Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable
5 de octubre de 2019
Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.
La medición de la impedancia eléctrica transepitelial se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y la función de barrera de las monocapas epiteliales en el cultivo celular. La técnica subyacente es una detección de cuatro terminales que utiliza diferentes pares de electrodos portadores de corriente y de detección de voltaje para realizar mediciones más precisas. Hay varios dispositivos disponibles comercialmente para medir la impedancia transepitelial, pero a pesar de la facilidad de uso y la alta fiabilidad, también hay algunas desventajas como la frecuencia de salida no traducible y su caro.
Por lo tanto, representamos cómo construir un volt-amperímetro rentable y programable. Al principio, queremos mostrar cómo funciona la medición TEER con dispositivos disponibles comercialmente. Para ello, habíamos cultivado una capa celular de células de papiloma epitelial del plexo plexo coroides en filtros Transwell con un tamaño de poro de tres micrómetros.
Este ajuste ha sido descrito por Schroten et al. como modelo in vitro de la barrera del líquido cerebrospinal en sangre. Ahora, un electrodo de palillo está conectado a un amperímetro epitelial de voltios.
El dispositivo está encendido y ajustado para medir la resistencia. El electrodo se esteriliza en 80%etanol y posteriormente se equilibra en un medio apropiado. La impedancia a medir servirá como valor de referencia para evaluar la fiabilidad del volt-amperímetro que se ensamblará después.
En este ejemplo, registramos una impedancia de 680 ohmios. Comencemos con el montaje de un medidor de voltios de bajo presupuesto con frecuencia de salida programable. En primer lugar, necesitará un cargador USB estándar y un cable de extensión USB como fuente de alimentación de corriente directa de cinco voltios.
Un microcontrolador de 8 bits en una placa de desarrollo USB se utilizará para generar una corriente de onda cuadrada. Cuatro cables con enchufes de plátano están conectados a dos multímetros estándar para medir el voltaje y la corriente. Asegúrese de que los multímetros son capaces de medir la corriente en una gama de algunos microamperios con TrueRMS.
Un conector RJ14 hembra se puede encontrar en los cables telefónicos estándar. Sólo asegúrese de que el conector tiene seis pines de los cuales al menos los cuatro internos están cableados. Por último, necesitará algunos equipos estándar, ya que nuestros cables, un terminal de brillo, una resistencia de 120 kiloohm, y algunas herramientas como decapantes de aislamiento, una herramienta de engarce, casquillos de extremo de alambre y soldador.
El dispositivo se monta exactamente como se ilustra en el diagrama de diseño. Al principio, la extensión USB está conectada al microcontrolador. Durante el funcionamiento normal, es alimentado por un cargador USB de CC de cinco voltios, que se puede conectar fácilmente a un ordenador personal para la programación.
Dos cables se despojan y engarzan con casquillos de extremo de alambre en un lado. El otro lado se suelda directamente al pin cero y dos del microcontrolador o a las asas de soldadura, que a su vez se sujetan en los pines respectivos. A continuación, los cables de alimentación se conectan a un terminal de brillo.
El primer multímetro se utilizará para medir la corriente y se conectará en serie con una resistencia de 120 kilomios y un electrodo de palillo que pasa corriente. Esta disposición garantiza que la corriente de salida es limitada, por lo que la medición no tendrá ningún impacto en la viabilidad de la célula. Los cuatro conductores del cable de extensión del teléfono se desmontan y se engarzan a férulas como se muestra anteriormente.
Una vez preparado el cable, tendrá que probar la continuidad de los conductores y pines. En nuestro ejemplo, los pines tres a seis están conectados al conductor blanco, marrón, verde y amarillo. Ahora el pin cinco y seis, que es verde y amarillo, están conectados al terminal de brillo para aplicar voltaje al par de electrodos exteriores.
Por último, tendrá que conectar el segundo multímetro, que se utilizará para medir la caída de tensión transepitelial, a los pines tres y cuatro, es decir, en nuestro ejemplo, al conductor blanco y marrón. Decidimos montar la instalación en un chasis de plástico barato. Antes del primer uso, el microcontrolador tiene que ser programado.
El código fuente está escrito en C+ y se puede cargar mediante un USB. En resumen, ancle cero en un modo de salida central. Cuando se enciende, el bucle de función comenzará a alternar como pines entre el suelo y más cinco voltios con un retardo variable.
En nuestro ejemplo, usamos un tiempo teórico de media oscilación de 40 milisegundos. Veamos cómo se comparan los resultados de la medición con los valores de referencia que habíamos obtenido antes. El electrodo palillo se reposiciona al amperímetro de voltios recientemente montado.
El dispositivo se enciende en tres pasos. Es decir, conectar un cargador USB, cambiar el multímetro izquierdo a la medición de voltaje de CA, y cambiar el segundo multímetro a microamperio. Preste atención, esa corriente alterna tiene que ser seleccionada explícitamente.
En este ejemplo, la caída potencial a través del sistema de filtro Transwell se mide como aproximadamente 25 milivoltios, mientras que registramos una corriente de 37,1 microamperios. Según la Ley de Ohm, la impedancia eléctrica se puede calcular fácilmente en 674 ohmios, que está muy cerca del valor de referencia de 680. Hemos demostrado que los valores de medición son fiables en un rango de cero a 1,8 kilomios.
Por lo tanto, el volt-amperímetro descrito se puede utilizar tanto para experimentos iniciales como para estudios posteriores. Sin embargo, si los resultados se publican, es posible que siempre desee apoyar sus datos, midiendo el flujo de moléculas a través de la capa celular respectiva.
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Descripción general
Este estudio presenta un método rentable para medir la impedancia eléctrica transepitelial utilizando un voltímetro-amperímetro programable diseñado para su uso con electrodos tipo palillos. Este enfoque mejora la accesibilidad de las mediciones de resistencia en monocapas epiteliales, que son fundamentales para evaluar la función de barrera en cultivos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Mediciones de impedancia eléctrica
- Evaluación de la función de barrera
Antecedentes
- La medición de la impedancia eléctrica transepitelial se ha utilizado desde la década de 1980 para evaluar monocapas epiteliales.
- Los dispositivos estándar para esta medición pueden ser costosos y quizás no ofrezcan frecuencias de salida adaptables.
- Este estudio presenta una alternativa asequible que mantiene la precisión y la fiabilidad.
Métodos Utilizados
- El ensamblaje de un voltímetro-amperímetro utilizando componentes electrónicos estándar.
- Células de papiloma epitelial del plexo coroideo cultivadas en filtros Transwell como sistema modelo.
- La implementación de la detección de cuatro terminales para mejorar la precisión de las mediciones.
Resultados principales
- El voltímetro-amperímetro ensamblado proporcionó lecturas de impedancia confiables, con valores medidos que coincidían estrechamente con los valores de referencia.
- Las mediciones de impedancia eléctrica mostraron un rango de fiabilidad entre 0 y 1,8 kiloohmios.
- Los resultados de las mediciones validaron la utilidad del dispositivo tanto para experimentos iniciales como para estudios posteriores.
Conclusiones
- Este estudio demuestra una solución factible y de bajo costo para realizar mediciones de resistencia eléctrica en cultivos celulares.
- Los hallazgos son significativos para el avance de técnicas en investigación biológica y la evaluación de propiedades de capas celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las soluciones rentables y programables para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) permiten evaluar de forma escalable la función de barrera epitelial, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos. Al proporcionar datos cuantitativos fiables de impedancia, este enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos de barreras hematoencefálica, hematoliquorrea, gastrointestinal y pulmonar. El método facilita la selección de carteras al reducir la incertidumbre biológica en los flujos de trabajo de identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la evaluación cuantitativa de la integridad de la barrera en modelos celulares relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos al correlacionar perturbaciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en la resistencia transepitelial.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar lecturas de impedancia reproducibles y programables por frecuencia que reflejan la formación de uniones estrechas y la salud de la monocapa.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona salidas estandarizadas y cuantitativas para evaluar los efectos de compuestos sobre la función de barrera en formatos compatibles con alto rendimiento.
- Valor operativo: Permite la reproducibilidad del ensayo mediante frecuencia de salida programable y detección de cuatro terminales, minimizando la variabilidad de las mediciones entre corridas.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en múltiples líneas celulares y formatos de Transwell debido al diseño de hardware de bajo costo y personalizable.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al proporcionar métricas de barrera relevantes para la enfermedad que predicen la permeabilidad in vivo y la integridad del tejido.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o descartar compuestos al identificar aquellos que alteran la función de la barrera en etapas tempranas del proceso.
- Alineación con Biomarcadores: Permite correlacionar los cambios en la RES con biomarcadores traslacionales de la salud epitelial y la modulación de las uniones estrechas.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de barreras preclínicas, permitiendo una progresión basada en datos funcionales de integridad epitelial.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al vincular intervenciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en la impedancia epitelial.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos y resultados cuantitativos de impedancia que permiten comparaciones confiables entre condiciones experimentales a través de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones precisas de resistencia (rango de 0–1,8 kΩ) y señales programables por frecuencia que facilitan la comparación estadística y la normalización de datos.
- Investigación Traducional: Establece continuidad preclínica mediante la modelización de sistemas de barrera humanos (por ejemplo, sangre-líquido cefalorraquídeo) con líneas celulares validadas.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad reutilizable y de bajo costo para la evaluación de la función de barrera en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en los mecanismos relacionados con las barreras.
- Valor operativo: Garantiza estandarización y reproducibilidad mediante control de frecuencia programable y una arquitectura de detección de cuatro terminales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir el ensamblaje interno de sistemas TEER confiables, reduciendo la dependencia de dispositivos comerciales costosos.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo al identificar tempranamente las deficiencias que alteran la barrera, mitigando los riesgos de abandono en fases avanzadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos de electrónica para el ensamblaje, incluyendo soldadura, prensado y pruebas de continuidad de cables y conectores personalizados.
- Depende del acceso a una placa de desarrollo USB, un microcontrolador de 8 bits, multímetros estándar con capacidad de microamperios TrueRMS y una resistencia de 120 kΩ para limitar la corriente.
- Necesita la estandarización entre equipos en la preparación de electrodos, la equilibración del medio y el momento de las mediciones para garantizar resultados reproducibles.
- Requiere adaptar las técnicas de posicionamiento y estabilización de electrodos tipo palillos cuando se aplican a diferentes tamaños de poro en Transwell o a distintos grosores de monocapas celulares.
- Limitado a mediciones de impedancia dentro del rango de 0–1,8 kΩ; los sistemas con mayor resistencia pueden requerir ajustes en la resistencia limitadora de corriente o en la ganancia del amplificador.
