Detección de interacciones proteína-proteína basada en anisotropía de fluorescencia

Para la detección de la interacción proteína-proteína basada en anisotropía de fluorescencia, comience con proteínas diana recombinantes marcadas con motivos de tetracisteína C-terminal en un tampón de anisotropía adecuado.

Agregue un colorante que contenga fluoróforo, que se une a las proteínas diana a través del motivo de tetracisteína. Dializar con el tampón de anisotropía, eliminando el colorante no unido. Transfiera la mezcla a cubetas de cuarzo. Mida la absorbancia, determinando el porcentaje de proteínas diana marcadas con éxito.

En una cubeta de fluorescencia, mezcle las proteínas diana marcadas con fluoróforo con proteínas no marcadas. Con un espectrofluorómetro, mida la anisotropía de fluorescencia.

A medida que las proteínas diana se suspenden libremente en el tampón, los fluoróforos unidos a ellas giran aleatoriamente alrededor de sus ejes debido al movimiento browniano. Tras la excitación con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda adecuada, los fluoróforos emiten luz polarizada en los planos vertical y horizontal. Se mide la relación entre las intensidades de fluorescencia de las emisiones polarizadas vertical y horizontalmente (anisotropía).

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