Name: Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar el crecimiento intracelular de Leishmania en macrófagos derivados de médula ósea murina. Este método rápido y confiable evalúa la virulencia parasitaria y reduce el uso de animales en investigación.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud AI067979 to1 a NWA. YK es beneficiario de beca de pregrado de la Howard Hughes Medical Instituto/Universidad de Maryland College Park.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron según las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio por los institutos nacionales de salud y fueron aprobados por la Universidad de Maryland IACUC. Todos los pasos descritos en las secciones 1 a 4 deben realizarse asépticamente dentro de gabinetes de flujo laminar biológicas. Protección personal debe ser utilizada, y debe tener cuidado durante la manipulación de los parásitos de Leishmania vivo en todas las etapas de experimentación.
1. aislamiento y diferenciación de los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs)8,30,31
<ol><li>
Día 0: 4 - 6 semanas de edad hembra C57BL/6 o el ratón BALB/c en CO2 cámara de sacrificio y confirmar muerte por dislocación cervical. Asegurar la esterilización de tijeras y pinzas manteniéndolos empapado en etanol al 70%. Pulverice los guantes con etanol al 70% para permitir que la estéril manejo durante todo el proceso de aislamiento de células de médula ósea.</li>
	<li>Fijando sus patas delanteras para asegurar ratón sacrificado para tablero de disección y desinfectar rociando copiosamente con etanol al 70%.</li>
	<li>Hacer una incisión pequeña (1 cm) con unas tijeras cerca de la articulación de la cadera. Inserte con cuidado las tijeras debajo de la piel para separar el músculo subyacente y cortar la piel alrededor de la articulación de la cadera. Nota: La tabla de disección puede girarse para permitir mejorar el acceso a la articulación de la cadera.</li>
	<li>Deglove piel de la pierna tirando hacia el tobillo y retire cuidadosamente. Corte el pie en el tobillo, teniendo cuidado de cortar en o debajo del tobillo empalme dejar intacta la tibia. Nota: El peroné en esta etapa se une libremente y se puede separar fácilmente con el fórceps.</li>
	<li>Localizar manualmente la articulación de la cadera mediante la manipulación del fémur para identificar el punto de rotación. Cuidadosamente use tijeras para cortar la pierna por encima de la articulación de la cadera para dejar intacta la cabeza proximal del fémur.</li>
	<li>Quite tanto músculo y tejido conectivo posible de la pierna con unas tijeras. Retire cualquier resto piel del tobillo y cualquier material de hueso sobrante por encima de la articulación de la cadera.</li>
	<li>Coloque los huesos de la pierna limpia en estéril RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final de 1%) en una placa Petri sobre hielo.</li>
	<li>Repita los pasos 1.4 por 1.6 para aislar la tibia y el fémur de la otra pata trasera.</li>
	<li>Retire cualquier resto tejido muscular y conjuntivo de los huesos en RPMI usando pinzas esterilizadas y estéril cuchilla #10.</li>
	<li>Coloque los huesos en la tapa de la caja de Petri. Corte cuidadosamente la tibia con la hoja inmediatamente por encima de la articulación del tobillo a la médula. Retire la tibia el resto de la pierna por corte inmediatamente por debajo de la articulación de la rodilla.</li>
	<li>Extraer 10 mL estéril RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final de 1%) en una jeringa de 10 mL y conecte una aguja de 25G.</li>
	<li>Mantenga la tibia firmemente con unas pinzas, verticalmente sobre un tubo cónico de 50 mL en hielo. Utilice la jeringa para inyectar suavemente unos 5 mL RPMI en el extremo del hueso para eliminar la médula ósea en el otro extremo en el tubo cónico. Enjuague la médula ósea con un total de 10 mL RPMI hasta que el hueso se pone blanco. Nota: Después del lavado cuidadoso, el hueso debe virar a blanco. Si no, continúe enjuagando para extraer médula ósea. El extremo distal de la tibia puede que se deba recortar con la hoja si es demasiado estrecho para introducir la aguja.</li>
	<li>Corte del fémur inmediatamente por encima de la articulación de la rodilla e inmediatamente por debajo de la articulación de la cadera para exponer ambos extremos del hueso a la médula. Limpiar la médula ósea de fémur con un total de 10 mL RPMI en la misma forma que la tibia.</li>
	<li>Repetir limpieza y lavado pasos 1.6 a través de 1.13 con los huesos restantes y recoger las células de médula ósea lavada en un tubo cónico de 50 mL solo Nota: Si un hueso se rompe en cualquier punto durante la disección antes de hueso lavado, use el tuétano de este hueso.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico utilizado para recolectar la médula ósea, lavada de todos los huesos de cuatro por 10 min a 4 ° C a 300 x g.</li>
	<li>Coloque 60 mL de medio estéril de BMM (RPMI con una concentración final de 20% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1,2 mM Na-piruvato, 25 μg/mL M-CSF humano) en un matraz de cultura de célula de 175 cm2 con tapa de filtro.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante centrifugado siguiente y resuspender el precipitado de células por suave arriba y abajo de pipeteo con 5 mL de medio BMM del frasco.</li>
	<li>Suspensión de células de transferencia en el matraz de cultivo y enjuague el tubo cónico dos veces con medio BMM del frasco de cultivo para garantizar la recuperación máxima de la célula. Asegurar la suspensión celular se mezcla completamente en el medio y distribuir 30 mL del frasco de cultivo celular inicial de 175 cm2 a un segundo 175 cm2 célula cultura matraz con tapa de filtro.</li>
	<li>Incubar ambos matraces que contienen la suspensión de células de 30 mL cada noche a 37 ° C, 5% CO2 para permitir la separación de cualquier contaminante de los fibroblastos, los macrófagos residentes y otras células adherentes.</li>
	<li>
Día 1: Transferir el sobrenadante que contiene las células indiferenciadas de la médula de matraces de 100 x 15 mm tratados de TC no poliestireno cajas Petri en aproximadamente 10 mL, incubar a 37 ° C, 5% CO2. y plato Deseche los frascos.</li>
	<li>
Día 3 o 4: Añadir un medio BMM adicional 5 mL (previamente calentado a 37 ° C) a cada placa de Petri y continuar la incubación a 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>2. galjanoplastia BMMs de cubreobjetos para la infección (día 7 o 8)
<ol><li>Preparar platos para cultivo de tejidos 6 bien colocando cuatro 4 estéril 12 mm vidrio cubreobjetos (autoclave y almacenados en un recipiente de vidrio cerrado) en la parte inferior de cada vacío bien. Nota: Recoger cada cubreobjetos estériles 12 mm con una punta de aspiración para una línea de vacío. Coloque un cubreobjetos los pozos sin traslapo, soltar en la posición deseada por pellizcar el tubo para interrumpir el vacío.</li>
	<li>Medios (y Aspire las células no adherentes) de platos de Petri recubiertas con médula ósea adherente derivan macrófagos y suavemente adherente de enjuague células x 2 con solución salina amortiguadora de fosfatos estéril de Dulbecco sin cloruro de calcio y magnesio (PBS- / -) previamente calentado a 37 ° C.</li>
	<li>Gota a gota, añada 5 mL estéril 1 x PBS- / - con una concentración final de 1 mM EDTA a cada placa de Petri e incubar 5 min a 37 ° C para separar el adherente BMMs. verificar que las células son separadas usando un microscopio.</li>
	<li>Recoger todo separado las células suspendidas en PBS 1 x- / - suplementados con 1 mM de EDTA en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague cada plato x 2 con 5 mL de PBS- / - y añadir a la piscina de suspensión celular. Nota: Suspensión de la célula puede diluirse con PBS adicional- / - para proteger a los macrófagos de la toxicidad del EDTA durante el proceso de recolección.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender los macrófagos en medio BMM de 5-10 mL por pipeteo. Lugar serán suspendidas las células en hielo para evitar la fijación tubos y aglutinación.</li>
	<li>Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán en el hemocitómetro. Nota: Para contar células BMM suspendidas en medio de 5 mL, una mezcla de dilución de la suspensión celular de 25 μL en 445 de μl PBS- / - y solución de azul de tripano 0.4% 30 μL típicamente permite fácil cuantificación en un hemocitómetro (teniendo en cuenta un factor de dilución de 20 x para el cálculo final ). Contar sólo las células que no conseguir teñidas con azul de tripán (células viables). El volumen de la suspensión celular se puede alterar si esta mezcla es muy concentrada o diluida. En general, el rendimiento de BMM por preparación varía entre 2 x 107 y 5 x 107 células de un ratón.</li>
	<li>Preparación de la suspensión celular en medio BMM en la concentración deseada de la galjanoplastia (5 x 105/ml) y dispersar suspensión a 6 platos bien en medio de 2 mL por pozo, para que así cada uno recibe 1 x 106 macrófagos. Nota: Este es un paso crítico que asegura cada bien consigue el número suficiente de macrófagos para cubrir uniformemente el cubreobjetos. Asegúrese de cubreobjetos en pozos no están superpuestos o flotando en el medio. Si es así, ajuste suavemente con una pipeta estéril.</li>
	<li>Incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>3. purificación de formas infectivas de L. amazonensis
Nota: Preparar Leishmania infecciones purificar métodos promastigotes del promastigote estacionario culturas8,13o promastigotes en cultivo se diferencian en la forma de amastigote utilizando estándar L. amazonensis diferenciación axénicos protocolo6,8.
<ol><li>
Purificación de métodos promastigotes de Leishmania mediante media(Materials) gradiente de densidad 33<ol>
<li>Prepare solución 40% de la media de gradiente de densidad en agua estéril, libre de endotoxinas.</li>
		<li>Diluir la solución de gradiente de densidad en medio de x M199 10 (sin suero) para preparar la concentración de 10% en medio M199.</li>
		<li>Todas las soluciones de filtro por filtro de 0,22 μm. Nota: Las soluciones Stock pueden almacenarse a 4 oC en la oscuridad durante no más de 1 mes.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución de medios gradiente de densidad de 40% en la parte inferior de un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.</li>
		<li>La capa 2 mL de solución de medios gradiente de densidad 10% en M199 encima de la capa de gradiente media densidad 40% cuidadosamente, utilizando una pipeta Pasteur para evitar cualquier mezcla entre las dos capas.</li>
		<li>Recoger 1 x 109 parásitos de la cultura de la fase estacionaria por centrifugación a 1.900 x g por 10 min.</li>
		<li>Resuspender las células en de 6 mL Dulbecco modificado medio esencial (DMEM).</li>
		<li>Capa 2 mL de la suspensión de células directamente en la parte superior la densidad 10% gradiente media capa, suavemente, usando una pipeta Pasteur para evitar la mezcla entre las capas.</li>
		<li>Centrifugue el gradiente durante 10 min a 1.300 x g a temperatura ambiente. Nota: Debido a las diferencias en las propiedades físicas entre las especies de Leishmania , condiciones de centrifugación para cada uno pueden tener que ajustarse ligeramente para asegurar rendimiento máximo.</li>
		<li>Recoger parásitos (enriquecidos en forma promastigote métodos) de la banda formada en el límite de medios gradiente de densidad 10% superior (interfaz entre las capas de medios gradiente de densidad 0% y 10%).</li>
		<li>Diluir los parásitos con un volumen de DMEM y recogen por centrifugación (1.900 x g durante 10 min a temperatura ambiente).</li>
		<li>Resuspender en 500 μl de medio DMEM y contar en un hemocitómetro para cuantificar el rendimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generación de amastigotes de L. amazonensis bajo condiciones de cultivo axénicos (bajo pH / elevada temperatura)6,8,13<ol>
<li>Mezclar 5 mL de cultivo de promastigote de fase logarítmica (pH 7.4 a 26 oC) con un volumen igual de medio de amastigote (pH 4.5), utilizando matraces de 25 cm2 (medio total 10 mL) e incubar a 26 ° C durante la noche.</li>
		<li>Cambiar el frasco de 26 ° C a 32 ° C.</li>
		<li>Después de 3 o 4 días, fractura cultura 1:5 en amastigote media a 32 ° C.</li>
		<li>Controlar los parásitos en los próximos 3-4 días (máximo 7 días) para ver si están listos para su uso en infecciones. Nota: Amastigotes axénicos saludables debe tener una forma ovalada, sin flagelos visibles. Amastigotes parcialmente diferenciados tienen una forma oval grande con flagelos cortos. La cultura no debe tener un montón de grupos - muchos grupos son una indicación de no crecimiento, mueren los parásitos. La cultura de amastigote se puede dividir 1:5 y mantenida durante un máximo de 3 semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. infección con L. amazonensis
<ol><li>Diluir la suspensión de parásitos según MOI deseada (generalmente 3-5 métodos promastigotes por macrófagos [MOI de 1:3 o 1:5]) y 1 amastigote por macrófagos [MOI 1:1]. Añadir Leishmania en PBS- / - en un volumen de 50-100 μl a cada pozo ya que contiene medio de 2 mL.</li>
	<li>Incubar BMMs durante 1 h con amastigotes y 3 h con métodos promastigotes en 34 oC infección. Nota: Temperatura óptima de la infección puede variar según las especies.</li>
	<li>Tras la incubación, lavar cuidadosamente lejos parásitos libres en cada bien 3 veces con 2 mL de PBS- / - precalentado a 37 ° C. Nota: Dispersar PBS suavemente para asegurar que cubreobjetos no flota sobre la otra. Agitar suavemente la placa y luego aspirar el líquido. Use la boquilla de aspiración independiente si utiliza múltiples cepas de parásitos para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Fijar 1 h o 3 h-momento muestras incubando cada una con 1.5-2 mL 2% PFA en PBS- / - durante 10 minutos lavar 3 veces con PBS- / -. No aspirar el último lavado y refrigerar las placas que contienen cubreobjetos en PBS hasta manchas.</li>
	<li>Añadir medio fresco de BMM de 2 mL en cada pocillo de las placas para más puntos de tiempo e incubar a 34 ° C.</li>
	<li>Fijar los restantes momentos deseados como se describe en el paso 4.3, y refrigere las placas hasta que la coloración.</li>
</ol>5. DAPI tinción y montaje de cubreobjetos
<ol><li>Aspire de PBS de los pozos que contienen cubreobjetos y añadir 1,5 mL de PBS- / - con 0,1% detergente no iónico. Incubar 10 min a temperatura ambiente, seguido de lavado 3 veces con 2 mL de PBS- / -.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS- / - con 2 μg/mL de DAPI (diluido de 5 mg/mL de solución stock en agua) en los pocillos que contienen cubreobjetos e incubar durante otro 1 h a temperatura ambiente. Nota: El tiempo de incubación con DAPI es fundamental para la correcta visualización de los parásitos de Leishmania intracelulares. Núcleos de macrófago de la mancha rápidamente, debido a su mayor tamaño y ADN contenido pero la coloración de los núcleos de los parásitos intracelulares es más lento. Así, prolongando tiempo de la incubación más allá de lo que es necesaria para visualizar los núcleos BMM es necesario para permitir la DAPI para permear a través y la membrana de plasma del parásito y la membrana nuclear de parásito. Con la correcta tinción DAPI, el cinetoplasto mitocondrial ADN cerca del bolsillo flagelar del parásito se puede también visualizar, además del ADN nuclear.</li>
	<li>Lavar bien cada uno que contienen cubreobjetos 3 x con 2 mL de PBS- / - y luego elevación y tapa cubreobjetos con pinzas ponga el lado de la celda abajo y montar en microscopio de vidrio se desliza con un reactivo de montaje antifade comercialmente disponibles. Nota: Cubreobjetos son extremadamente frágiles y necesitan manejo cauteloso. Evitar la presión sobre ellos, especialmente contra el flanco de los pozos cuando se levante. Agregando unas pocas gotas de PBS- / - reduce la tensión superficial entre el cubreobjetos y pozo y facilita el proceso de elevación. Puede utilizarse una aguja de calibre fino para alzaprimar el cubreobjetos en el fondo del pozo. Después de colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos, presione suavemente con unas pinzas para extraer cualquier burbuja de aire en los medios de montaje. Si un cubreobjetos está roto o ha volteado posiblemente durante el proceso de elevación, no vuelva a montar; simplemente use el cubreobjetos cuarto de repuesto.</li>
	<li>Refrigere diapositivas hasta la cuantificación.</li>
</ol>6. cuantificación de la infección
<ol><li>Examinar diapositivas manchadas de DAPI bajo un microscopio de fluorescencia concentrándose en macrófagos con objetivo de 100 X con aceite de inmersión (excitación a 358 nm; emisión óptima en 461 nm). Asegúrese de que el foco está en la capa de macrófagos entre el vidrio portaobjetos y cubreobjetos.</li>
	<li>Cuantificar el número de macrófagos (grandes núcleos teñidos con DAPI) y el número de pequeños núcleos de amastigote agrupadas alrededor de cada núcleo de macrófagos (véase la figura 2A, DAPI) para cada campo de visión, utilizando un contador manual. Nota: Amastigote núcleos pueden no todos ser visibles en un plano de enfoque debido a su pequeño tamaño. Cuenta aquellos que son visibles cuando se centró en núcleos de macrófagos y luego usar foco fino para detectar núcleos de parásito en planos por encima y por debajo de los núcleos de macrófagos.</li>
	<li>Hacia otro campo de visión para repetir la cuantificación. Usa un contador separado para seguimiento del número de campos contados. Mover a través de los campos visuales en filas paralelas a través de cada cubreobjetos, para evitar superposición de conteo.</li>
	<li>Cuantificar un mínimo de 200 macrófagos por cubreobjetos. Cuantificar cada momento de la infección en triplicado (3 cubreobjetos). Cuenta el cubreobjetos cuarto si uno de los anteriores no es adecuada para el recuento debido a la superposición de cubreobjetos, pobre montaje, rotura de cristales, etc. Nota: Si los 200 macrófagos no se puede contar en cualquier un cubreobjetos, contar la de repuesto cuarto.</li>
	<li>Calcular las tasas de infección como macrófagos macrófago amastigotes o amastigotes/100 y determinar los macrófagos infectados por ciento de los datos de cuantificación de materia prima.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten,

Los datos cuantitativos producidos por el ensayo de infección de BMM descrito anteriormente, permite a los investigadores obtener las tasas de infección y una determinación confiable de cambios en las propiedades de virulencia en un período de tiempo relativamente corto (máximo 2 semanas, en comparación con el 2 meses necesarios para experimentos en vivo ). Este método se basa en el tinte específico DNA DAPI, que específicamente las manchas núcleos macrófago y parásito y permite la rápida identificación y cuanti...

La leishmaniasis se refiere a un amplio espectro de enfermedades humanas causadas por especies de parásito protozoario del género Leishmania. Cerca de 12 millones de personas están actualmente infectadas con Leishmania en todo el mundo, y más de 350 millones están en riesgo. La patología de la enfermedad depende de la especie de Leishmania y en factores del anfitrión, y los síntomas varían desde lesiones de piel de auto-sanación inofensivo a formas letales de visceralizing. Si la leishmaniasis visceral, sin tratamiento es fatal, ranking sólo después de la malaria como la mortal enfermedad humana causada por infección con un parásito protozoario1. A pesar de las amplias diferencias en patología de la enfermedad y los síntomas, todas las especies de Leishmania tienen un ciclo de vida digenic alternando etapas de promastigote y amastigote dentro de insectos huéspedes vertebrados, respectivamente. Dentro de vertebrados, Leishmania macrófagos host para invasión de destino e inducen la formación de vacuolas parasitófora (PVs), compartimientos ácidos con propiedades de phagolysosomes donde replican las formas de amastigote altamente virulenta. Los amastigotes persisten en los tejidos del huésped durante las infecciones crónicas y pueden pasarse hacia adelante para no infectada flebótomos, completando el ciclo de transmisión. Por lo tanto, en el contexto de desarrollo humano de la enfermedad, los amastigotes son la Leishmania más importantes del ciclo de vida forma2. Investigar cómo replicar amastigotes dentro del macrófago PVs es fundamental para comprensión Leishmania virulencia3,4,5,6,7 y para el desarrollo de nuevas terapias eficaces.
Aquí describimos un método que se utiliza regularmente por nuestro laboratorio para el estudio de infección por Leishmania y replicación en macrófagos derivados de médula ósea (BMMs), lo que implica la evaluación cuantitativa del número de intracelular de Leishmania en el tiempo. Este proceso involucra la recolección de los monocitos de la médula ósea de ratón y diferenciación a macrófagos en la cultura, en vitro infección con formas infectantes (promastigotes métodos o amastigotes) de Leishmania y cuantificación de la número de parásitos intracelulares en cada intervalo de 24 h para un periodo de 72-96 h después de la infección. Este análisis se ha utilizado en nuestro laboratorio para determinar el impacto de varios factores ambientales y genes del parásito, incluyendo la identificación de la función crítica de hierro en la promoción de virulencia de L. amazonensis que además fue validado por bandolero estudios de desarrollo de la lesión en ratones6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Como todas las especies patógenas de Leishmania establecen su nicho replicativa dentro de macrófagos del huésped, este ensayo puede utilizarse universalmente para determinar la virulencia en todas las especies de Leishmania .
Realizar infecciones BMM permite el análisis de las interacciones huésped-parásito en el nivel de la célula y así una comprensión más amplia de cómo interactúan los parásitos de Leishmania con su microambiente anfitrión favorito, el PVs de los macrófagos. Análisis de la infección de macrófagos se han utilizado con éxito por múltiples grupos16,17,18,19,20,21,22 a explorar funciones de los macrófagos del huésped y genes específicos de Leishmania y su posible participación en la compleja interacción que caracteriza la infección intracelular. Infecciones de BMM permiten la cuantificación del crecimiento del parásito como un indicador del impacto de factores del huésped que influyen en la supervivencia intracelular, como la producción de óxido nítrico de microbicidas, generación de especies reactivas de oxígeno y otras condiciones adversas encontrados dentro del lisosoma-como PVs23. Análisis de la infección de macrófagos también han sido utilizados para identificar potenciales leishmanial anti drogas conduce para desarrollo terapéutico13,24.
La naturaleza en vitro de las infecciones de BMM proporciona varias ventajas sobre otros métodos para evaluar la virulencia de la Leishmania . Sin embargo, varios estudios anteriores examinando mecanismos de supervivencia del parásito intracelular con el tiempo no se cuantificó la infección como una tasa de21,20,24. Además, muchos estudios se centró en seguir en vivo las infecciones con el tiempo lo hicieron midiendo el tamaño de la lesión cutánea y otros síntomas fisiológicos que están sólo indirectamente relacionados con parásito replicación25,26 , 27. infección in vivo es un enfoque riguroso para evaluar la virulencia del parásito, pero mediciones de tamaño de lesión basadas en bandolero solo la hinchazón a menudo son insuficientes, ya que reflejan la respuesta inflamatoria en los tejidos infectados y no la número absoluto de parásitos. Por esta razón, el desarrollo de la lesión de bandolero ensayos tienen que ser seguida por la cuantificación de la carga del parásito en tejidos infectados, un procedimiento que requiere dilución limitante largo ensayos de28. Además, en vivo los estudios implican a menudo sacrificar varios animales en diferentes puntos en el tiempo para extraer los tejidos de interés6,8,9,10, 11 , 13. en cambio, gran número de BMMs puede obtenerse en un animal, y estas células pueden ser bajo condiciones que permiten la evaluación de la infección en varios puntos en el tiempo. Además, en comparación con estudios en vivo , realizar en vitro infecciones BMM permite un mayor control sobre las condiciones experimentales. Cuantificación de los macrófagos infectados con los parásitos permite un control preciso de la multiplicidad de infección (MOI) y de las condiciones de cultivo. Control fino sobre estos factores puede ser clave en la identificación de las características de las vías celulares discretas y en la comprensión de su impacto en el curso de la infección.
Dadas estas ventajas, es algo sorprendente que muy pocos grupos de estudio de virulencia de Leishmania han tomado hasta ahora aprovechando el gravamen cuantitativo de la replicación intracelular en los macrófagos. En este artículo, discutimos los errores comunes que pueden obstaculizar la utilización más amplia de este ensayo y proporcionar un protocolo paso a paso para facilitar su correcta ejecución. Teniendo en cuenta su precisión y versatilidad, el ensayo de infección de BMM que se describe aquí puede no sólo utilizarse para explorar las interacciones huésped-patógeno que influyen en la virulencia de la Leishmania , pero también para el estudio de otros microorganismos que repliegan dentro de los macrófagos29. Lo importante es que, este ensayo se puede desarrollar como un método de cribado clínico previo rápido y económico para el desarrollo de fármacos anti-leishmanial.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles (100-1000 &mu; L)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera de aerosol (20-200 &mu; L)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera de aerosol (2-20 &mu; l)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker Cuchilla quirúrgica de acero al carbono con respaldo acanalado # 10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Punta 10 mL Jeringa</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD Aguja Precisionglide, 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cubrevases: círculos de 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotina</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico 200 grados</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm poliestireno tratado sin TC Placa de Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Texas rojo</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II Diluyente</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>8546719</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvato (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de polipropilena 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón Rat Lamp-1</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp; Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfactante</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Delicadas, 4 1/2"</td> <td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Disección, Punta Fina</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Coulter Contador de partículas, doble umbral</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de leishmania

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

El ciclo vital de Leishmania, el agente causal de la leishmaniasis, alterna entre fases de promastigote y amastigote dentro del insecto y anfitriones vertebrados, respectivamente. Mientras que los síntomas patógenos de la leishmaniasis pueden variar ampliamente, desde lesiones cutáneas benignas formas altamente fatal enfermedad visceral dependiendo de la especie infecciosa, todas las especies de Leishmania residen dentro de los macrófagos del huésped durante la etapa de vertebrados de su ciclo de vida. Infectividad de Leishmania por lo tanto está directamente relacionada con su capacidad de invadir, sobrevivir y replicarse dentro de las vacuolas parasitófora (PVs) dentro de los macrófagos. Por lo tanto, evaluar la capacidad del parásito para replicar intracelularmente sirve como un método confiable para determinar la virulencia. Estudiar desarrollo de leishmaniasis utilizando modelos animales es lento, tedioso y a menudo difícil, especialmente con las formas viscerales patógeno importantes. Describimos aquí una metodología para seguir el desarrollo intracelular de Leishmania en los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs). Parásito intracelular números se determinan intervalos de 24 h de 72-96 h después de la infección. Este método permite una determinación confiable de los efectos de diferentes factores genéticos en la virulencia de la Leishmania . Como ejemplo, mostramos cómo una canceladura solo alelo del gene del transportador de hierro mitocondrial de Leishmania (LMIT1) perjudica la capacidad de la cepa mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 para crecer dentro de BMMs, que refleja una drástica reducción en la virulencia, en comparación con el tipo salvaje. Este ensayo también permite un control preciso de las condiciones experimentales, que pueden manipularse individualmente para analizar la influencia de diversos factores (nutrientes, especies reactivas de oxígeno, etcetera) en la interacción huésped-patógeno. Por lo tanto, la ejecución apropiada y cuantificación de los estudios de infección de BMM ofrecen una alternativa no invasiva, rápida, económica, segura y confiable a los estudios modelo animales convencionales.

Leishmania tiene dos formas infectantes - promastigotes métodos que diferencian de promastigotes procíclicas en la fase estacionaria de la cultura y los amastigotes, que son las etapas intracelulares (figura 1). En algunas especies de Leishmania como L. amazonensis, amastigotes puede también diferenciarse en cultivo axénico desplazando las células promastigote para bajar el pH (4.5) y elevada temperatura (32 ° C), condiciones simila...

Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

El objetivo general de este experimento es evaluar la virulencia de varias cepas de Leishmania a través de la infección in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea murina, y la posterior cuantificación de la cinética de crecimiento intracelular del parásito. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre los factores tanto del macrófago del huésped como del patógeno que determinan la virulencia de los parásitos infecciosos de Leishmania. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un método rápido, económico y fiable que requiere significativamente menos animales, en comparación con los estudios in vivo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la leishmaniasis, ya que se puede utilizar para evaluar la infectividad de las cepas de Leishmania mutadas o la eficacia de los compuestos terapéuticos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento de macrófagos derivados de la médula ósea y la cuantificación de parásitos intracelulares son difíciles de aprender solo con protocolos escritos. Comience asegurando un ratón hembra de cuatro a seis semanas de edad a una tabla de disección y desinfe

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Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Un ensayo parásito-rescate y la transformación con células THP1...

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Este video muestra una técnica de cuantificación in vitro para determinar la infección de macrófagos por Listeria monocytogenes mediante el ensayo de la unidad formadora de colonias. Las colonias bacterianas en la placa de agar representan la población bacteriana intracelular que escapa al mecanismo de defensa del huésped y sobrevive dentro de los macrófagos.

Cuantificación de la infección bacteriana en las células huésped mediante el ensayo de la unidad formadora de colonias

Este video investiga la virulencia de Leishmania mediante el tratamiento de macrófagos con promastigotes metacíclicos, lo que resulta en la formación de amastigotes intracelulares. La confirmación de la virulencia de Leishmania se logra mediante tinción con colorante fluorescente de ácido nucleico. Este conocimiento puede contribuir al desarrollo de nuevas terapias para la leishmaniasis.

Evaluación de la virulencia de Leishmania en macrófagos cultivados

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Este video muestra un ensayo para cuantificar Salmonella typhimurium citosólico y vacuolar dentro de macrófagos derivados de la médula ósea utilizando permeabilización diferencial. Los macrófagos están infectados con una proteína fluorescente que expresa Salmonella, que se internaliza dentro de una estructura vacuolar especializada llamada vacuola que contiene Salmonella o SCV. Un subconjunto de bacterias escapa del VCS y entra en el citosol. La membrana plasmática rica en colesterol de los...

Un ensayo para cuantificar Salmonella citosólica y vacuolar en macrófagos primarios infectados

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

En este trabajo presentamos una evaluación longitudinal de hámsters dorados infectados por vía intraperitoneal (IP) o intragingival (IG) con L. infantum-Luc mediante imagen bioluminiscente y por PCR. Los hámsters fueron evaluados 1 día después de la infección (1 dpi), 1 semana después de la infección (8 dpi) y 3 semanas después de la infección (22 dpi) y se les practicó la eutanasia a los 50dpi y 8 meses después de la infección.

In vivo Imágenes de hámsters infectados con Leishmania infantum mediante inoculación gingival de amastigotes axénicos que expresan luciferasa

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos...

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Aprende a cuantificar el crecimiento intracelular de Leishmania en macrófagos derivados de médula ósea murina. Este método rápido y confiable evalúa la virulencia parasitaria y reduce el uso de animales en investigación.

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania (Video) | JoVE Journal

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

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