Name: Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprende a monitorizar interacciones proteicas dinámicas en vivo mediante reticulación fotoquímica específica del sitio en E. coli. Este método permite capturar interacciones transitorias con resolución temporal durante el ensamblaje de proteínas.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.

1. Construcción de plásmidos
<ol>
	<li>Después de clonar un gen que codifica una proteína de interés en un vector de expresión apropiado, introduzca las mutaciones ámbar en las ubicaciones deseadas utilizando un kit de mutagénesis dirigido al sitio. 
	NOTA: La información estructural y las predicciones de exposición superficial pueden servir como guías útiles para determinar las posiciones de las mutaciones. Debido a que la eficiencia de la supresión del ámbar y la reticulación puede variar considerablemente, las mutaciones del ámbar deben introducirse en múltiples posiciones. Además, debido a que el Bpa es un análogo de la tirosina y la fenilalanina, intente introducir mutaciones en ámbar en posiciones que normalmente codifican aminoácidos hidrofóbicos grandes para minimizar las perturbaciones de la estructura y función de la proteína. Por último, a la hora de elegir un vector de expresión, hay que tener en cuenta que la sobreproducción de una proteína de interés a un nivel muy alto podría limitar la eficiencia de la incorporación de Bpa.</li>
</ol>
2. Preparación de la cultura
<ol>
	<li>Utilice la electroporación para transformar una cepa apropiada de E. coli con un plásmido que codifica el sistema de supresión de ámbar (pDULE-p Bpa; ver referencia4) y un plásmido compatible que codifica la proteína de interés con una mutación ámbar.</li>
	<li>Células en placa en agar LB que contienen antibióticos apropiados (use 5 μg/ml de tetraciclina para seleccionar pDULE-p Bpa). Incubar las placas O/N a 37 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, inicie los cultivos de O/N de colonias individuales en 3-5 ml de medio M914 que contenga 0,2% de glicerol, todos los L-aminoácidos excepto metionina y cisteína (40 μg/ml) y antibióticos. Incubar a 37 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, centrifugar cultivos O/N a 2.500 x g durante 5 min a RT a células de pellets. Vuelva a suspender las células en 5 ml de medio M9 fresco y repita la centrifugación. 
	NOTA: Este paso de lavado es crítico para mantener los plásmidos que codifican resistencia a la ampicilina porque pequeñas cantidades de b lactamasas que están presentes en el medio de los cultivos O/N degradan la ampicilina recién agregada antes de que ocurra un crecimiento celular significativo.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 2 ml de medio fresco y mida la concentración de células en un espectrofotómetro (OD550).</li>
	<li>Añadir células a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de medio M9 y antibióticos a DO550=0,03. Incubar los cultivos a 37 °C en un baño de agua agitado.</li>
</ol>
3. Incorporación de BPA y preparación para la fotocruzación
NOTA: El protocolo descrito a continuación es para un curso de tiempo de muestra que tiene tres puntos de tiempo (0, 1 y 5 min). Ajuste los volúmenes en consecuencia si se desea un número diferente de puntos de tiempo. En la Figura 1 se ilustra un esquema del procedimiento.
<ol>
	<li>Mientras los cultivos crecen, prepare una solución fresca de 1 M (1,000x) de Bpa en 1 M de NaOH (27 mg de Bpa en 100 μl 1 M de NaOH). Use un tubo de pared oscura para mantener la solución en la oscuridad.</li>
	<li>Cuando los cultivos alcancen la fase logarítmica temprana a media (OD550 = 0,2), agregue 50 μl 1 M Bpa a cada cultivo. Agregue Bpa una gota a la vez mientras agita el matraz para evitar precipitaciones. A continuación, agregue los inductores que sean necesarios para impulsar la expresión del mutante ámbar. Continúe incubando los cultivos a 37 °C durante 30 minutos más.</li>
	<li>Durante el período de inducción de 30 minutos, etiquete seis tubos de centrífuga desechables de 15 ml con el punto de tiempo (0 min, 1 min, 5 min) y "+ UV" o "- UV". Coloque los tubos sobre hielo.</li>
	<li>Llene una segunda cubeta de hielo con hielo y coloque una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos encima del hielo.</li>
	<li>Descongele 35S-metionina y 35S-cisteína (o una mezcla prefabricada de los dos compuestos) para el marcaje de pulsos y prepare (o descongele) una solución de L-cisteína no radiactiva y L-metionina (100 mM cada una) para la persecución.</li>
	<li>Encienda la lámpara UV cinco minutos antes del radiomarcaje. 
	NOTA: La lámpara debe ser ajustable para que pueda colocarse a ~3-4 cm de las muestras en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Agregue hielo (~ 2 ml) a cada tubo etiquetado como "- UV" y a dos de los pocillos en la placa de pocillos múltiples. 
	NOTA: Se debe agregar hielo a un tercer pozo inmediatamente antes del punto de tiempo de 5 minutos. Es esencial colocar hielo directamente en los tubos y pocillos para detener las reacciones intracelulares inmediatamente en cada punto de tiempo y obtener así "instantáneas" precisas de una vía bioquímica específica.</li>
	<li>Al final del período de inducción de 30 minutos, transfiera 25 ml del cultivo a un matraz Erlenmeyer desechable precalentado de 125 ml. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.</li>
</ol>
4. Marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV
NOTA: El protocolo de marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV tiene muchos pasos que deben realizarse de manera oportuna y que requieren una organización considerable y una preparación previa. Todos los reactivos y tubos deben ser fácilmente accesibles. A continuación se presenta un protocolo para un experimento que tiene puntos de tiempo de 0, 1 y 5 minutos.
<ol>
	<li>A las 0:00 (min:seg) transfiera 25 ml de cultivo a un matraz de 125 ml.</li>
	<li>En el tiempo 0:30 añadir 30 μCi/ml de aminoácidos radiactivos; agitar rápidamente para mezclar. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.</li>
	<li>A la 1:00 agregue 250 μl de la solución de metionina-cisteína de 100 mM; agite rápidamente para mezclar.
	<ol>
		<li>Pipetear inmediatamente 4 ml del cultivo en uno de los pocillos de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear una segunda alícuota de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "0 min - UV". Regrese el matraz al baño de agua.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A las 2:00 pipetear 4 ml del cultivo en el segundo pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "1 min - UV" y volver a colocar el matraz en el baño de agua.</li>
	<li>A las 6:00 pipetear 4 ml del cultivo en el tercer pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas en el tubo de 15 ml etiquetado como "5 min - UV".</li>
	<li>Coloque la cubitera con la placa multipocillo bajo la lámpara UV precalentada e irradie cada muestra individualmente durante 4 min. 
	NOTA: En experimentos en los que los puntos de tiempo están espaciados por lo menos 4 minutos, cada muestra debe irradiarse tan pronto como se pipetea en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Transfiera las células a los tubos refrigerados de 15 ml etiquetados como "0 min +UV", 1 min +UV", etc.</li>
	<li>Centrifugar las células a 2.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Vuelva a suspender cada muestra en un medio M9 de 300 μl o PBS y agregue 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) frío al 100% para precipitar las proteínas. Centrifugar los precipitados de TCA en un microfugo a máxima velocidad durante 10 min y eliminar el sobrenadante. En este punto, las muestras pueden almacenarse a -20 °C.</li>
</ol>
5. Inmunoprecipitación y detección de productos de reticulación
<ol>
	<li>Añadir 50 μl de tampón de solubilización (15% glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada muestra y calentar agitando a 95 °C durante 5 min para solubilizar la proteína precipitada.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1,0% de Igepal CA-630, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS) y realizar inmunoprecipitaciones estándar15 utilizando de un quinto a la mitad de cada muestra 
	NOTA: Se utiliza Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenglicol) en lugar de NP-40, que ya no está disponible comercialmente. Los dos compuestos son químicamente indistinguibles.</li>
	<li>Resuelva proteínas inmunoprecipitadas por SDS-PAGE. Tinte, decolora y seque geles.</li>
	<li>Exponga los geles a un detector de fósforo O/N y detecte proteínas radiactivas (incluidos los productos de reticulación) con un generador de imágenes de fósforo.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este artículo describe un método que combina la fotoreticulación específica del sitio con el etiquetado de persecución de pulsos para examinar la dinámica de las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes de una célula viva. El método es especialmente útil para estudiar procesos de varios pasos en los que la proteína interactúa secuencialmente con otros factores. A diferencia de los enfoques tradicionales de reticulación química, la fotoreticulación específica del sitio proporciona información detall...

A menudo es esencial identificar y caracterizar las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes celulares para definir su papel en una vía biológica, para comprender su ensamblaje o para dilucidar su mecanismo de acción. Una amplia variedad de enfoques se utilizan comúnmente para estudiar las interacciones proteína-proteína, pero todos tienen sus limitaciones. El método más simple e imparcial para identificar proteínas que se unen a una proteína de interés es la copurificación (o coinmunoprecipitación), pero este enfoque requiere que un complejo proteico permanezca intacto durante el procedimiento de purificación. Las interacciones de proteínas débiles o transitorias se pueden estabilizar a través de la reticulación química, pero este método generalmente requiere el uso de compuestos que unen proteínas a través de aminas primarias que están ampliamente dispersas en la secuencia de proteínas. Se pueden generar patrones de reticulación complicados que son difíciles de interpretar, especialmente cuando las proteínas de interés son componentes de complejos multiproteicos. Además, debido a que los brazos espaciadores de los reticulantes químicos generalmente exceden los 10 Å de longitud, se pueden formar enlaces covalentes con proteínas que se encuentran cerca de la proteína de interés, pero que no interactúan directamente con ella. Métodos como la cromatografía de afinidad y los cribados de dos híbridos también suelen ser útiles para identificar las interacciones proteína-proteína. El primer enfoque, sin embargo, requiere reproducir condiciones que promuevan interacciones fisiológicamente significativas y no se pueden utilizar para detectar interacciones débiles. Este último enfoque requiere que las interacciones de unión puedan replicarse en el organismo huésped y se mantengan cuando una proteína de interés y sus socios de unión se colocan en el contexto de una proteína de fusión. Los métodos de dos híbridos también tienden a generar resultados falsos positivos2. Una vez que se ha establecido una interacción proteína-proteína, a menudo se requiere un trabajo considerable para mapear el sitio de interacción. Quizás el inconveniente más significativo de los enfoques tradicionales es que no proporcionan ninguna información sobre la secuencia temporal de las interacciones intermoleculares o la cinética de la unión.
Este artículo describe un método simple que supera algunas de las limitaciones de otros enfoques que se utilizan para estudiar las interacciones proteína-proteína. Inicialmente, se introduce una única mutación ámbar en el gen que codifica una proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se coexpresa con un ARNt supresor de ámbar y una aminoacil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii que han sido modificadas para incorporar el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) solo en codones ámbar3. La irradiación de las células con luz ultravioleta (UV) de longitud de onda larga (~365 nm) facilita la formación de un enlace covalente entre el Bpa y las proteínas que se encuentran dentro de ~3-8 Å4,5. En algunos contextos experimentales, también se pueden formar enlaces cruzados entre el Bpa activado y los componentes no proteicos de las células, como los lípidos y los ácidos nucleicos6. Las moléculas que terminan en el codón ámbar generalmente deben distinguirse fácilmente de la proteína de longitud completa en SDS-PAGE y no pueden ser reticuladas a otras proteínas. Al someter a las células a un radiomarcaje de persecución de pulsos antes de la reticulación y luego a los productos de reticulación inmunoprecipitantes o purificadores de afinidad, se puede establecer la secuencia y la duración de las interacciones proteína-proteína. La capacidad de generar información temporal sobre las interacciones intermoleculares es especialmente valiosa para estudiar la progresión de una proteína de interés a través de cualquier vía ordenada de ensamblaje, tráfico o señalización de múltiples pasos y para identificar los intermediarios de la vía. Al igual que la reticulación química, la reticulación específica del sitio detecta las interacciones proteína-proteína que se producen en condiciones fisiológicas, pero la introducción de un reticulante en una sola posición facilita el análisis de las interacciones entre segmentos individuales de una proteína y otros factores. Esta característica única de la reticulación específica del sitio es especialmente ventajosa cuando la proteína de interés tiene múltiples segmentos o dominios que tienen el potencial de interactuar con distintos socios de unión. Además, la reticulación específica del sitio se puede utilizar en combinación con métodos como la espectrometría de masas para mapear con precisión los residuos que median las interacciones proteína-proteína. Aunque este método está optimizado para su uso en E. coli, la incorporación de análogos de aminoácidos fotoactivables en proteínas por supresión de ámbar se ha reportado en Mycobacterium, levadura y célulasde mamíferos 7-11. Así, en principio nuestro método puede ser utilizado en otros sistemas.
Hemos utilizado este método ampliamente para identificar interacciones intermoleculares que facilitan la biogénesis de EspP, un factor de virulencia de E. coli O157:H7. EspP es miembro de una superfamilia de proteínas conocidas como "autotransportadores" que contienen un gran dominio extracelular N-terminal ("dominio de pasajeros") y un dominio aC-terminal ("dominio b") que se pliega en una estructura cilíndrica de barril b y ancla la proteína a la membrana externa (OM)12. El mecanismo por el cual el dominio del pasajero se transloca a través del OM ha sido un misterio desde hace mucho tiempo. Al igual que todas las proteínas de la superficie celular bacteriana, la EspP debe transportarse a través de la membrana interna, transportarse a través del periplasma (el espacio entre las membranas interna y externa) y dirigirse a la MO en una serie de eventos ordenados. Después de su translocación a través de la MO, el dominio del pasajero EspP también se separa del dominio b por una escisión proteolítica y se libera de la superficie de la célula. Al combinar la reticulación específica del sitio con el radiomarcaje de persecución de pulsos, hemos demostrado que ambos dominios de la proteína interactúan inicialmente con la chaperona molecular Skp en el periplasma6. Posteriormente, segmentos discretos del dominio b interactúan de manera estereoespecífica con los componentes de un heterooligómero llamado complejo Bam, que cataliza la integración de las proteínas b barrel en la OM bacteriana por un mecanismo desconocido. Quizás lo más interesante es que hemos encontrado que el dominio de pasajeros está en contacto con una de las subunidades del complejo Bam (BamA) a medida que atraviesa el OM13. Nuestros resultados nos han permitido construir un modelo detallado para el ensamblaje del autotransportador14 y han implicado al complejo Bam en el transporte del dominio de pasajeros a través del OM.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, reactivo de marcado metabólico (35S-L-metionina y 35S-L-cisteína, >1,000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P Lámpara UV de súper alta intensidad, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla de repuesto Spectroline 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos Falcon, 6 pocillos</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Desechable 125 ml Matraz Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 baño de agua agitada</td><td>Nuevo Brunswick Scientific</td><td>, n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Este artículo describe un método para detectar y analizar interacciones dinámicas entre una proteína de interés y otros factores in vivo. Nuestro método se basa en la tecnología de supresión de ámbar que fue desarrollada originalmente por Peter Schultz y sus colegas1. Una mutación ámbar se introduce primero en un codón específico del gen que codifica la proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se expresa en E. coli junto con genes que codifican un ARNt supresor de ámbar y una amino acil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii. Con este sistema, el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) se incorpora en el codón ámbar. A continuación, las células se irradian con luz ultravioleta para unir covalentemente el residuo de Bpa a las proteínas que se encuentran dentro de 3-8 Å. La fotoreticulación se realiza en combinación con el marcaje de seguimiento de pulsos y la inmunoprecipitación de la proteína de interés para monitorear los cambios en las interacciones proteína-proteína que ocurren en una escala de tiempo de segundos a minutos. Optimizamos el procedimiento para estudiar el ensamblaje de un factor de virulencia bacteriana que consta de dos dominios independientes, un dominio que está integrado en la membrana externa y un dominio que se transloca al espacio extracelular, pero el método se puede utilizar para estudiar muchos procesos de ensamblaje y vías biológicas diferentes en células procariotas y eucariotas. En principio, los factores que interactúan e incluso los residuos específicos de factores que interactúan que se unen a una proteína de interés pueden identificarse mediante espectrometría de masas.

Utilizamos la fotocruzamiento específico en el sitio para identificar proteínas que interactúan con EspP durante su tránsito hacia la membrana externa (OM). En los experimentos que se muestran aquí, los codones de fenilalanina en los residuos 1113 y 1214 fueron reemplazados por codones ámbar. Ambas posiciones se encuentran en el dominio β, que se integra en la OM y actúa como un anclaje de membrana. La estructura cristalina del dominio EspPβ16 muestra que los dos residuos están en el lado periplásmico del barr...

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la dinámica de las interacciones proteína-proteína dentro de una célula viva. Esto se logra primero expresando una proteína de interés en e coli, incorporando el análogo de aminoácido benzoyl fenil alanina en la proteína en una ubicación específica y realizando un marcado radioactivo por pulso y caza para etiquetar una pequeña población de moléculas de proteína sintetizadas de forma sincrónica. Como segundo paso.Aliquotas de células recolectadas en diferentes momentos durante la carrera se exponen a radiación UV para inducir la formación de enlaces covalentes entre la proteína de interés y cualquier factor con el que esté interactuando. A continuación, las proteínas se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos y se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS con el fin de identificar los factores que interactúan. Los resultados obtenidos muestran cambios en las interacciones entre la proteína de interés y otros factores intracelulares a lo largo del tiempo, basados en las variaciones en la movilidad electroforética de los productos de reticulación. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos exi

monitoring-assembly-secreted-bacterial-virulence-factor-using-site

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Monitoreo de la ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante enlace cruzado específico del sitio

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias...

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

La translocación del efector a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo III es una estrategia de virulencia común entre las bacterias gramnegativas. Se aplicó un ensayo basado en fusión de efectores betalactamasas para el análisis cuantitativo de la translocación. En las células infectadas por Yersinia, la conversión de un indicador FRET por la betalactamasa se controla mediante microscopía de barrido láser.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)...

Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético

Aprende a monitorizar interacciones proteicas dinámicas en vivo mediante reticulación fotoquímica específica del sitio en E. coli. Este método permite capturar interacciones transitorias con resolución temporal durante el ensamblaje de proteínas.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

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