Un ensayo rápido y específico de microplacas para la Determinación de ascorbato intra y extracelular en células cultivadas

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los niveles de ascorbato intracelular o extracelular en células cultivadas o aisladas. Esto se logra incubando extractos de células o células enteras con una puntuación oxidasa para agotar selectivamente una puntuación BA en los pasos siguientes. En el primer método, los extractos celulares se incuban con cianuro para generar ferrocianuro de una manera dependiente del ascorbato, lo que da una representación directa de la cantidad de ascorbato en los extractos.

A continuación, se determina la cantidad de ferrocianuro formado en los extractos celulares oxidando cuantitativamente el ferrocianuro con hierro férrico añadido para formar hierro ferris con el fin de generar un complejo cromogénico de hierro dos ferne S que se puede cuantificar espectrofotométricamente. En el segundo método, todas las células se incuban directamente con el quelante de hierro ferne S y citrato férrico. Los resultados muestran diferencias en los niveles de ascorbato intracelular o extracelular en función de la reducción cuantitativa y específica de los complejos de hierro extracelular que se pueden detectar.

Espectrométrico. La principal ventaja de la técnica actual sobre los métodos que ya existen, como la detección basada en HBLC, es que este ensayo de microplaca altamente específico se puede llevar a cabo muy rápidamente y todas las muestras y patrones se pueden procesar en paralelo en lugar de en serie antes de comenzar este procedimiento. Cultivar K 5 62 células en suspensión y crear en una partitura BA que contiene extracto celular.

Después de esto, prepare una solución madre de ácido ascórbico 10 milimolar en PBS helado. A continuación, prepare cuidadosamente una serie de patrones de ascorbato entre cero y 20 micromolares. Retire con cuidado cuatro alícuotas de 100 microlitros de cada patrón y agréguelas a una secuencia horizontal de pozos.

En una placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene 25 microlitros por pocillo de PBS o 45,5 unidades por mililitro. La solución madre de L ascorbato oxidasa o AO en PBS cubre la placa de 96 pocillos con papel de aluminio y orbital. Mézclalo a 550 RPM a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Cuando termine, agregue 50 microlitros de cianuro de Ferris de potasio de 3.5 milimolares en PBS a todos los pocillos para obtener una concentración final de cianuro de Ferris de un milimolar después de la mezcla orbital de la placa de 96 pocillos, usando las mismas condiciones que antes. Agregue inmediatamente 25 microlitros de una solución recién construida que contenga 50% de ácido acético y 30% de ácido tricloroacético. A continuación, agregue 100 microlitros de una solución de determinación de cianuro Pharaoh recién preparada a cada orbital de pozo.

Mezcle el plato en la oscuridad a 550 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego lea los valores de absorbancia de los pozos a 593 nanómetros. Para comenzar el ensayo.

En primer lugar, oxidar el ascorbato extracelular en pocillos seleccionados añadiendo 50 microlitros de 120 unidades por mililitro de AO o HBSD a pocillos pareados por triplicado para obtener una concentración final de AO de 10 unidades por mililitro. Siguiendo esta etiqueta, los pozos emparejados como menos AO y más ao. Después de mezclar las placas con una mezcla orbital suave durante cinco minutos a 37 grados centígrados, agregue 50 microlitros de Ferne S de 2,4 milimolares a todos los pocillos para obtener una concentración final de Ferne S de 200 micromolares, mezcle las placas como se indica anteriormente durante cinco minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, agregue 50 microlitros de citrato férrico de 120 micromolares recién preparado a todos los pocillos para obtener concentraciones finales de hierro y citrato de 10 micromolares y 50 micromolares de citrato respectivamente. Mezcle bien al final del ensayo FLX de ascorbato. Aspire rápidamente el medio suprayacente de cada pocillo y agréguelo a los pocillos debidamente etiquetados en una placa de 24 pocillos.

A continuación, se añadan tres alícuotas de microlitros del sobrenadante a una placa de 96 pocillos para determinar el ascorbato extracelular. Lea los valores de absorbancia de los pocillos a 593 nanómetros en un espectrofotómetro de microplacas. Finalmente, calcule la cantidad de ascorbato extracelular como m de ascorbato por miligramo de proteína mostrado.

Esta es una curva estándar típica para un conjunto de patrones de ascorbato, de cero a 20 micromolares o de cero a dos NMO de ascorbato por pocillo. De la placa de 96 pocillos, aunque no se muestra aquí, la linealidad se mantiene hasta ocho NMO ascorbato por pocillo, lo que corresponde a una concentración de ascorbato de la muestra de aproximadamente 80 micromolares. El ensayo se puede utilizar para detectar con éxito niveles de ascorbato por debajo de 0,25 ole ascorbato por pocillo.

Las células K 5 62 acumulan rápidamente ascorbato intracelular a partir del ácido ascórbico dehidro L extracelular, pero no ascorbato. En este experimento representativo, se incubaron 62 células K 5 lavadas con PBS con 500 micromolares de ácido ascórbico dehidro L, ácido ascórbico dehidro L más 50 micromolares de ascorbato B más cinco milímetros de cianuro o ascorbato más 50 unidades por mililitro de AO durante 30 minutos a 37 grados Celsius. El ascorbato intracelular se determinó como se describió anteriormente.

La captación de ácido ascórbico Dehydro L por parte de las células K 5 62 se produce mediante el transporte facilitador del transportador de glucosa mediado por glúteos para evaluar la participación de los glúteos en la captación de ácido ascórbico Dehydro L. En este experimento representativo, se incubaron 62 células K 5 con concentraciones crecientes de cito-B o dihidro-cito-B antes de la incubación con ácido ascórbico dehidro L. Es importante tener en cuenta que, mientras que tanto la citocallina B como el dihidrocitocito-B inhiben los procesos móviles a concentraciones micromolares, solo la citollamada B, que difiere del dihidro-cito-B por la presencia de un solo doble enlace, inhibe el transporte dependiente de los glúteos a bajas concentraciones micromolares.

Por lo tanto, como dehidro L la captación de ácido ascórbico fue inhibida por el citoto B con un IC 50 de menos de 2,5 micromolares, pero no fue inhibida por el dihidrocitocito. B dehydro. La absorción de ácido L ascórbico probablemente ocurre por transporte mediado por glúteos.

Alternativamente, las células lavadas se expusieron a concentraciones crecientes del análogo de glucosa tres O metil D glucosa transportable pero no metabolizable en glúteos o el isómero estéreo de glucosa no transportable en glúteos L glucosa durante la incubación con ácido ascórbico dehidro L. Una vez más, los resultados indican la participación de la glu en la importación de ácido ascórbico dehidro L, ya que la inhibición de la acumulación intracelular de ascorbato ocurre solo en presencia del análogo de glucosa transportable en los glúteos. En el segundo ensayo.

Se puede determinar la tasa de eflujo de ascorbato de las células cultivadas. Este ensayo específico es importante ya que la liberación de ascorbato de las células parece ser crucial para la absorción celular regulada por ascorbato de hierro no unido a transferrina por parte de las células. La absorción de hierro no unido a transferrina se considera relevante para la fisiopatología de los trastornos de sobrecarga de hierro, como la hemocromatosis, así como para el intercambio de hierro y la homeostasis de las neuronas astrocitarias en el cerebro de los mamíferos.

De hecho, el principal neurotransmisor excitador L glutamato desencadena la liberación de ascorbato para los astrocitos de una manera que depende del glutamato L, la absorción por el vidrio y probablemente el GLT uno y la posterior hinchazón celular que desencadena la liberación de ascorbato por los VSO putativos. De manera análoga, la liberación de astrocitos cargados con una puntuación A B puede ser estimulada por el aminoácido excitador L aspartato, pero no por el aminoácido no excitador L glutamina. Este efecto se muestra aquí, que muestra curvas de dosis-respuesta para la estimulación de la liberación de ascorbato por aspartato y glutamina de cultivos primarios de astrocitos de ratón cargados con ascorbato una vez dominados.

Esta técnica se puede realizar en tan solo dos horas si se realiza correctamente.