Visualización y cuantificación de datos de citometría de alta dimensión mediante citorápido y los métodos de agrupación en clústeres ascendentes FlowSOM y Cytosplore
12 de diciembre de 2019
Cytofast es una herramienta de visualización utilizada para analizar la salida de la agrupación en clústeres. Cytofast se puede utilizar para comparar dos métodos de agrupación en clústeres: FlowSOM y Cytosplore. Cytofast puede generar rápidamente una visión cuantitativa y cualitativa de los datos de citometría de masa y resaltar las principales diferencias entre los diferentes algoritmos de agrupación en clústeres.
Los datos generados por la citometría de masas son complejos y deben visualizarse de manera eficiente y sencilla. Cytofast es un método que resalta los patrones inmunológicos dentro de la población de células inmunitarias y determina subconjuntos celulares que están vinculados a tratamientos clínicos o grupos experimentales. Cytofast se puede aplicar después de cualquier método de cristalización como FlowSOM o Cytosplore.
Le permitirá descubrir un subconjunto celular que están vinculados al tratamiento clínico o a un grupo experimental. Con este método, usted será capaz de ver la visión general inmunológica de los datos de un vistazo de una manera cuantitativa. Comience creando clústeres con Cytosplore o FlowSOM.
Si utiliza Cytosplore, cargue los archivos FCS haciendo clic en Archivos y abra los archivos FCS. A continuación, seleccione un cofactor para la transformación Arco hiperbólico cuando se le solicite y haga clic en Agregar etiqueta de muestra única como canal. Seleccione Ejecutar HSNE para ejecutar un nivel HSNE de tres y esperar a que se genere el mapa.
En el primer nivel de HSNE, compruebe las celdas que son positivas para CD161 seleccionando las celdas positivas CD161 y haciendo clic con el botón derecho en el zoom en la selección. En el segundo nivel, repita el procedimiento para alcanzar el tercer nivel con sólo eventos positivos CD161. Una vez que se genera el último mapa TSNE, guarde los clústeres definidos por Cytosplore haciendo clic con el botón derecho en el mapa y eligiendo guardar clústeres.
Elija el directorio de los archivos de salida según lo indique Cytosplore y observe esta ubicación porque más adelante se utilizará para cargar archivos FSC en R.Utilice un nombre de solo caracteres simple al cambiar el nombre de los archivos de salida, lo que facilitará la identificación y el manejo adicional y seleccione guardar. Cargue los archivos en R con la función designada readcytosploreFCS. Para limpiar los datos, elimine algunos parámetros como el tiempo y el fondo comprobando la posición de la columna relacionada con sus parámetros innecesarios y eliminándola de la matriz.
A continuación, reordene los marcadores para que los marcadores de linaje se muestren primero seguidos de marcadores funcionales. Vincule el archivo de metadatos a los datos generados desde Cytosplore cargando el metarchivo de hoja de cálculo que contiene información clínica. Para realizar la agrupación en clústeres mediante FlowSOM, cargue los datos sin procesar que anteriormente estaban cerrados en eventos positivos CD161 en R con la lectura.
función flowSet. Seleccione los marcadores biológicos relevantes seleccionando las columnas adecuadas y transformando los datos de una manera ArcSinh5. Aplique un cofactor de cinco eligiendo cofacter-5 en la función.
Agrupe los datos mediante la función FlowSOM y compare FlwoSOM y Cytosplore eligiendo agrupar los datos en 10 subconjuntos igual que la salida previamente yielded por Cytosplore. A continuación, asigne cada celda a su subconjunto identificado y a id de ejemplo.Cargue el archivo de metadatos en R que contiene la asignación de grupo y vincúlalo a los archivos FCS utilizando el código del manuscrito de texto. Cree una lista CF basada en la trama de datos obtenida de FlowSOM.
A continuación, reordene los marcadores para que aparezcan de forma similar a la salida del análisis de citosplore. Antes de crear los mapas de calor, genere la tabla de recuento por muestra mediante la función cellCount. Puesto que algunos clústeres contienen menos celdas que otros, escale los datos por clúster especificando scale-true dentro de la función, lo que facilita la vista de la dispersión entre muestras.
Visualice los datos con un mapa de calor y, a continuación, visualice con diagramas de cuadro generando el recuento de celdas, pero sin escalar los datos para obtener la frecuencia de cada clúster. Por último, visualice la intensidad de expresión de los marcadores CD45, CD11c y CD54 mediante los nombres de los marcadores de notificación e incluyéndolos en la función de trazado MSI. Cytofast ejecuta varias salidas posibles, incluido el mapa de calor de todos los clústeres identificados en el análisis y basados en la expresión del marcador.
El dendrograma en la parte superior representa la similitud jerárquica entre los clústeres identificados. El panel superior muestra otro mapa de calor que muestra la cantidad relativa de subconjuntos correspondientes en cada muestra. Mientras tanto, el dendrograma de la derecha muestra la similitud entre las muestras basadas en frecuencias de subconjuntos que demuestran que el fenotipo de las células asesinas naturales está formado por el tratamiento con PD-L1 tres días después de la inyección.
Los mapas de calor combinados se pueden obtener para FlowSOM seguidos de Cytofast y para Cytosplore seguidos de Cytofast. Cytofast también se puede utilizar para presentar los datos cuantitativamente y mostrar los resultados en gráficas de caja. Otra característica que se incluye en el paquete Cytofast es la función de trazado MSI que muestra la gráfica de intensidad de señal mediana de cada marcador por grupo.
Esta función permite la detección de cambios globales como aumentos en la expresión de CD54 o CD11c en células asesinas naturales del grupo tratado con PD-L1. Esta técnica es una forma rápida de visualizar y cuantificar datos y se puede utilizar para descubrir nuevas respuestas celulares después de la terapia. Después de este método, el paquete de prueba global en R se puede utilizar para probar un grupo de covariables para la asociación con variables de respuesta.
Esto mostrará la correlación entre cada subconjunto y el resultado clínico.
Visión general
Cytofast es una herramienta de visualización diseñada para analizar datos de citomewía masiva comparando métodos de agrupamiento como FlowSOM y Cytosplore. Proporciona una visión general rápida, tanto cuantitativa como cualitativa de los datos, destacando las diferencias entre los algoritmos de agrupamiento.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Citometría masiva
- Visualización de datos
- Análisis de agrupamiento
Antecedentes
- La citomewía masiva genera datos complejos que requieren una visualización eficiente.
- Cytofast identifica patrones inmunológicos dentro de poblaciones de células inmunes.
- Se puede aplicar después de métodos de agrupamiento como FlowSOM o Cytosplore.
- Entender los subconjuntos celulares vinculados a tratamientos clínicos es crucial para la investigación.
Propósito del estudio
- Proporcionar una herramienta para visualizar y cuantificar datos de citomewía masiva.
- Comparar diferentes métodos de agrupamiento de manera efectiva.
- Facilitar el descubrimiento de subconjuntos celulares relacionados con resultados clínicos.
Métodos utilizados
- Los grupos se crean utilizando Cytosplore o FlowSOM.
- Los datos se transforman y limpian en R para el análisis.
- Se realiza el agrupamiento y los resultados se visualizan a través de mapas de calor y gráficos de cajas.
- Se utiliza la función de gráfico MSI para detectar cambios globales en la expresión de marcadores.
Resultados principales
- Cytofast genera mapas de calor y dendrogramas para ilustrar los resultados de agrupamiento.
- Destaca el impacto de los tratamientos en los fenotipos de las células asesinas naturales.
- Los resultados cuantitativos se presentan a través de gráficos de cajas y gráficos MSI.
- La herramienta permite una visualización y cuantificación rápidas de las respuestas celulares.
Conclusiones
- Cytofast es una herramienta efectiva para analizar datos de citomewía masiva.
- Mejora la comprensión de los subconjuntos de células inmunes en relación con los tratamientos.
- El método apoya el descubrimiento de nuevas respuestas celulares después de la terapia.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Mass cytometry generates high-dimensional immune profiling data that require rapid visualization and quantification to support target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. Cytofast enables biopharma R&D teams to compare clustering outputs from FlowSOM and Cytosplore, facilitating hypothesis testing of immune cell subset responses to PD-L1 blockade. This accelerates go/no-go decisions by providing quantitative, reproducible readouts of NK cell activation and phenotypic shifts in the tumor microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking immune cell subsets to clinical treatments or experimental groups.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of cluster abundance and marker expression across conditions.
- Predictive Confidence: Enhances confidence in target mechanisms by visualizing PD-L1-induced changes in NK cell activation markers like CD54 and CD11c.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems from clustering outputs for downstream compound screening and biomarker evaluation.
- Reproducibility: Standardizes data transformation and cleaning steps (e.g., ArcSinh transformation, parameter removal) to ensure consistent inputs across experiments.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple samples and conditions via automated R-based workflows for heat maps, box plots, and MSI plots.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immune modulation in the tumor microenvironment, specifically NK cell responses to immunotherapy, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by quantifying immune subset frequencies and functional states prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying reproducible immunological patterns linked to therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
Cytofast integrates into the discovery continuum from early immune profiling through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven progression of immunotherapy candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying cell subsets associated with experimental groups or clinical outcomes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs (e.g., scaled cluster frequencies) for reliable compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides MSI plots and heat maps that quantify marker expression intensity and subset dispersion, enabling cross-condition comparisons.
- Translational Research: Connects immune phenotyping to preclinical continuity by linking NK cell activation states to immunotherapy mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical module applicable across multiple immunotherapy projects and immune monitoring campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune responses to checkpoint blockade.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through scripted R workflows and consistent preprocessing steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of immunotherapy targets through quantitative immune profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying immunological signatures of response that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry data analysis, R programming, and clustering interpretation (FlowSOM, Cytosplore, HSNE/t-SNE).
- Depends on instrumentation for CyTOF data acquisition and computational infrastructure for R-based processing and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies, marker panels, and metadata annotation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying workflows to different immune cell types, disease models, or therapeutic modalities beyond NK cells and PD-L1 blockade.
- Limited by the quality of upstream clustering and the need for manual optimization of parameters (e.g., cofactor, cluster number) in Cytosplore and FlowSOM steps.
