Name: Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a medir impedancia transepitelial con un voltímetro-amperímetro programable de bajo costo. Este método utiliza células epiteliales de plexo coroideo y sensado de cuatro terminales para evaluar la función de barrera en cultivos celulares con precisión confiable.

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Los autores quieren agradecer a Herman Liggesmeyer y Marvin Bende por su asesoramiento experto en electrotecnia e informática.

1. Montaje de un antímetro de voltios básico para la medición TEER
<ol><li>Prepare un cargador USB estándar como la fuente de alimentación D.C. de 5 V, un cable de extensión USB, un microcontrolador que se utilizará como un generador de onda cuadrada programable, dos multímetros estándar que son capaces de medir la corriente alterna y el voltaje como cuadrado medio de la raíz ( True-RMS), cuatro cables con enchufes de plátano, un cable de extensión de teléfono con un conector hembra RJ14 que incluye seis pines con el interior de cuatro cableados (6P4C), dos cables cortos, un terminal de brillo, un prerresistencia de 120 k, casquillos de extremo de alambre y asas de soldadura. Las herramientas necesarias son un stripper de aislamiento, una herramienta de engarce y un soldador.</li>
	<li>En primer lugar, conecte la extensión USB a la placa del microcontrolador.</li>
	<li>Desmonte el aislamiento final de dos cables cortos. Soldar un lado por cable directamente a los pines 0 y 2 del microcontrolador o a las asas de soldadura, que a su vez se sujetan en los pines respectivos. Engarzar los otros extremos hasta las férulas del extremo del alambre y conéctelos a un terminal de brillo como se muestra en la Figura 1.</li>
	<li>Conecte los enchufes del plátano a los multímetros. Tira y engarza el otro extremo de cada uno de los cuatro cables.</li>
	<li>Cortar el cable de extensión del teléfono en dos piezas y desmontar y engarzar los conductores del lado que contiene el conector hembra. Compruebe la continuidad de los conductores y pasadores.</li>
	<li>El primer multímetro se utilizará para medir la corriente en aA (tenga en cuenta que el modo AC tiene que ser configurado explícitamente). Conéctelo en una serie con un prerresistencia de 120 ko a los pines cinco y seis del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos exteriores del electrodo de palillo.</li>
	<li>Finalmente, conecte el segundo multímetro, que se utilizará para medir la caída de tensión transepitelial en mV, a través del terminal de brillo a los pines tres y cuatro del conector RJ14, correspondiente al par de electrodos internos del electrodo de palillo.</li>
	<li>Si lo desea, monte la instalación en un chasis.</li>
</ol>2. Programación del microcontrolador
<ol><li>Modifique el código fuente proporcionado (archivo de codificación suplementario 1) según sea necesario. En la forma dada, los pines 0 y 2 alternarán entre el suelo y +5 V con 40 ms de medio tiempo de oscilación. Por lo tanto, se generará una señal de onda cuadrada con una amplitud de 5 V y una frecuencia de aproximadamente 12,5 Hz. Los valores reales pueden diferir debido a la inexactitud del emisor de tiempo del microcontrolador.</li>
	<li>Conecte el microcontrolador a un ordenador de sobremesa a través de un puerto USB y cargue el código fuente con el software correspondiente25.</li>
</ol>3. Registro de osciloscopios de tensión (opcional)
<ol><li>Los pines de derivación de cinco y seis del conector RJ14 con una resistencia de prueba de 1 k y se conectan a un osciloscopio.</li>
	<li>Compruebe la frecuencia, el voltaje máximo y la forma de onda. Digitalice y exporte los datos.</li>
	<li>Si lo desea, registre los oscilogramas desde un dispositivo de referencia (EVOM) y el voltímetro automontado para su comparación. NOTA: En este caso, los datos se registraron con un alcance de almacenamiento digital HM 208. Al ser un osciloscopio digital muy básico, la imagen podía digitalizarse internamente (congelada) pero tenía que ser trazada usando una grabadora analógica PM 8143 X-Y. La imagen fue escaneada posteriormente.</li>
</ol>4. Cultivo celular y medición teRE
<ol><li>Células de Pajoma del Plexo Humano de semillas (HIBCPP) en insertos de filtro de cultivo celular con un tamaño de poro de 3 m en DMEM/F12 (ver Tabla de Materiales)que contiene 10% de suero de becerro fetal9. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera saturada de agua que contenga 5% co2 como se describe en la cena y otros9.</li>
	<li>Cuando los filtros alcancen una impedancia de 70 cm2,cambie a DMEM/F12 sin suero y defina el punto de tiempo como Día 0.</li>
	<li>Conecte el electrodo al puerto RJ14 del voltímetro automontado y conecte la fuente de alimentación USB. Ajuste los multímetros al modo de voltaje de CA (mV) y al modo de corriente de CA (A), respectivamente.<ol>
<li>Alternativamente, conecte el electrodo a un dispositivo de referencia disponible comercialmente y enciéndalo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esterilice el electrodo en 80% de etanol durante 10 min y equilibre en el medio apropiado durante otros 10 minutos.</li>
	<li>Coloque el electrodo en ambos compartimentos de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular (la parte más larga del electrodo en el compartimiento inferior y la parte más corta en el compartimento superior) que contenga una capa de celda HIBCPP hasta que los valores de medición permanezcan constantes.</li>
	<li>Para un dispositivo de referencia, anote la impedancia directamente o calcule la impedancia de acuerdo con la ley de Ohm (R - U / I) para el voltímetro automontado. Tenga en cuenta que el ángulo del electrodo afecta a las mediciones.</li>
	<li>Repita la medición TEER (pasos 3 a 6) desde el día 0 hasta el día 4.</li>
</ol>

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<li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia u otros conflictos de intereses.

Antes de que un voltímetro hecho a sí mismo se pueda utilizar en una rutina diaria, es esencial comprobar el dispositivo para el correcto funcionamiento. En nuestro caso, se programó un medio tiempo de oscilación de 40 ms (12,5 Hz), pero el tiempo de oscilación efectivo resultó ser 60 ms (16,7 Hz). Esta imprecisión del emisor de tiempo del microcontrolador no tuvo ningún impacto detectable en las mediciones TEER. Podría ser mejor determinar la frecuencia real usando el ajuste de frecuencia de uno de los multímetros. Si s...

Las células epiteliales y endoteliales funcionan como límites celulares, separando los lados apical y basolateral del cuerpo. Si están conectados a través de uniones estrechas, la difusión pasiva de sustancias a través de los espacios paracelulares está restringida1,lo que resulta en la formación de una barrera selectivamente permeable. Se han desarrolladovarios sistemas de barrera artificial 2 utilizando células endoteliales microvasculares (HBMEC, barrera hematoencefálica3,4,5,6,7), plexo coroideo células epiteliales (HIBCPP/PCPEC, barrera de líquido cefalorraquídeo8,9,10,11,12,13,14), Células de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2, modelos gastrointestinales15),o líneas de células de las vías respiratorias/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estos sistemas suelen consistir en células cultivadas en monocapa sobre membranas permeables (es decir, sistemas de inserción de filtros) para permitir el acceso a los lados apical y basolateral. Es importante que la integridad del sistema modelo coincida con las condiciones in vivo. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para analizar la función de barrera midiendo la difusión paracelular de compuestos trazadores a través de la capa celular. Estas sustancias incluyen sacarosa radioetiquetada, albúmina con etiqueta de tinte, inulina etiquetada por FITC o dextrans2con etiqueta de tinte. Sin embargo, los dedos químicos pueden hacer que las células sean inutilizables para más experimentos. Para monitorizar los sistemas de barrera de forma no invasiva, se puede utilizar la medición de la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) a través de una monocapa celular2,18,19. Debido a que los sistemas de electrodos bipolares están influenciados por la impedancia de polarización de electrodos en la interfaz electrodo-electrolito, las mediciones tetrapolares se utilizan generalmente para superar esta limitación20. La técnica de subsistencia es una sensación de cuatro terminales (4T) que fue descrita por primera vez en 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. En resumen, la corriente es inyectada por un par de electrodos portadores de corriente, mientras que un segundo par de electrodos de detección de voltaje se utiliza para medir la caída de tensión20. Hoy en día, los llamados electrodos de palillo consisten en un par de electrodos dobles, cada uno de los cuales contiene un pellet de plata/cloruro de plata para medir la tensión y un electrodo de plata para pasar corriente2. La impedancia eléctrica se mide entre el compartimento apical y el compartimento basolateral con la capa celular en el medio (Figura 1). Una señal de onda cuadrada a una frecuencia de típicamente 12,5 Hz se aplica en los electrodos exteriores y se mide la corriente alterna resultante (AC). Además, la caída potencial a través de la capa celular se mide por el segundo par de electrodos (interno). La impedancia eléctrica se calcula de acuerdo con la ley de Ohm. Los valores de TEER se normalizan multiplicando la impedancia y el área de la superficie de la capa celular y se expresan típicamente como á cm2.
Hay sistemas en los que las células y los electrodos están dispuestos de una manera más sofisticada, pero también se basan en el principio de medición 4T y se pueden utilizar con los mismos dispositivos de medición. Los sistemas EndOhm, por ejemplo, en los que se inserta el filtro, contienen una cámara y una tapa con un par de electrodos concéntricos con la misma estructura que el electrodo de palillo. La forma de los electrodos permite un flujo de densidad de corriente más uniforme a través de la membrana, reduciendo así la variación entre las lecturas. Aún más complejo (pero también más preciso) es una cámara Ussing, donde una capa celular separa dos cámaras llenas con la solución de Ringer22. La cámara en sí puede ser gaseado con oxígeno, CO2,o N2, y agitado o complementado con sustancias experimentales. A medida que se produce el transporte iónico a través de la capa celular, una diferencia potencial se puede medir mediante dos electrodos de detección de voltaje cerca del tejido. Esta tensión se cancela mediante dos electrodos portadores de corriente colocados junto a la capa de celda. La corriente medida dará entonces el transporte iónico neto y la resistencia transepitelial, que refleja la integridad de la barrera, se puede determinar22. La medición TEER también se puede aplicar en sistemas de cuerpo en un chip que representan los modelos de tejido barrera23,24. Estos sistemas imitan las condiciones in vivo de las células y a menudo consisten en varios tipos de células, apiladas una encima de la otra en capas.
El siguiente protocolo explica cómo configurar un voltímetro rentable y fiable con frecuencia de salida programable que no produce diferencias estadísticamente significativas en TEER en comparación con los sistemas de medición disponibles en el mercado.

<table><tbody><tr>Resistencia de <td></td><td></td><td>120 kOhm</td><td>Equipos generales (genéricos)</td></tr><tr>Cables <td></td><td></td> de<td>enchufe tipo banana</td><td>Equipos generales (genéricos)</td></tr><tr><td>Cables</td><td></td><td></td><td>Equipos generales (genéricos)</td></tr><tr><td>Electrodo de</td><td>palillo Merck Millicell</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de palillo (alternativo)</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td><td>de crimpado</td><td>Herramienta general</td></tr><tr><td>Digispark / ATtiny85</td><td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td><td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco (Thermo Fisher)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)/Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Insertos filtrantes 3&micro; m translúcido</td><td>Greiner Bioone</td><td>662631</td><td></td></tr><tr><td>HIBCPP</td><td></td><td></td><td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td></tr><tr><td>Decapante</td><td></td><td></td> de aislamiento <td>Herramienta general</td></tr><tr><td>Terminal de brillo Equipos</td><td></td><td></td><td>generales (genéricos)</td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>HAMEG</td><td>Visor de almacenamiento digital HM 208</td><td></td></tr><tr><td>Plotter</td><td>PHILIPS</td><td>PM 8143 Registrador X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Software Arduino https://www.arduino.cc</td><td></td><td>Arduino 1.8.9</td><td></td></tr><tr><td>Soldador</td><td></td><td></td><td>Herramienta general</td></tr><tr><td>Terminales de soldadura</td><td>Equipos generales (genéricos</td><td></td><td></td>)</tr><tr><td>Cable telefónico con conector</td><td></td><td></td> RJ14 (6P4C) <td>Equipos generales (genéricos)</td></tr><tr><td>Resistencia de prueba</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX04</td><td></td></tr><tr><td>Multímetros de verdadero valor eficaz</td><td>VOLTCRAFT</td><td>VC185</td><td></td></tr><tr><td>Cargador USB Equipo</td><td></td><td></td><td>general (genérico)</td></tr><tr><td>Cable</td><td></td><td></td> de extensión USB <td>Equipo general (genérico)</td></tr><tr><td>Voltohmímetro para medición TEER</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>EVOM</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmmetro para medición TEER (alternativa)</td><td>Merck Millicell</td><td>ERS</td><td></td></tr><tr><td>Casquillos</td><td></td><td></td> de extremo de cable <td>Equipos generales (genéricos)</td></tr></tbody></table>

un enfoque simple para realizar mediciones teer utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

La resistencia eléctrica transepitelial/endotelial (TEER) se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y permeabilidad de los sistemas de modelos de barrera in vitro. En la mayoría de los casos, los electrodos de palillo se utilizan para determinar la impedancia eléctrica entre el compartimento superior e inferior de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular que contiene monocapas celulares. La membrana del filtro permite que las células se adhieran, polaricen e interactúen mediante la construcción de uniones estrechas. Esta técnica se ha descrito con una variedad de diferentes líneas celulares (por ejemplo, células de la barrera hematoencefálica, barrera del líquido hematoencefálico, o tracto gastrointestinal y pulmonar). Los dispositivos de medición TEER se pueden obtener fácilmente de diferentes proveedores de equipos de laboratorio. Sin embargo, hay soluciones más rentables y personalizables imaginables si un voltímetro adecuado se autoensambla. El objetivo general de esta publicación es configurar un dispositivo fiable con frecuencia de salida programable que se pueda utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para la medición TEER.

Para comparar el funcionamiento de un voltímetro autoensamblado con su contraparte disponible comercialmente, se registró un oscilograma de voltaje de ambos dispositivos.
Como se muestra en la Figura 2A, el instrumento de referencia generó una señal de onda cuadrada con una amplitud de 80 mV y un tiempo de oscilación de 80 ms, que corresponde a una frecuencia de 12,5 Hz, cuando se opera en carga...

Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.

Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

La medición de la impedancia eléctrica transepitelial se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y la función de barrera de las monocapas epiteliales en el cultivo celular. La técnica subyacente es una detección de cuatro terminales que utiliza diferentes pares de electrodos portadores de corriente y de detección de voltaje para realizar mediciones más precisas. Hay varios dispositivos disponibles comercialmente para medir la impedancia transepitelial, pero a pesar de la facilidad de uso y la alta fiabilidad, también hay algunas desventajas como la frecuencia de salida no traducible y su caro.Por lo tanto, representamos cómo construir un volt-amperímetro rentable y programable. Al principio, queremos mostrar cómo funciona la medición TEER con dispositivos disponibles comercialmente. Para ello, habíamos cultivado una capa celular de células de papiloma epitelial del plexo plexo coroides en filtros Transwell con un tamaño de poro de tres micrómetros.Este ajuste ha sido descrito por Schroten et al. como modelo in vitro de la barrera del líquido cerebrospinal en sangre. Ahora, un electrodo de palillo está conectado a un amperímetro epitelial de voltios.El dispositivo está encendido y ajustado para medir la resistencia. El electrodo se esteriliza en 80%etanol y posteriormente se equilibra en un medio apropiado. La impedancia a medir servirá como valor de referencia para evaluar la fiabilidad del volt-amperímetro que se ensamblará después.En este ejemplo, registramos una impedancia de 680 ohmios. Comencemos con el montaje de un medidor de voltios de bajo presupuesto con frecuencia de salida programable. En primer lugar, necesitará un cargador USB estándar y un cable de extensión USB como fuente de alimentación de corriente directa de cinco voltios.Un microcontrolador de 8 bits en una placa de desarrollo USB se utilizará para generar una corriente de onda cuadrada. Cuatro cables con enchufes de plátano están conectados a dos multímetros estándar para medir el voltaje y la corriente. Asegúrese de que los multímetros son capaces de medir la corriente en una gama de algunos microamperios con TrueRMS.Un conector RJ14 hembra se puede encontrar en los cables telefónicos estándar. Sólo asegúrese de que el conector tiene seis pines de los cuales al menos los cuatro internos están cableados. Por último, necesitará algunos equipos estándar, ya que nuestros cables, un terminal de brillo, una resistencia de 120 kiloohm, y algunas herramientas como decapantes de aislamiento, una herramienta de engarce, casquillos de extremo de alambre y soldador.El dispositivo se monta exactamente como se ilustra en el diagrama de diseño. Al principio, la extensión USB está conectada al microcontrolador. Durante el funcionamiento normal, es alimentado por un cargador USB de CC de cinco voltios, que se puede conectar fácilmente a un ordenador personal para la programación.Dos cables se despojan y engarzan con casquillos de extremo de alambre en un lado. El otro lado se suelda directamente al pin cero y dos del microcontrolador o a las asas de soldadura, que a su vez se sujetan en los pines respectivos. A continuación, los cables de alimentación se conectan a un terminal de brillo.El primer multímetro se utilizará para medir la corriente y se conectará en serie con una resistencia de 120 kilomios y un electrodo de palillo que pasa corriente. Esta disposición garantiza que la corriente de salida es limitada, por lo que la medición no tendrá ningún impacto en la viabilidad de la célula. Los cuatro conductores del cable de extensión del teléfono se desmontan y se engarzan a férulas como se muestra anteriormente.Una vez preparado el cable, tendrá que probar la continuidad de los conductores y pines. En nuestro ejemplo, los pines tres a seis están conectados al conductor blanco, marrón, verde y amarillo. Ahora el pin cinco y seis, que es verde y amarillo, están conectados al terminal de brillo para aplicar voltaje al par de electrodos exteriores.Por último, tendrá que conectar el segundo multímetro, que se utilizará para medir la caída de tensión transepitelial, a los pines tres y cuatro, es decir, en nuestro ejemplo, al conductor blanco y marrón. Decidimos montar la instalación en un chasis de plástico barato. Antes del primer uso, el microcontrolador tiene que ser programado.El código fuente está escrito en C+ y se puede cargar mediante un USB. En resumen, ancle cero en un modo de salida central. Cuando se enciende, el bucle de función comenzará a alternar como pines entre el suelo y más cinco voltios con un retardo variable.En nuestro ejemplo, usamos un tiempo teórico de media oscilación de 40 milisegundos. Veamos cómo se comparan los resultados de la medición con los valores de referencia que habíamos obtenido antes. El electrodo palillo se reposiciona al amperímetro de voltios recientemente montado.El dispositivo se enciende en tres pasos. Es decir, conectar un cargador USB, cambiar el multímetro izquierdo a la medición de voltaje de CA, y cambiar el segundo multímetro a microamperio. Preste atención, esa corriente alterna tiene que ser seleccionada explícitamente.En este ejemplo, la caída potencial a través del sistema de filtro Transwell se mide como aproximadamente 25 milivoltios, mientras que registramos una corriente de 37,1 microamperios. Según la Ley de Ohm, la impedancia eléctrica se puede calcular fácilmente en 674 ohmios, que está muy cerca del valor de referencia de 680. Hemos demostrado que los valores de medición son fiables en un rango de cero a 1,8 kilomios.Por lo tanto, el volt-amperímetro descrito se puede utilizar tanto para experimentos iniciales como para estudios posteriores. Sin embargo, si los resultados se publican, es posible que siempre desee apoyar sus datos, midiendo el flujo de moléculas a través de la capa celular respectiva.

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