Visualización y cuantificación de datos de citometría de alta dimensión mediante citorápido y los métodos de agrupación en clústeres ascendentes FlowSOM y Cytosplore

Los datos generados por la citometría de masas son complejos y deben visualizarse de manera eficiente y sencilla. Cytofast es un método que resalta los patrones inmunológicos dentro de la población de células inmunitarias y determina subconjuntos celulares que están vinculados a tratamientos clínicos o grupos experimentales. Cytofast se puede aplicar después de cualquier método de cristalización como FlowSOM o Cytosplore.

Le permitirá descubrir un subconjunto celular que están vinculados al tratamiento clínico o a un grupo experimental. Con este método, usted será capaz de ver la visión general inmunológica de los datos de un vistazo de una manera cuantitativa. Comience creando clústeres con Cytosplore o FlowSOM.

Si utiliza Cytosplore, cargue los archivos FCS haciendo clic en Archivos y abra los archivos FCS. A continuación, seleccione un cofactor para la transformación Arco hiperbólico cuando se le solicite y haga clic en Agregar etiqueta de muestra única como canal. Seleccione Ejecutar HSNE para ejecutar un nivel HSNE de tres y esperar a que se genere el mapa.

En el primer nivel de HSNE, compruebe las celdas que son positivas para CD161 seleccionando las celdas positivas CD161 y haciendo clic con el botón derecho en el zoom en la selección. En el segundo nivel, repita el procedimiento para alcanzar el tercer nivel con sólo eventos positivos CD161. Una vez que se genera el último mapa TSNE, guarde los clústeres definidos por Cytosplore haciendo clic con el botón derecho en el mapa y eligiendo guardar clústeres.

Elija el directorio de los archivos de salida según lo indique Cytosplore y observe esta ubicación porque más adelante se utilizará para cargar archivos FSC en R.Utilice un nombre de solo caracteres simple al cambiar el nombre de los archivos de salida, lo que facilitará la identificación y el manejo adicional y seleccione guardar. Cargue los archivos en R con la función designada readcytosploreFCS. Para limpiar los datos, elimine algunos parámetros como el tiempo y el fondo comprobando la posición de la columna relacionada con sus parámetros innecesarios y eliminándola de la matriz.

A continuación, reordene los marcadores para que los marcadores de linaje se muestren primero seguidos de marcadores funcionales. Vincule el archivo de metadatos a los datos generados desde Cytosplore cargando el metarchivo de hoja de cálculo que contiene información clínica. Para realizar la agrupación en clústeres mediante FlowSOM, cargue los datos sin procesar que anteriormente estaban cerrados en eventos positivos CD161 en R con la lectura.

función flowSet. Seleccione los marcadores biológicos relevantes seleccionando las columnas adecuadas y transformando los datos de una manera ArcSinh5. Aplique un cofactor de cinco eligiendo cofacter-5 en la función.

Agrupe los datos mediante la función FlowSOM y compare FlwoSOM y Cytosplore eligiendo agrupar los datos en 10 subconjuntos igual que la salida previamente yielded por Cytosplore. A continuación, asigne cada celda a su subconjunto identificado y a id de ejemplo.Cargue el archivo de metadatos en R que contiene la asignación de grupo y vincúlalo a los archivos FCS utilizando el código del manuscrito de texto. Cree una lista CF basada en la trama de datos obtenida de FlowSOM.

A continuación, reordene los marcadores para que aparezcan de forma similar a la salida del análisis de citosplore. Antes de crear los mapas de calor, genere la tabla de recuento por muestra mediante la función cellCount. Puesto que algunos clústeres contienen menos celdas que otros, escale los datos por clúster especificando scale-true dentro de la función, lo que facilita la vista de la dispersión entre muestras.

Visualice los datos con un mapa de calor y, a continuación, visualice con diagramas de cuadro generando el recuento de celdas, pero sin escalar los datos para obtener la frecuencia de cada clúster. Por último, visualice la intensidad de expresión de los marcadores CD45, CD11c y CD54 mediante los nombres de los marcadores de notificación e incluyéndolos en la función de trazado MSI. Cytofast ejecuta varias salidas posibles, incluido el mapa de calor de todos los clústeres identificados en el análisis y basados en la expresión del marcador.

El dendrograma en la parte superior representa la similitud jerárquica entre los clústeres identificados. El panel superior muestra otro mapa de calor que muestra la cantidad relativa de subconjuntos correspondientes en cada muestra. Mientras tanto, el dendrograma de la derecha muestra la similitud entre las muestras basadas en frecuencias de subconjuntos que demuestran que el fenotipo de las células asesinas naturales está formado por el tratamiento con PD-L1 tres días después de la inyección.

Los mapas de calor combinados se pueden obtener para FlowSOM seguidos de Cytofast y para Cytosplore seguidos de Cytofast. Cytofast también se puede utilizar para presentar los datos cuantitativamente y mostrar los resultados en gráficas de caja. Otra característica que se incluye en el paquete Cytofast es la función de trazado MSI que muestra la gráfica de intensidad de señal mediana de cada marcador por grupo.

Esta función permite la detección de cambios globales como aumentos en la expresión de CD54 o CD11c en células asesinas naturales del grupo tratado con PD-L1. Esta técnica es una forma rápida de visualizar y cuantificar datos y se puede utilizar para descubrir nuevas respuestas celulares después de la terapia. Después de este método, el paquete de prueba global en R se puede utilizar para probar un grupo de covariables para la asociación con variables de respuesta.

Esto mostrará la correlación entre cada subconjunto y el resultado clínico.