Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

El objetivo general de este experimento es evaluar la virulencia de varias cepas de Leishmania a través de la infección in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea murina, y la posterior cuantificación de la cinética de crecimiento intracelular del parásito. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre los factores tanto del macrófago del huésped como del patógeno que determinan la virulencia de los parásitos infecciosos de Leishmania. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un método rápido, económico y fiable que requiere significativamente menos animales, en comparación con los estudios in vivo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la leishmaniasis, ya que se puede utilizar para evaluar la infectividad de las cepas de Leishmania mutadas o la eficacia de los compuestos terapéuticos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento de macrófagos derivados de la médula ósea y la cuantificación de parásitos intracelulares son difíciles de aprender solo con protocolos escritos. Comience asegurando un ratón hembra de cuatro a seis semanas de edad a una tabla de disección y desinfecte al animal con etanol al 70%.

Use unas tijeras para hacer una incisión de un centímetro cerca de una articulación de la cadera y corte la piel alrededor de la articulación. Tire de la piel de la pierna hacia el tobillo para deñar cuidadosamente la extremidad y corte el pie a la altura de la articulación del tobillo o por debajo de ella para dejar la tibia intacta. Para localizar la articulación de la cadera, manipule el fémur para identificar el punto de rotación y utilice las tijeras para cortar la pierna por encima de la articulación de la cadera, dejando intacta la cabeza proximal del fémur.

Extraiga la mayor cantidad posible de músculo y tejido conectivo de la pierna y coloque los huesos limpios en una placa de Petri que contenga RPMI estéril suplementado con antibióticos en hielo. Después de recolectar el segundo conjunto de huesos de la pierna, use pinzas esterilizadas y una cuchilla número diez para eliminar cualquier músculo y tejido conectivo restante. Transfiera los huesos limpios a una tapa de placa de Petri vacía y use el bisturí para quitar ambos extremos de cada tibia para acceder a la médula.

Con pinzas, coloque una tibia sobre la boca de un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo e inserte la punta de una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 10 mililitros llena de medios suplementados con antibióticos en un extremo de la tibia. Enjuague aproximadamente de cinco a 10 mililitros de medio a través del hueso hasta el tubo cónico hasta que se haya extraído todo el tejido rojo de la médula ósea y el hueso se vea blanco. Cuando se haya recolectado toda la médula, centrifugar la médula ósea agrupada y volver a suspender la paleta de células de la médula ósea en cinco mililitros de medio macrófago derivado de la médula ósea.

Transfiera la suspensión de células de médula ósea a un matraz de cultivo celular de 175 centímetros cuadrados que contenga 60 mililitros de medio macrófago estéril derivado de la médula ósea y enjuague el tubo dos veces con el medio del matraz de cultivo para garantizar la máxima recuperación celular. Después del segundo lavado, transfiera una alícuota de 30 mililitros de células a un segundo matraz de cultivo celular de 175 centímetros cuadrados y cierre cada matraz con una tapa de filtro. Luego, incube ambos cultivos durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitir la separación de los macrófagos residentes de cualquier fibroblasto contaminante u otras células adherentes.

A la mañana siguiente, transfiera 10 mililitros de sobrenadante indiferenciado que contenga células de médula ósea de cada matraz a placas de Petri de poliestireno tratadas con cultivo individual de 100 por 15 milímetros sin cultivo de tejidos, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante dos o tres días más. Luego, alimente los cultivos con cinco mililitros de medio fresco de macrófagos derivados de la médula ósea de 37 grados Celsius por plato y devuelva las placas a la incubadora. En el séptimo u octavo día después del cultivo, use una punta de aspiración instalada en una línea de vacío para transferir cuatro cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave de 12 milímetros al fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos sin superponerse.

Prepare placas idénticas para cada punto de tiempo del experimento. A continuación, lavar los cultivos de macrófagos derivados de la médula ósea dos veces con PBS fresco a 37 grados centígrados y cinco mililitros de PBS sin calcio y magnesio suplementado con un milimolar de EDTA en cada placa. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, agrupe las células desprendidas en un tubo cónico de 50 mililitros, enjuagando cada placa dos veces con cinco mililitros adicionales de PBS sin calcio y magnesio.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender los macrófagos en cinco a 10 mililitros de medio macrófago fresco derivado de la médula ósea en hielo. Después de contar, diluya las células a cinco veces 10 a la quinta concentración por mililitro en medio macrófago fresco derivado de la médula ósea y agregue dos mililitros de células por pocillo a la placa de seis pocillos. Luego, incube las células durante la noche en la incubadora de cultivos celulares.

Para infectar las células con L. amazonesis, diluya la suspensión del parásito hasta la multiplicidad experimental apropiada de infección y agregue de 50 a 100 microlitros de parásitos a cada pocillo de las seis placas de pocillos, incluidos todos los puntos de tiempo del experimento. Incubar los macrófagos derivados de la médula ósea durante el período de infección y la temperatura adecuados. A continuación, lavar los pocillos tres veces con dos mililitros de PBS fresco a 37 grados Celsius sin calcio ni magnesio por pocillo, y fijar las muestras de punto de tiempo inicial con 1,5 a 2 mililitros de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos.

Para las placas correspondientes a los puntos de tiempo posteriores, agregue dos mililitros de medio macrófago fresco derivado de la médula ósea a cada pocillo y devuelva las placas a la incubadora adecuada. A continuación, fije y lave las celdas para cada uno de los puntos de tiempo restantes, como se acaba de demostrar, y almacene las muestras a cuatro grados centígrados en PBS fresco. Para teñir las células con DAPI, sustituya el sobrenadante por 1,5 mililitros de PBS fresco sin calcio y magnesio, suplementado con detergente no iónico al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de dos mililitros con PBS sin calcio ni magnesio.

A continuación, tiñe las células con dos microgramos por mililitro de DAPI en un mililitro de PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, coloque los deslizadores de la cubierta con el lado de la celda hacia abajo sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio individual montado con un reactivo de montaje comercialmente antidecoloración. A continuación, para cuantificar el número de células infectadas, utilice el objetivo de aceite de inmersión 100x de un microscopio de fluorescencia y un contador manual para identificar el número de núcleos amastigotas más pequeños agrupados alrededor de cada núcleo grande teñido con DAPI.

Leishmania tiene dos formas infectivas, los promastigotes metacíclicos, que se diferencian de los promastigotes procíclicos en la fase estacionaria de cultivo, y el amastigote, la forma infecciosa intracelular que se encuentra dentro del huésped vertebrado. Aquí, se pueden visualizar amastigotes diferenciados axenicamente dentro de un macrófago derivado de la médula ósea una hora después de la infección inicial y antes de la formación de vacuolas parasitóforas mediante fusión fagolisosomal. A las 48 horas, se pueden observar vacuolas parasitóforas de gran tamaño que albergan múltiples parásitos, característicos de una infección virulenta por Leishmania.

Por el contrario, los promastigotes de fase logarítmica no virulentos son incapaces de iniciar el desarrollo de vacuolas parasitóforas, no se replican y, finalmente, mueren dentro de los macrófagos del huésped. En este experimento, se observó un aumento constante en el número de parásitos metacíclicos intracelulares de Leishmania de tipo salvaje hasta 72 horas después de la infección, mientras que se midió poco o ningún crecimiento intracelular para los parásitos mutantes con una importación de hierro mitocondrial alterada, lo que sugiere que la actividad mitocondrial es necesaria para el crecimiento del parásito dentro de los macrófagos. Las infecciones por macrófagos llevadas a cabo con amastigotes axénicos de tipo salvaje y mutantes mostraron un patrón de crecimiento intracelular similar al observado con los promastigotes metacíclicos, pero con una infectividad del parásito de tipo salvaje aún mayor que la observada en los promastigotes metacíclicos.

Es importante tener en cuenta que existe un retraso inicial de 24 horas para las infecciones por promastigotes metacíclicos, lo que representa el tiempo necesario para que los promastigotes metacíclicos internalizados se diferencien primero en amastigotes antes de comenzar a replicarse. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 15 días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar las cepas de ratón adecuadas y realizar una cuantificación cuidadosa tanto de las células de macrófagos como de las células del parásito para garantizar un momento de inergia coherente en todos los experimentos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar macrófagos derivados de la médula ósea e infectarlos con Leishmania para cuantificar su crecimiento intracelular del parásito, después de la tinción nuclear con DAPI. No olvide que trabajar con Leismania puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como usar un gabinete de seguridad biológica y equipo de protección personal, y evitar instrumentos afilados mientras se realiza este procedimiento.