Name: Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprende a monitorizar interacciones proteicas dinámicas en vivo mediante reticulación fotoquímica específica del sitio en E. coli. Este método permite capturar interacciones transitorias con resolución temporal durante el ensamblaje de proteínas.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.

1. Construcción de plásmidos
<ol>
	<li>Después de clonar un gen que codifica una proteína de interés en un vector de expresión apropiado, introduzca las mutaciones ámbar en las ubicaciones deseadas utilizando un kit de mutagénesis dirigido al sitio. 
	NOTA: La información estructural y las predicciones de exposición superficial pueden servir como guías útiles para determinar las posiciones de las mutaciones. Debido a que la eficiencia de la supresión del ámbar y la reticulación puede variar considerablemente, las mutaciones del ámbar deben introducirse en múltiples posiciones. Además, debido a que el Bpa es un análogo de la tirosina y la fenilalanina, intente introducir mutaciones en ámbar en posiciones que normalmente codifican aminoácidos hidrofóbicos grandes para minimizar las perturbaciones de la estructura y función de la proteína. Por último, a la hora de elegir un vector de expresión, hay que tener en cuenta que la sobreproducción de una proteína de interés a un nivel muy alto podría limitar la eficiencia de la incorporación de Bpa.</li>
</ol>
2. Preparación de la cultura
<ol>
	<li>Utilice la electroporación para transformar una cepa apropiada de E. coli con un plásmido que codifica el sistema de supresión de ámbar (pDULE-p Bpa; ver referencia4) y un plásmido compatible que codifica la proteína de interés con una mutación ámbar.</li>
	<li>Células en placa en agar LB que contienen antibióticos apropiados (use 5 μg/ml de tetraciclina para seleccionar pDULE-p Bpa). Incubar las placas O/N a 37 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, inicie los cultivos de O/N de colonias individuales en 3-5 ml de medio M914 que contenga 0,2% de glicerol, todos los L-aminoácidos excepto metionina y cisteína (40 μg/ml) y antibióticos. Incubar a 37 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, centrifugar cultivos O/N a 2.500 x g durante 5 min a RT a células de pellets. Vuelva a suspender las células en 5 ml de medio M9 fresco y repita la centrifugación. 
	NOTA: Este paso de lavado es crítico para mantener los plásmidos que codifican resistencia a la ampicilina porque pequeñas cantidades de b lactamasas que están presentes en el medio de los cultivos O/N degradan la ampicilina recién agregada antes de que ocurra un crecimiento celular significativo.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 2 ml de medio fresco y mida la concentración de células en un espectrofotómetro (OD550).</li>
	<li>Añadir células a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de medio M9 y antibióticos a DO550=0,03. Incubar los cultivos a 37 °C en un baño de agua agitado.</li>
</ol>
3. Incorporación de BPA y preparación para la fotocruzación
NOTA: El protocolo descrito a continuación es para un curso de tiempo de muestra que tiene tres puntos de tiempo (0, 1 y 5 min). Ajuste los volúmenes en consecuencia si se desea un número diferente de puntos de tiempo. En la Figura 1 se ilustra un esquema del procedimiento.
<ol>
	<li>Mientras los cultivos crecen, prepare una solución fresca de 1 M (1,000x) de Bpa en 1 M de NaOH (27 mg de Bpa en 100 μl 1 M de NaOH). Use un tubo de pared oscura para mantener la solución en la oscuridad.</li>
	<li>Cuando los cultivos alcancen la fase logarítmica temprana a media (OD550 = 0,2), agregue 50 μl 1 M Bpa a cada cultivo. Agregue Bpa una gota a la vez mientras agita el matraz para evitar precipitaciones. A continuación, agregue los inductores que sean necesarios para impulsar la expresión del mutante ámbar. Continúe incubando los cultivos a 37 °C durante 30 minutos más.</li>
	<li>Durante el período de inducción de 30 minutos, etiquete seis tubos de centrífuga desechables de 15 ml con el punto de tiempo (0 min, 1 min, 5 min) y "+ UV" o "- UV". Coloque los tubos sobre hielo.</li>
	<li>Llene una segunda cubeta de hielo con hielo y coloque una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos encima del hielo.</li>
	<li>Descongele 35S-metionina y 35S-cisteína (o una mezcla prefabricada de los dos compuestos) para el marcaje de pulsos y prepare (o descongele) una solución de L-cisteína no radiactiva y L-metionina (100 mM cada una) para la persecución.</li>
	<li>Encienda la lámpara UV cinco minutos antes del radiomarcaje. 
	NOTA: La lámpara debe ser ajustable para que pueda colocarse a ~3-4 cm de las muestras en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Agregue hielo (~ 2 ml) a cada tubo etiquetado como "- UV" y a dos de los pocillos en la placa de pocillos múltiples. 
	NOTA: Se debe agregar hielo a un tercer pozo inmediatamente antes del punto de tiempo de 5 minutos. Es esencial colocar hielo directamente en los tubos y pocillos para detener las reacciones intracelulares inmediatamente en cada punto de tiempo y obtener así "instantáneas" precisas de una vía bioquímica específica.</li>
	<li>Al final del período de inducción de 30 minutos, transfiera 25 ml del cultivo a un matraz Erlenmeyer desechable precalentado de 125 ml. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.</li>
</ol>
4. Marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV
NOTA: El protocolo de marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV tiene muchos pasos que deben realizarse de manera oportuna y que requieren una organización considerable y una preparación previa. Todos los reactivos y tubos deben ser fácilmente accesibles. A continuación se presenta un protocolo para un experimento que tiene puntos de tiempo de 0, 1 y 5 minutos.
<ol>
	<li>A las 0:00 (min:seg) transfiera 25 ml de cultivo a un matraz de 125 ml.</li>
	<li>En el tiempo 0:30 añadir 30 μCi/ml de aminoácidos radiactivos; agitar rápidamente para mezclar. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.</li>
	<li>A la 1:00 agregue 250 μl de la solución de metionina-cisteína de 100 mM; agite rápidamente para mezclar.
	<ol>
		<li>Pipetear inmediatamente 4 ml del cultivo en uno de los pocillos de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear una segunda alícuota de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "0 min - UV". Regrese el matraz al baño de agua.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A las 2:00 pipetear 4 ml del cultivo en el segundo pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "1 min - UV" y volver a colocar el matraz en el baño de agua.</li>
	<li>A las 6:00 pipetear 4 ml del cultivo en el tercer pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas en el tubo de 15 ml etiquetado como "5 min - UV".</li>
	<li>Coloque la cubitera con la placa multipocillo bajo la lámpara UV precalentada e irradie cada muestra individualmente durante 4 min. 
	NOTA: En experimentos en los que los puntos de tiempo están espaciados por lo menos 4 minutos, cada muestra debe irradiarse tan pronto como se pipetea en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Transfiera las células a los tubos refrigerados de 15 ml etiquetados como "0 min +UV", 1 min +UV", etc.</li>
	<li>Centrifugar las células a 2.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Vuelva a suspender cada muestra en un medio M9 de 300 μl o PBS y agregue 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) frío al 100% para precipitar las proteínas. Centrifugar los precipitados de TCA en un microfugo a máxima velocidad durante 10 min y eliminar el sobrenadante. En este punto, las muestras pueden almacenarse a -20 °C.</li>
</ol>
5. Inmunoprecipitación y detección de productos de reticulación
<ol>
	<li>Añadir 50 μl de tampón de solubilización (15% glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada muestra y calentar agitando a 95 °C durante 5 min para solubilizar la proteína precipitada.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1,0% de Igepal CA-630, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS) y realizar inmunoprecipitaciones estándar15 utilizando de un quinto a la mitad de cada muestra 
	NOTA: Se utiliza Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenglicol) en lugar de NP-40, que ya no está disponible comercialmente. Los dos compuestos son químicamente indistinguibles.</li>
	<li>Resuelva proteínas inmunoprecipitadas por SDS-PAGE. Tinte, decolora y seque geles.</li>
	<li>Exponga los geles a un detector de fósforo O/N y detecte proteínas radiactivas (incluidos los productos de reticulación) con un generador de imágenes de fósforo.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este artículo describe un método que combina la fotoreticulación específica del sitio con el etiquetado de persecución de pulsos para examinar la dinámica de las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes de una célula viva. El método es especialmente útil para estudiar procesos de varios pasos en los que la proteína interactúa secuencialmente con otros factores. A diferencia de los enfoques tradicionales de reticulación química, la fotoreticulación específica del sitio proporciona información detall...

A menudo es esencial identificar y caracterizar las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes celulares para definir su papel en una vía biológica, para comprender su ensamblaje o para dilucidar su mecanismo de acción. Una amplia variedad de enfoques se utilizan comúnmente para estudiar las interacciones proteína-proteína, pero todos tienen sus limitaciones. El método más simple e imparcial para identificar proteínas que se unen a una proteína de interés es la copurificación (o coinmunoprecipitación), pero este enfoque requiere que un complejo proteico permanezca intacto durante el procedimiento de purificación. Las interacciones de proteínas débiles o transitorias se pueden estabilizar a través de la reticulación química, pero este método generalmente requiere el uso de compuestos que unen proteínas a través de aminas primarias que están ampliamente dispersas en la secuencia de proteínas. Se pueden generar patrones de reticulación complicados que son difíciles de interpretar, especialmente cuando las proteínas de interés son componentes de complejos multiproteicos. Además, debido a que los brazos espaciadores de los reticulantes químicos generalmente exceden los 10 Å de longitud, se pueden formar enlaces covalentes con proteínas que se encuentran cerca de la proteína de interés, pero que no interactúan directamente con ella. Métodos como la cromatografía de afinidad y los cribados de dos híbridos también suelen ser útiles para identificar las interacciones proteína-proteína. El primer enfoque, sin embargo, requiere reproducir condiciones que promuevan interacciones fisiológicamente significativas y no se pueden utilizar para detectar interacciones débiles. Este último enfoque requiere que las interacciones de unión puedan replicarse en el organismo huésped y se mantengan cuando una proteína de interés y sus socios de unión se colocan en el contexto de una proteína de fusión. Los métodos de dos híbridos también tienden a generar resultados falsos positivos2. Una vez que se ha establecido una interacción proteína-proteína, a menudo se requiere un trabajo considerable para mapear el sitio de interacción. Quizás el inconveniente más significativo de los enfoques tradicionales es que no proporcionan ninguna información sobre la secuencia temporal de las interacciones intermoleculares o la cinética de la unión.
Este artículo describe un método simple que supera algunas de las limitaciones de otros enfoques que se utilizan para estudiar las interacciones proteína-proteína. Inicialmente, se introduce una única mutación ámbar en el gen que codifica una proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se coexpresa con un ARNt supresor de ámbar y una aminoacil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii que han sido modificadas para incorporar el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) solo en codones ámbar3. La irradiación de las células con luz ultravioleta (UV) de longitud de onda larga (~365 nm) facilita la formación de un enlace covalente entre el Bpa y las proteínas que se encuentran dentro de ~3-8 Å4,5. En algunos contextos experimentales, también se pueden formar enlaces cruzados entre el Bpa activado y los componentes no proteicos de las células, como los lípidos y los ácidos nucleicos6. Las moléculas que terminan en el codón ámbar generalmente deben distinguirse fácilmente de la proteína de longitud completa en SDS-PAGE y no pueden ser reticuladas a otras proteínas. Al someter a las células a un radiomarcaje de persecución de pulsos antes de la reticulación y luego a los productos de reticulación inmunoprecipitantes o purificadores de afinidad, se puede establecer la secuencia y la duración de las interacciones proteína-proteína. La capacidad de generar información temporal sobre las interacciones intermoleculares es especialmente valiosa para estudiar la progresión de una proteína de interés a través de cualquier vía ordenada de ensamblaje, tráfico o señalización de múltiples pasos y para identificar los intermediarios de la vía. Al igual que la reticulación química, la reticulación específica del sitio detecta las interacciones proteína-proteína que se producen en condiciones fisiológicas, pero la introducción de un reticulante en una sola posición facilita el análisis de las interacciones entre segmentos individuales de una proteína y otros factores. Esta característica única de la reticulación específica del sitio es especialmente ventajosa cuando la proteína de interés tiene múltiples segmentos o dominios que tienen el potencial de interactuar con distintos socios de unión. Además, la reticulación específica del sitio se puede utilizar en combinación con métodos como la espectrometría de masas para mapear con precisión los residuos que median las interacciones proteína-proteína. Aunque este método está optimizado para su uso en E. coli, la incorporación de análogos de aminoácidos fotoactivables en proteínas por supresión de ámbar se ha reportado en Mycobacterium, levadura y célulasde mamíferos 7-11. Así, en principio nuestro método puede ser utilizado en otros sistemas.
Hemos utilizado este método ampliamente para identificar interacciones intermoleculares que facilitan la biogénesis de EspP, un factor de virulencia de E. coli O157:H7. EspP es miembro de una superfamilia de proteínas conocidas como "autotransportadores" que contienen un gran dominio extracelular N-terminal ("dominio de pasajeros") y un dominio aC-terminal ("dominio b") que se pliega en una estructura cilíndrica de barril b y ancla la proteína a la membrana externa (OM)12. El mecanismo por el cual el dominio del pasajero se transloca a través del OM ha sido un misterio desde hace mucho tiempo. Al igual que todas las proteínas de la superficie celular bacteriana, la EspP debe transportarse a través de la membrana interna, transportarse a través del periplasma (el espacio entre las membranas interna y externa) y dirigirse a la MO en una serie de eventos ordenados. Después de su translocación a través de la MO, el dominio del pasajero EspP también se separa del dominio b por una escisión proteolítica y se libera de la superficie de la célula. Al combinar la reticulación específica del sitio con el radiomarcaje de persecución de pulsos, hemos demostrado que ambos dominios de la proteína interactúan inicialmente con la chaperona molecular Skp en el periplasma6. Posteriormente, segmentos discretos del dominio b interactúan de manera estereoespecífica con los componentes de un heterooligómero llamado complejo Bam, que cataliza la integración de las proteínas b barrel en la OM bacteriana por un mecanismo desconocido. Quizás lo más interesante es que hemos encontrado que el dominio de pasajeros está en contacto con una de las subunidades del complejo Bam (BamA) a medida que atraviesa el OM13. Nuestros resultados nos han permitido construir un modelo detallado para el ensamblaje del autotransportador14 y han implicado al complejo Bam en el transporte del dominio de pasajeros a través del OM.

<table><tbody><tr><td>Kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, reactivo de marcado metabólico (35S-L-metionina y 35S-L-cisteína, >1,000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P Lámpara UV de súper alta intensidad, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla de repuesto Spectroline 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos Falcon, 6 pocillos</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Desechable 125 ml Matraz Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 baño de agua agitada</td><td>Nuevo Brunswick Scientific</td><td>, n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Este artículo describe un método para detectar y analizar interacciones dinámicas entre una proteína de interés y otros factores in vivo. Nuestro método se basa en la tecnología de supresión de ámbar que fue desarrollada originalmente por Peter Schultz y sus colegas1. Una mutación ámbar se introduce primero en un codón específico del gen que codifica la proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se expresa en E. coli junto con genes que codifican un ARNt supresor de ámbar y una amino acil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii. Con este sistema, el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) se incorpora en el codón ámbar. A continuación, las células se irradian con luz ultravioleta para unir covalentemente el residuo de Bpa a las proteínas que se encuentran dentro de 3-8 Å. La fotoreticulación se realiza en combinación con el marcaje de seguimiento de pulsos y la inmunoprecipitación de la proteína de interés para monitorear los cambios en las interacciones proteína-proteína que ocurren en una escala de tiempo de segundos a minutos. Optimizamos el procedimiento para estudiar el ensamblaje de un factor de virulencia bacteriana que consta de dos dominios independientes, un dominio que está integrado en la membrana externa y un dominio que se transloca al espacio extracelular, pero el método se puede utilizar para estudiar muchos procesos de ensamblaje y vías biológicas diferentes en células procariotas y eucariotas. En principio, los factores que interactúan e incluso los residuos específicos de factores que interactúan que se unen a una proteína de interés pueden identificarse mediante espectrometría de masas.

Utilizamos la fotocruzamiento específico en el sitio para identificar proteínas que interactúan con EspP durante su tránsito hacia la membrana externa (OM). En los experimentos que se muestran aquí, los codones de fenilalanina en los residuos 1113 y 1214 fueron reemplazados por codones ámbar. Ambas posiciones se encuentran en el dominio β, que se integra en la OM y actúa como un anclaje de membrana. La estructura cristalina del dominio EspPβ16 muestra que los dos residuos están en el lado periplásmico del barr...

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la dinámica de las interacciones proteína-proteína dentro de una célula viva. Esto se logra primero expresando una proteína de interés en e coli, incorporando el análogo de aminoácido benzoyl fenil alanina en la proteína en una ubicación específica y realizando un marcado radioactivo por pulso y caza para etiquetar una pequeña población de moléculas de proteína sintetizadas de forma sincrónica. Como segundo paso.Aliquotas de células recolectadas en diferentes momentos durante la carrera se exponen a radiación UV para inducir la formación de enlaces covalentes entre la proteína de interés y cualquier factor con el que esté interactuando. A continuación, las proteínas se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos y se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS con el fin de identificar los factores que interactúan. Los resultados obtenidos muestran cambios en las interacciones entre la proteína de interés y otros factores intracelulares a lo largo del tiempo, basados en las variaciones en la movilidad electroforética de los productos de reticulación. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la co-inmunoprecipitación o el reticulado químico, es su capacidad para generar información temporal sobre las interacciones que ocurren entre un residuo específico en una proteína de interés y otras moléculas.Dichos datos son especialmente valiosos al estudiar la progresión de una proteína a través de una vía de ensamblaje de múltiples pasos y para identificar intermediarios del ensamblaje. Aunque este método ha sido optimizado para su uso en e coli, también puede emplearse en otros sistemas, incluyendo otras bacterias, levaduras y células de mamíferos. Los detalles sobre la preparación del cultivo se encuentran en el protocolo escrito.Prepare brevemente cinco mililitros de medio M nueve que contenga glicerol al 0,2 %, todos los aminoácidos esenciales excepto metionina y cistina, y antibióticos. Inicie cultivos nocturnos añadiendo E. coli transformada con un plásmido que codifique para la proteína de interés con una mutación ámbar y el plásmido que codifique para el sistema de supresión ámbar. Incube a 37 grados Celsius. El día del experimento, añada una cantidad adecuada de células del cultivo nocturno a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga 50 mililitros de medio M nueve y antibióticos para obtener una densidad óptica a 550 nanómetros de 0,03. Incube los cultivos a 37 grados Celsius en un baño de agitación. Cuando los cultivos alcancen la fase logarítmica temprana a media, añada 50 microlitros de benzoil fenilalanina o BPA de un molar a cada cultivo. Añada el BPA gota a gota mientras agita suavemente el matraz para evitar la precipitación. A continuación, añada cualquier inductor necesario para inducir la expresión del mutante ámbar.Continúe incubando los cultivos a 37 grados Celsius durante 30 minutos adicionales durante el período de inducción de 30 minutos. Etiquete seis tubos desechables de centrífuga de 15 mililitros con el punto de tiempo y ya sea con más UV o sin uv. Coloque los tubos etiquetados sobre hielo.Coloque una placa de cultivo celular de seis pocillos sobre un segundo recipiente con hielo lleno de hielo. Encienda la lámpara UV cinco minutos antes de la marcación radiactiva. Luego, agregue aproximadamente dos mililitros de hielo a cada tubo etiquetado como sin UV y a dos de los pocillos en la placa de múltiples pocillos.Es esencial soplar aire con hielo directamente sobre los tubos y pocillos para detener inmediatamente las reacciones intracelulares en cada punto temporal y así obtener una instantánea precisa de la vía bioquímica al final del período de inducción de 30 minutos. Transfiera 25 mililitros de la cultura a un matraz erlenmeyer desechable de 125 mililitros previamente calentado. Coloque el matraz en un baño de agua agitador a 37 grados Celsius.Los pasos de la marcación con pulso y caza y la irradiación con UV deben realizarse de manera oportuna y requieren una organización considerable y una preparación avanzada. Añada 30 microcurios por mililitro de metionina y cisteína marcadas con S 35 al cultivo y agite rápidamente para mezclar en el momento cero minutos un segundo.Añada 250 microlitros de una solución no radiactiva de metionina-cisteína 100 milimolar y agite rápidamente. Para mezclar, aspire inmediatamente cuatro mililitros de la cultura y dispénselos en uno de los pocillos de la placa multilugar fría que contiene hielo; aspire un segundo alícuota de cuatro mililitros y colóquelo en el tubo de 15 mililitros etiquetado como cero minutos sin UV en el tiempo. Dos minutos cero segundos.Transfiera con pipeta cuatro mililitros de la cultura a un segundo pocillo de la placa multipozol fría que contiene hielo. Luego, transfiera con pipeta otro alícuota de cuatro mililitros al tubo de 15 mililitros etiquetado como un minuto menos UV inmediatamente antes del punto temporal de cinco minutos, y agregue aproximadamente dos mililitros de hielo a un tercer pocillo de la placa multipozol a los seis minutos cero segundos. Transfiera con pipeta cuatro mililitros de la cultura al tercer pocillo de la placa multipozol fría que contiene hielo.Colocó otro alícuota de cuatro mililitros en el tubo de 15 mililitros etiquetado como cinco minutos sin uv. Colocó la placa de pocillos múltiples en el recipiente con hielo bajo la lámpara UV precalentada e irradió cada muestra individualmente durante cuatro minutos. Transfirió las células a los tubos de 15 mililitros enfriados etiquetados como cero minutos con uv, un minuto con UV y así sucesivamente.Luego, centrifugue las células a 2.500 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Reuspenda cada muestra en 300 microlitros de medio M nueve o PBS y 33 microlitros de ácido tricloroacético frío al 100 % o TCA para precipitar las proteínas; centrifugue los precipitados de TCA en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 10 minutos. Antes de eliminar el sobrenadante, agregue 50 microlitros de tampón de solubilización a cada muestra y caliente con agitación a 95 grados Celsius durante cinco minutos para solubilizar la proteína precipitada.Después de agregar un mililitro de tampón de ensayo de inmunoprecipitación con radioinmunoensayo, realice inmunoprecipitaciones estándar utilizando de una quinta parte a la mitad de cada muestra. Separe las proteínas inmunoprecipitadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico o SDS-PAGE. Finalmente, exponga los geles teñidos y secados a una pantalla fosfoimagen durante la noche y detecte proteínas radiactivas, incluyendo productos de reticulación, mediante un fosfoimagen. Se utilizó la reticulación fotoquímica específica por sitio para identificar proteínas que interactúan con ESPP durante su tránsito hacia la membrana externa.Para este experimento, los codones de alanina en los residuos 1113 y 1214 del dominio beta de ESPP se reemplazaron con codones Ámbar. La estructura cristalina del dominio beta de ESPP muestra que ambos residuos se encuentran en el lado periplásmico del barril beta, separados aproximadamente por 120 grados. Se inmunoprecipitaron dos polipéptidos diferentes de células irradiadas y células control mediante el suero anti-ESPP de la región C-terminal.Inicialmente, una forma precursora de aproximadamente 135 kilodalton de la proteína que contiene los dominios pasajero y beta unidos covalentemente predominó en puntos temporales posteriores. El nivel de PRO ESPP disminuyó y el dominio beta libre comenzó a predominar a medida que el dominio pasajero fue translocado a través de la membrana externa y separado del dominio beta mediante una escisión proteolítica. Las muestras irradiadas con UV I, sin embargo, presentaban claramente bandas de mayor peso molecular que no estaban presentes en las muestras control.Estas bandas resultan del entrecruzamiento de PRO ESPP con proteínas que interactúan, y basándose en la movilidad de estos polipéptidos, se estimaron los tamaños de las proteínas que interactúan para comprobar si podrían corresponder a factores conocidos de ensamblaje de proteínas de membrana externa. Se realizaron inmunoprecipitaciones adicionales utilizando anticuerpos anti-cera generados contra los posibles socios de interacción. Un polipéptido de aproximadamente 150 kilodalton que se observó cuando el BPA se incorporó en los residuos 1113 y 1214 pudo ser inmunoprecipitado con un antisuero contra la chaperona periplásmica de 17 kilodalton, Skip.Además, descubrimos que los polipéptidos más grandes que se observaron cuando el BPA se incorporó en solo una de las dos posiciones podían inmunoprecipitarse con anticuerpos contra los subunidades del complejo BAM, BAM B y BAM D, respectivamente. Tras realizar este procedimiento, los productos de reticulación pueden purificarse y se pueden aplicar otros métodos, incluida la espectrometría de masas, para ayudar a identificar los factores que interactúan con una proteína de interés. Tras ver el video, deberías tener una buena comprensión de cómo combinar con éxito el marcado por pulso y caza con la reticulación fotoinducida específica de sitio para estudiar la dinámica de interacción de tu proteína de interés con otras moléculas dentro de la célula viva.

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