Detección de interacciones proteína-proteína basada en anisotropía de fluorescencia

Para la detección de la interacción proteína-proteína basada en anisotropía de fluorescencia, comience con proteínas diana recombinantes marcadas con motivos de tetracisteína C-terminal en un tampón de anisotropía adecuado.

Agregue un colorante que contenga fluoróforo, que se une a las proteínas diana a través del motivo de tetracisteína. Dializar con el tampón de anisotropía, eliminando el colorante no unido. Transfiera la mezcla a cubetas de cuarzo. Mida la absorbancia, determinando el porcentaje de proteínas diana marcadas con éxito.

En una cubeta de fluorescencia, mezcle las proteínas diana marcadas con fluoróforo con proteínas no marcadas. Con un espectrofluorómetro, mida la anisotropía de fluorescencia.

A medida que las proteínas diana se suspenden libremente en el tampón, los fluoróforos unidos a ellas giran aleatoriamente alrededor de sus ejes debido al movimiento browniano. Tras la excitación con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda adecuada, los fluoróforos emiten luz polarizada en los planos vertical y horizontal. Se mide la relación entre las intensidades de fluorescencia de las emisiones polarizadas vertical y horizontalmente (anisotropía).

Cuando las proteínas no marcadas se unen a los objetivos marcados con fluoróforos, el tamaño molecular del complejo proteico aumenta, reduciendo su movimiento de rotación. Como resultado, la luz emitida se vuelve más polarizada, con una mayor emisión en el plano vertical que en el horizontal, lo que aumenta la anisotropía.

Agregue concentraciones crecientes de la proteína no etiquetada y repita la medición de anisotropía.

Un aumento no lineal de la anisotropía con un aumento de la adición de proteínas no marcadas indica una unión de proteínas no marcadas en múltiples sitios de unión no idénticos en las proteínas diana marcadas con fluoróforos.

Mezcle 3 nanomoles de la proteína SBDS-FlAsH con 3 nanomoles del colorante Lumio Green en un volumen de 5 microlitros de tampón de anisotropía. Deje que la reacción continúe durante 8 horas a 4 grados centígrados. Después de 8 horas, dialice la muestra contra el tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre. Mida la absorbancia a 280 nanómetros y 508 nanómetros en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo. Luego, use la ley de Lambert-Beer para cuantificar el porcentaje de proteína etiquetada como se describe en el protocolo de texto.

Antes de medir el valor de anisotropía, cada paso de valoración del ligando proteínico debe realizarse con cuidado, asegurando que toda la muestra se dispense en la solución y se vuelva homogénea.

En una cubeta de fluorescencia, coloque 200 microlitros de SBDS-FlAsH 30 nanomolares en tampón de anisotropía y valore 2 microlitros de EFL1 de 30 micromolares. Mezcle bien y deje reposar la reacción durante 3 minutos antes de medir el valor de anisotropía y fluorescencia. Repita este proceso hasta que se haya agregado un volumen total de 40 microlitros de EFL1. Como paso final, ajuste los datos a un modelo de enlace presunto, como se describe en el protocolo de texto.