Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

El objetivo de este procedimiento es diseñar una generación de tejidos tridimensionales idénticos que están incrustados en un gel de colágeno para su uso en muchos contextos experimentales, como la determinación de la influencia del estrés mecánico en la morfogénesis de la ramificación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la morfogénesis de los tejidos, como la determinación de los mecanismos subyacentes del comportamiento de las células colectivas. La principal ventaja de esta técnica es que la geometría de los tejidos modificados es controlada y reproducible, lo que permite una manipulación y medición precisas de factores físicos y bioquímicos.

Por lo tanto, el tamaño de la muestra es lo suficientemente grande como para que las conclusiones puedan formularse con una alta confianza estadística. Comience por preparar un fotopatrón maestro de silicio con la matriz deseada utilizando técnicas de fotolitografía estándar. El patrón utilizado en este video consiste en estructuras rectangulares espaciadas a 200 micras de distancia.

A continuación, mezcle 50 gramos de PDMS combinando el prepolímero y un agente de curado en un plato desechable en una proporción de 10:1. Luego, coloque la mezcla al vacío durante 15 a 30 minutos para eliminar las burbujas de aire que se introdujeron durante el proceso de mezcla. Coloque el lado texturizado maestro de silicona hacia arriba en el bote de pesaje de plástico y vierta la solución de PDMS desgasificada encima del molde.

Luego, coloque el plato en un horno y cure el PDMS a 60 grados centígrados durante 12 horas. Una vez curado, retire el PDMS y el maestro del recipiente de plástico. Separe con cuidado el PDMS de la oblea de silicona.

A continuación, utiliza una cuchilla de afeitar limpia para eliminar cualquier exceso de PDMS alrededor de las características impresas. Ahora, use una cuchilla de afeitar para cortar el PDMS estampado en sellos rectangulares individuales. Guarde estos sellos con la característica hacia arriba en una placa de Petri limpia de 100 milímetros de diámetro.

A continuación, prepare un nuevo lote de solución de PDMS desgasificada utilizando la misma proporción de 10:1 de prepolímero a agente de curado. Gire la capa de dos a tres gramos de esta solución en una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro y luego cure el PDMS durante 12 horas a 60 grados Celsius. Luego, use una cuchilla de afeitar para cortar la capa delgada de PDMS en rectángulos que se usarán como soportes para los sellos.

Se necesitan dos soportes para cada sello. Una vez cortados todos los soportes, esterilizar los sellos y soportes PDMS sumergiéndolos en etanol al 70% y secarlos con un aspirador en una cabina de bioseguridad. En un gabinete de bioseguridad, agregue 50 microlitros de 1%BSA en PBS en la parte superior de cada sello.

Coloque los sellos cubiertos de gotas a cuatro grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas para asegurarse de que el BSA se absorba en la superficie del sello. Luego, devuelva los sellos al gabinete de bioseguridad y aspire la solución BSA de los sellos PDMS. A continuación, lave las superficies de los sellos dos veces con 50 microlitros de medio de cultivo celular.

Aspire el medio después de cada lavado. Coloque una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros de diámetro para cada sello PDMS. En cada plato, coloque dos soportes de PDMS separados por una distancia ligeramente menor que la longitud de los sellos de PDMS.

Luego, use un par de pinzas para recoger hojas de cubierta de vidrio de 15 milímetros de diámetro y esterilizarlas con etanol al 70%. Aspire el exceso de líquido de los cubreobjetos mientras los sujeta con las pinzas y luego guárdelos en una placa de Petri separada. A continuación, dispense 50 microlitros de una mezcla de colágeno de cuatro miligramos por mililitro directamente sobre cada sello para cubrir uniformemente la superficie de los sellos PDMS.

Con las pinzas, recoja cada uno de los sellos de PDMS recubiertos de colágeno e inviértalos suavemente. Baje los sellos invertidos con el lado del colágeno hacia abajo sobre los soportes de PDMS en las placas de cultivo de tejidos. Luego, incuba los platos a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, dispense 50 microlitros de la mezcla de colágeno restante en cada uno de los cubreobjetos circulares y cobrínvelos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. En este punto, cosecha el tipo de célula que te interesa. Aquí, tenemos células epiteliales de mammora de ratón EpH4 que suspendimos a una concentración de entre uno y 10 millones de células por mililitro.

Ahora, retira las muestras de colágeno gelificado de la incubadora. Con las pinzas, levante suavemente los sellos de PDMS hacia arriba para separarlos del colágeno moldeado y deséchelos. Es importante levantar el sello hacia arriba para no distorsionar las características del gel de colágeno.

Dispensar 30 microlitros de la suspensión celular concentrada sobre la superficie de cada gel de colágeno que contenga cavidades moldeadas de la geometría deseada. Observe las células bajo un microscopio de campo claro mientras agita suavemente los platos de lado a lado para promover el asentamiento celular dentro de las cavidades. Las cavidades deben llenarse en cinco minutos.

Para eliminar el exceso de células alrededor de las cavidades, incline cada placa de cultivo de tejidos de lado y dispense suavemente 400 microlitros de medio de cultivo celular sobre la superficie del gel de colágeno. Es importante lavar suavemente dispensando lentamente el medio de cultivo sobre el gel mientras se inclina el plato para que se elimine el exceso de células en la superficie del gel y no se desplacen las células en las cavidades del gel. Aspira el líquido y repite el lavado dos veces más.

Revise los geles de colágeno bajo el microscopio entre cada lavado para observar cuándo se ha enjuagado el exceso de células. Una vez que se haya eliminado el exceso de células alrededor de las cavidades llenas de células, coloque las placas de cultivo de tejidos en una incubadora a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, con las pinzas, invierta suavemente los cubreobjetos de vidrio recubiertos de colágeno y colóquelos encima de los moldes de colágeno rellenos de células para que el colágeno del cubreobjetos forme una tapa sobre las cavidades llenas de células.

Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez que las tapas de colágeno se hayan adherido a los moldes de colágeno rellenos de células, dispense de dos a 2 1/2 mililitros de medio de cultivo celular lentamente sobre la cubierta de vidrio sobre los geles y cultive las muestras a 37 grados centígrados durante uno a tres días. Estas imágenes son de vistas de aumento bajo y alto de las matrices moldeadas en un gel de colágeno tipo I antes de la siembra de células.

La forma de los pozos está determinada por la forma de las características del maestro de silicio. Aquí, los pozos rectangulares se han llenado con células epiteliales de mammora. En este ejemplo, cada pocillo rectangular de 200 por 50 micras contiene aproximadamente de 80 a 100 células.

24 horas después de la siembra de la célula, se observó que las células se adherían unas a otras dentro de los pocillos para formar un tejido. 24 horas después de la adición de un factor de crecimiento HGF al medio de cultivo, los tejidos se ven en morfogénesis ramificada. Una de las proteínas implicadas en la migración celular es la quinasa de adhesión focal, que, como se puede ver en esta imagen compuesta, aumenta en los extremos de los pocillos donde normalmente se produce la ramificación.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de fuerza de tracción, la RT-PCR en tiempo real y el Western Blot, para determinar las fuerzas ejercidas por las células a medida que migran y los cambios en los niveles de transcripción y proteínas de los genes de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar este modelo de cultivo celular en 3D en el que los tejidos de geometría inicial definida están incrustados dentro de un gel de colágeno.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.