Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la dinámica de las interacciones proteína-proteína dentro de una célula viva. Esto se logra expresando primero una proteína de interés en E. coli, incorporando el análogo del aminoácido benzoilfenilalanina en la proteína en un lugar específico y realizando un marcado de radio de persecución de pulsos para marcar una pequeña población de moléculas de proteína sintetizadas sincrónicamente. Como segundo paso.

Las alícuotas de las células recolectadas en varios puntos de tiempo durante la persecución se irradian para desencadenar la formación de enlaces covalentes entre la proteína de interés y cualquier factor con el que esté interactuando. Las siguientes proteínas se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos y se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS con el fin de identificar los factores que interactúan, se obtienen resultados que muestran cambios en las interacciones entre la proteína de interés y otros factores intracelulares a lo largo del tiempo a partir de cambios en la movilidad electroforética de los productos reticulantes. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la coinmunoprecipitación o el cross-linking químico, es su capacidad para generar información temporal sobre las interacciones que se producen entre un residuo específico en una proteína de interés y otras moléculas.

Estos datos son especialmente valiosos cuando se estudia la progresión de una proteína a través de una vía de ensamblaje de varios pasos y para identificar intermediarios de ensamblaje. Aunque este método se ha optimizado para su uso en E. coli, también se puede usar en otros sistemas, incluidas otras bacterias, levaduras y células de mamíferos. Los detalles para la preparación del cultivo se pueden encontrar en el protocolo de texto.

Prepare brevemente cinco mililitros de medio M nine que contenga 0.2% de glicerol, todos los aminoácidos excepto la metionina y la cistina, y los antibióticos comiencen los cultivos durante la noche agregando E. coli transformada con un plásmido que codifica para la proteína de interés con una mutación ámbar y el plásmido que codifica para el sistema de supresión ámbar incuba a 37 grados centígrados. El día del experimento, se añadió una cantidad adecuada de células del cultivo nocturno a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenía 50 mililitros de medio M nine y antibióticos para obtener una densidad óptica de 550 nanómetros de 0,03. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados en un baño de agua agitada.

Cuando los cultivos alcancen la fase logarítmica temprana o media, agregue 50 microlitros de un molar de benzoilfenilalanina o BPA a cada cultivo. Agregue BPA una gota a la vez mientras agita el matraz para evitar la precipitación. A continuación, agregue los inductores que sean necesarios para impulsar la expresión del mutante ámbar.

Continúe incubando los cultivos a 37 grados centígrados durante 30 minutos adicionales durante el período de inducción de 30 minutos. Etiquete seis tubos de centrífuga desechables de 15 mililitros con el punto de tiempo y más UV o menos uv. Coloque los tubos etiquetados sobre hielo.

Coloque una placa de cultivo de tejido de seis pocillos encima de una segunda cubeta de hielo llena de hielo. Encienda la lámpara UV cinco minutos antes de etiquetar la radio. A continuación, añada aproximadamente dos mililitros de hielo a cada tubo etiquetado como menos UV y a dos de los pocillos de la placa multipocillo.

Es esencial airear el hielo directamente en los tubos y pocillos para detener las reacciones intracelulares inmediatamente en cada punto de tiempo y, por lo tanto, obtener una instantánea precisa de la vía bioquímica al final del período de inducción de 30 minutos. Transfiera 25 mililitros del cultivo a un matraz erlenmeyer desechable precalentado de 125 mililitros. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 grados centígrados.

Los pasos en el etiquetado de seguimiento de pulsos y la irradiación UV deben realizarse de manera oportuna y requieren una organización considerable y una preparación avanzada. Agregue 30 micro curies por mililitro de metionina y cisteína marcadas con S 35 al cultivo y revuelva rápidamente para mezclar a la vez. Un minuto cero segundos.

Agregue 250 microlitros de una solución no radiactiva de metionina cisteína de 100 milimolares y agite rápidamente. Para mezclar inmediatamente, pipetee cuatro mililitros de cultivo en uno de los pocillos de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo, pipetee una segunda alícuota de cuatro mililitros en el tubo de 15 mililitros etiquetado como cero minutos menos UV a la vez. Dos minutos y cero segundos.

Pipetear cuatro mililitros del cultivo en un segundo pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. A continuación, pipetee otras alícuotas de cuatro mililitros en el tubo de 15 mililitros etiquetado como un minuto menos UV inmediatamente antes del punto de tiempo de cinco minutos en aproximadamente dos mililitros de hielo hasta un tercer pocillo en la placa de pocillos múltiples a veces seis minutos y cero segundos. Pipetear cuatro mililitros del cultivo en el tercer pocillo de la placa multipocillo enfriada que contiene la pipa de hielo.

Tenía otra alícuota de cuatro mililitros en el tubo de 15 mililitros etiquetado como cinco minutos menos uv. Coloque la cubeta de hielo con la placa de pocillos múltiples debajo de la lámpara UV precalentada e irradie cada muestra individualmente durante cuatro minutos. Transfiera las células a los tubos refrigerados de 15 mililitros etiquetados como cero minutos más rayos UV, un minuto más rayos UV y así sucesivamente.

A continuación, centrifugar las células a 2.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender cada muestra en 300 microlitros de medio M nine o PBS y 33 microlitros de ácido tricloroacético 100% frío o TCA para precipitar las proteínas, centrifugar el TCA precipita en un micro fuge a máxima velocidad durante 10 minutos. Antes de retirar el sato, añadir 50 microlitros de tampón de solubilización a cada muestra y calentar agitando a 95 grados centígrados durante cinco minutos para solubilizar la proteína precipitada.

Después de agregar un mililitro de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación, realiza inmunoprecipitaciones estándar utilizando de un quinto a la mitad de cada muestra. Resuelva las proteínas inmunoprecipitadas mediante sulfato de sodio ESAL, electroforesis en gel de poliacrilamida o página SDS. Por último, exponer los geles teñidos y secos a una pantalla de fosfoterapia durante la noche y detectar proteínas radiactivas, incluidos los productos de reticulación con un generador de imágenes de fosfo, se utilizó la reticulación fotográfica específica del sitio para identificar las proteínas que interactúan con la ESPP durante su viaje a la membrana externa.

Para este experimento, los codones de alanina de pH en los residuos 1113 y 1214 del dominio beta ESPP se reemplazaron con codones ámbar. La estructura cristalina del dominio beta ESPP muestra que los dos residuos están ambos en el lado periplásmico del barril beta, separados por aproximadamente 120 grados. Dos polipéptidos diferentes fueron inmunoprecipitados a partir de células irradiadas y de control por el anti ESPP terminal C y el suero.

Inicialmente, una forma precursora de aproximadamente 135 kilodalton de la proteína que contiene dominios pasajeros y beta unidos covalentemente predominó en puntos de tiempo posteriores. El nivel de PRO ESPP disminuyó y el dominio beta libre comenzó a predominar, ya que el dominio pasajero estaba translocalizado a través de la membrana externa y separado del dominio beta por una escisión proteolítica. Sin embargo, las muestras radiadas con UV I tenían claramente bandas de mayor peso molecular que no estaban presentes en las muestras de control.

Estas bandas son el resultado de la reticulación de PRO ESPP a las proteínas que interactúan en función de la movilidad de estos polipéptidos, se estimaron los tamaños de las proteínas que interactúan para probar si podrían corresponder a factores conocidos de ensamblaje de proteínas de membrana externa. Se realizaron inmunoprecipitaciones adicionales utilizando anticera generados contra los supuestos socios interactuantes. Un polipéptido de aproximadamente 150 kilodalton que se observó cuando se incorporó BPA en los residuos 1113 y 1214 pudo ser inmunoprecipitado con un antisuero contra el salto de chaperona periplásmica de 17 kilodalton.

Además, encontramos que los polipéptidos más grandes que se observaron cuando se incorporó BPA en solo una de las dos posiciones podrían ser inmunoprecipitados con anticera contra las subunidades del complejo BAM, BAM B y BAM D respectivamente. Después de realizar este procedimiento, se pueden purificar los productos de reticulación y se pueden realizar otros métodos, incluida la espectrometría de masas, para ayudar a identificar los factores que interactúan con una proteína de interés. Después de ver con video, debe tener una buena comprensión de cómo combinar con éxito el etiquetado de persecución de pulso con la reticulación de fotos específicas del sitio para estudiar la dinámica de interacción de su proteína, de interés con otras moléculas dentro de la célula viva.