetadas-Myc, tales como Ndc10 y Ndc80, facilita la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. HF-Smt3 desplegable ensayo permite la detección de proteínas cinetocoro sumoylated, Ndc10 y Ndc80 (Figura 1). El protocolo de purificación por afinidad y análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-...

La ubiquitinación y la sumoilación permiten la conjugación de la ubiquitina y el modificador Pequeño ubiquitina-like (SUMO; Smt3 en S. cerevisiae 1) a una proteína diana, respectivamente. PTMs de proteínas kinetochore afectan a sus niveles celulares y las interacciones proteína-proteína durante las diferentes fases del ciclo celular para asegurar la segregación cromosómica fiel. Por ejemplo, los niveles celulares de Cse4 / CENP-A y proteínas cinetocoro externo DSN1 están regulados por la proteólisis mediada por ubiquitina de asegurar la estabilidad del genoma 2-5. La desestabilización de accesorios-cinetocoro microtúbulos incorrectas requiere la quinasa B Ipl1 / Aurora, que fosforila Dam1 y Ndc80 complejos que interactúan directamente con los microtúbulos 6-8. A pesar de la identificación de más de setenta proteínas cinetocoro, hay muy pocos estudios que investiguen las modificaciones de estas proteínas con PTM, por ejemplo, ubiquitina y SUMO. Una limitación importante es la capacidad de preservar la PTMs durante la purificación y la escasez de anticuerpos personalizados para la detección de PTM tales como sumoylation, fosforilación, metilación, y otros. Caracterización de proteínas cinetocoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1 y Ndc80 utiliza un anticuerpo encargo 9. Además, Ndc10 ha sido implicado como un sustrato para la ubiquitinación 10. Hec1 Humano (Ndc80 en S. cerevisiae) también está sustrato para la ubiquitinación, regulado por APC / C-hCdh1 E3 ligasa 11. Por lo tanto, Ndc10 y Ndc80 son buenos candidatos para la optimización del protocolo para detectar tanto sumoylation y ubiquitinación en S. cerevisiae. Para facilitar la identificación de sumoylation, construimos cepas que expresan HF-Smt3 y etiquetada-Myc Ndc10 o Ndc80. El uso de etiquetas de epítopo (HF: His6-Flag) minimiza el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa frecuentemente en el suero policlonal generado contra una proteína candidato. Hemos elaborado un protocolo de afinidadpurificar conjugados de HF-Smt3 y luego se usa anticuerpos anti-myc anti-Flag y comercial para detectar la presencia de sumolyated Ndc10 y Ndc80 en la preparación Smt3 purificado. Para ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación modificada que conserva la ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro Myc-etiquetados y realizó el análisis de Western blot con el anticuerpo anti-Ub comercial para detectar la ubiquitinación de Ndc10 y Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0,5 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Mini batidor de cuentas</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 disruptor de células</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc gel de afinidad con agarosa cuerpo de hormiga producido en conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-Flag M2 producido en ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>anticuerpo c-Myc (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo de ratón purificado monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>Ubiquitina (P4G7) anticuerpo monoclonal</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Anticuerpo primario, dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL IgG de conejo, entero ligado a HRP Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Anticuerpo secundario, dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>ECL IgG de ratón, ligada a HRP Ab GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Anticuerpo secundario, dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>DC ensayo de proteínas</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm Tamaño de poro</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Geles de Proteína</td><td>Novex</td><td></td><td>NP0321BOX 1,0 mm, 10 pocillos</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Tampón de funcionamiento</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Tampón de transferencia</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X sensible al azul</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Revelador automático</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

proteína técnica de purificación que permite la detección de sumoylation y ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro proteínas ndc10 y ndc80

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, y sumoylation, regulan la función celular de muchas proteínas. PTM de proteínas cinetocoro que se asocian con el ADN centromérico median segregación cromosómica fieles a mantener la estabilidad del genoma. Enfoques bioquímicos como la espectrometría de masas y análisis de transferencia Western son los más utilizados para la identificación de los PTM. Aquí, un método de purificación de proteínas se describe que permite la detección de tanto sumoylation y ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en Saccharomyces cerevisiae. Una cepa que expresa etiquetados-polihistidina-Bandera Smt3 (HF-Smt3) y Myc-etiquetados Ndc10 o Ndc80 fue construido y utilizado para nuestros estudios. Para la detección de sumoylation, ideamos un protocolo para purificar por afinidad proteínas sumoylated etiquetados-Su usando perlas de níquel y utilizamos Western blot con anti-Myc anticuerpos para detectar sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Para la detección de ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación de proteínas Myc-etiquetados y utilizamos Western blot con el anticuerpo anti-Ub para demostrar que Ndc10 y Ndc80 se ubiquitinated. Nuestros resultados muestran que el epítopo de etiquetado proteína de interés en el Su-Bandera etiquetado cepa Smt3 facilita la detección de múltiples PTM. Los estudios futuros deben permitir la explotación de esta técnica para identificar y caracterizar las interacciones de proteínas que son dependientes de un PTM específico.

Para detectar sumoylation de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10, cepas con HF-Smt3 y proteínas cinetocoro etiquetados-Myc (Ndc80 o Ndc10) fueron construidos (Tabla 2), como se describió anteriormente 9,12. Conjugados HF-Smt3 fueron purificados por afinidad utilizando perlas de Ni-NTA. Western blot de purificado HF-Smt3 con un permitido la detección de anticuerpos anti-Bandera de formas sumoylated de sustratos SUMO que en la cepa control sin HF-Smt3 (Figura 1A y 1B,</s...

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar la sumoilación y la ubiquitinación de las proteínas del núcleo cinético de levadura en brotación, NDC 10 y NDC 80. Esto se logra primero recolectando células de levadura que expresan SMT tres marcado con hiss flag y NDC 10 o NDC 80 marcado con MT, y obteniendo extractos proteicos a partir de estas células. El segundo paso consiste en purificar los conjugados de SMT tres marcados con hiss flag para la detección de sumoilación o en inmunoprecipitar las proteínas del núcleo cinético marcadas con mik tag para la detección de ubiquitinación.Posteriormente, la sumoilación o ubiquitinación se detecta mediante análisis de blot de Western. En última instancia, la presencia de un patrón escalonado para NDC10 y NDC80 confirma que estas proteínas están sumoiladas y ubiquitinadas. El método de purificación de proteínas descrito permite la detección tanto de la sumoilación como de la ubiquitinación de las proteínas cinétocóricas NDC10 y NDC80 en la levadura en brotación saccharomyces cerevisiae.Mi cci. La principal ventaja de esta técnica es que la cepa que hemos creado posee dos marcadores epitópicos, uno en la proteína de prueba y otro que permite la detección de la simulación. El uso de estos marcadores reduce el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa frecuentemente cuando se utilizan sueros policlonales.La demostración de este procedimiento será realizada por Canero Uni, un investigador asociado en mi laboratorio. Las proteínas de interés se extraerán de pellets de células de levadura preparados previamente y almacenados a menos 20 grados Celsius. Resus, suspenda las células en 0,5 mililitros de tampón frío con hielo.Utilice tampón guine si el extracto es para un ensayo de precipitación con captura usando bolas de nitrilo de níquel, ácido triacético o bolas superflow de NTA de níquel. Utilice tampón A si el extracto es para inmunoprecipitación. Mantenga los tubos sobre hielo en todo momento.Transfiera las suspensiones celulares a dos mililitros. Enrosque las tapas a cada tubo. Añada un volumen de perlas de vidrio igual al volumen de la suspensión celular.Bata las células en un homogeneizador de bolas pequeño durante dos minutos a temperatura ambiente y luego coloque los tubos en hielo durante dos o tres minutos. Repita el batido con bolas y el enfriamiento con hielo tres veces. Vortexee a alta velocidad a cuatro grados Celsius durante 30 a 60 minutos.Revise las células mediante visualización al microscopio para asegurarse de que las células estén lisadas. Las células lisadas aparecerán como sombras oscuras y carecerán de límite o forma definida. Como mínimo, de forma óptima, al menos el 80 % de las células deben estar lisadas.A continuación, utilice un alfiler para perforar un orificio en la parte inferior del tubo. Coloque la tapa roscada ligeramente apretada y coloque el tubo dentro de un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue a 1000 veces G durante un minuto.Para recoger el lisado, transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 15.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para recoger las proteínas extraídas. Después de medir la concentración de las proteínas extraídas utilizando un kit de ensayo de proteínas, normalice todos los extractos para que cada uno contenga la misma cantidad de proteína. Ajuste el volumen total a un mililitro con el tampón adecuado.Se obtienen aproximadamente cinco miligramos de proteína total a partir de 50 OD 600 de células. Guarde 50 microlitros de la proteína extraída como extracto de células completas. Los 950 microlitros restantes del extracto proteico se utilizarán posteriormente para la purificación de proteínas o la inmunoprecipitación de proteínas marcadas con MT.Añada 50 microlitros de tampón de muestra 2x a 50 microlitros de extracto de células completas. Incube las muestras a 100 grados Celsius en un bloque térmico durante tres a cinco minutos antes de analizarlas mediante blotting western. Comience este procedimiento preparando las perlas de níquel NTA superflow necesarias para la purificación.Obtenga la cantidad de perlas necesaria mediante centrifugación a baja velocidad durante un minuto. Retire el sobrenadante y lave las perlas con PBS. Añada un mililitro de PBS e invierta el tubo de arriba abajo hasta que las perlas se resuspendan.Recoger las perlas mediante centrifugación a baja velocidad y eliminar el sobrenadante. Lavar las perlas de esta manera un total de cinco veces. Suspender las perlas en un mililitro de tampón guine y distribuirlas en alícuotas en el número de tubos correspondiente a las muestras que se van a procesar.Recolecte las perlas mediante centrifugación a baja velocidad y elimine el sobrenadante de cada muestra. Añada 950 microlitros del extracto de células completas preparado anteriormente a 100 microlitros de las perlas.Incubar en una plataforma oscilante a cuatro grados Celsius durante al menos cuatro horas o durante la noche. Centrifugar a 800-1500 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Guardar 50 microlitros del sobrenadante.Añada 50 microlitros de tampón de muestra 2x a este sobrenadante e incube a 100 grados Celsius en un bloque térmico durante tres a cinco minutos. Posteriormente, se analizarán 10 microlitros de cada muestra mediante blot de Western. Lave las perlas de níquel NTA Superflow una vez con un mililitro de tampón guanina durante cinco a 10 minutos en una plataforma oscilante a temperatura ambiente.A continuación, lave las perlas cinco veces con un mililitro de tampón de ruptura; después del lavado final con tampón de ruptura, re suspenda las perlas en 90 microlitros de tampón muestral 2x Laemmli. Añada 10 microlitros de iodo de un molar para ayudar a disociar la proteína con etiqueta His de las perlas de níquel NT.A. Incube a 100 grados Celsius en un bloque térmico durante tres a cinco minutos. Vortexee y luego centrifugue a 13.000 × g durante 30 segundos.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Para comenzar este procedimiento, obtenga la cantidad necesaria de anticuerpo de afinidad anti cmic aero gel mediante centrifugación a baja velocidad. Retire el sobrenadante, lave la resina con tampón A. Añada un mililitro de tampón A e invierta el tubo de arriba abajo hasta que la resina se resuspenda.Recoger la resina mediante centrifugación a baja velocidad y eliminar el sobrenadante. Lavar un total de cinco veces. Suspender la resina en un mililitro de tampón A y distribuir en alícuotas en el número de tubos correspondiente a las muestras que se van a procesar.Recoger la resina mediante centrifugación a baja velocidad y eliminar el sobrenadante. Añadir 950 microlitros de extracto de células completas a 25 microlitros de resina. Incubar en una plataforma oscilante a cuatro grados Celsius durante la noche y al día siguiente. Centrifugar a 800-1500 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius.Guarde 50 microlitros del sobrenadante. Añada 50 microlitros de tampón de muestra 2x lam al sobrenadante e incube a 100 grados Celsius en un bloque térmico durante tres a cinco minutos. Lave la resina con tampón a, añada un mililitro de tampón a, e invierta el tubo de arriba abajo hasta que la resina se resuspenda.Recoger la resina mediante centrifugación a baja velocidad y eliminar el sobrenadante tras retirar el sobrenadante del lavado final. Suspender nuevamente la resina en 100 microlitros de tampón muestral sume, incubar a 100 grados Celsius en un bloque térmico durante tres a cinco minutos. Agitar mediante vortex y luego centrifugar a 13.000 ×g durante 30 segundos.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Por último, cargue todas las muestras recolectadas en este protocolo. En un gel SDS-PAGE para análisis por inmunotransferencia, se utilizaron cepas de levadura que expresan SMT tres o HF SMT tres con marcaje de polihistidina y NDC 80 y NDC 10 con marcaje MT para detectar la simulación de proteínas cinetocóricas.Los tres sustratos de HF SMT se purificaron por afinidad utilizando perlas de níquel y se detectaron con un anticuerpo anti-Flag. Se detectó NDC 80 sumoilado en los tres sustratos de HF SMT cuando se analizaron con un anticuerpo anti-mic. La ausencia de proteínas modificadas en las cepas control sin HF SMT tres indica la especificidad de la interacción entre HF SMT tres y sus proteínas diana.Además, la suma de NDC 80 y NDC 10 se reduce en células tratadas con NOCO desole para detectar la ubiquitinación de NDC 80 y NDC 10. Se inmunoprecipitó ND C 80 o ND C 10 marcado con Mick y se realizó un análisis por inmunotransferencia con anticuerpos anti mic y anti ubiquitina. El análisis del extracto total de células y del sobrenadante confirmó la expresión de NDC 80 M y NDC 10 M. Las muestras inmunoprecipitadas analizadas con anti MIC mostraron múltiples bandas de alto peso molecular, lo que sugiere que NDC 80 y NDC 10 contienen modificaciones postraduccionales. Un patrón escalonado en las muestras inmunoprecipitadas analizadas con anti ubiquitina mostró que ND C 80 y ND C 10 están ubiquitinadas.Los patrones escalonados de NDC 80 y NDC 10 se vieron potenciados por el tratamiento con un inhibidor del proteasoma, MG 132. Esto confirma además que estos representan poliubiquitinación. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de la técnica de purificación de proteínas que permite la detección de la mación y la vacunación del NN del murciélago.

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Investigación

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Biología

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

La contaminación de las preparaciones de los ribosomas eucarióticos purificado por los métodos tradicionales de purificación de nucleasas y proteasas co-incide negativamente en posteriores análisis bioquímicos y estructurales. Un método de cromatografía de purificación rápida y sencilla se utiliza para resolver este problema con los ribosomas levadura como un sistema modelo.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

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Extracción basada en inmunoafinidad de péptidos ubiquitinilados: una técnica para extraer selectivamente péptidos marcados con ubiquitina a partir de fracciones de péptidos purificados

Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.

Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Aprende a detectar sumoilación y ubiquitinación de proteínas Ndc10 y Ndc80 en Saccharomyces cerevisiae mediante purificación proteica y análisis de western blot. Este método permite estudiar modificaciones postraduccionales en cinetocoros.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80 (Video) | JoVE Journal

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

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