Name: Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a determinar la afinidad de unión de citoquinas a sus receptores y medir los efectos de péptidos inhibidores mediante ELISA. Este método accesible y económico facilita el estudio de interacciones proteína-proteína.

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Agradecemos al Prof. J. Stelling (Departamento de Ciencia y Tecnología de Biosistemas, ETH Zurich e Instituto Suizo de Bioinformática, Basilea, Suiza) por su revisión crítica del manuscrito.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Para preparar tampón de recubrimiento de carbonato, se disuelven 0,36 g de Na 2 CO 3 y 0,84 g de NaHCO3 en 100 ml de agua destilada; filtro estéril de la memoria intermedia mediante el uso de un vacío impulsado 0,22 micras polietersulfona (PES) filtro de membrana y se almacena a temperatura ambiente hasta su uso. </li><li> Preparar la solución de lavado mediante la adición de 0,05% v / v de Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Preparar un 5% albúmina de suero bovino (BSA) (solución de bloqueo) en solución PBS disolviendo 5 g de BSA (≥98%) en 100 ml de PBS y se almacena a 4 ° C. </li><li> Recombinante del receptor, los ligandos y los péptidos de bloqueo <ol><li> Reconstitutethe subunidad recombinante humana receptor de la interleucina alfa (IL28RA) y ligandos recombinantes con cola de histidina de IFN humano (IFNL1-3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacenar a -80 ° C. Sintetizar el bloqueo de péptidos y se utiliza como se ha descrito previamente 4. Utilice PBS para preparar diferentes concentraciones de ligandos y péptidos para uso en los ensayos. </li></ol></li><li> Para preparar el anticuerpo primario, se diluye 6x Su anticuerpo monoclonal de ratón en PBS con 0,1% de BSA en dilución 1: 1000. Para preparar el anticuerpo secundario, se diluye con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de ratón (H + L) en PBS con 0,1% de BSA en dilución 1: 10.000. </li><li> Preparar la solución de TMB mediante la mezcla de los reactivos A y B de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar la solución de parada añadiendo 5 N de ácido sulfúrico (H 2 SO 4) en agua destilada y se almacena a temperatura ambiente. </li></ol> 2. inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA Ensayos) NOTA: La interacción directa ligando-receptor ELISA (directa LRA, Figura 1) se puede utilizar para medir la constante de disociación del receptor-ligando (K D), como una medida de la afinidad de unión receptor-ligando. La interacción competencia ligando-receptor ELISA (LRA competencia, la Figura 2) todosOWS de detección de péptidos (y otros compuestos de bloqueo), que actúan para interferir con la interacción entre ligando y receptor. El protocolo básico que fue previamente publicada el 5 ha optimizado aún más. NOTA: En ambos ELISA métodos utilizan pipeta multicanal para añadir soluciones a los pocillos de la placa de 96 pocillos en cada paso. En decantación solución o etapas de lavado, tirar las soluciones directamente en el fregadero. <ol><li> Ligando-receptor-Interacción directa de ensayo (directa LRA) NOTA: Para ver una ilustración del flujo de trabajo (ver Figura 1). <ol><li> Placa de recubrimiento con receptor recombinante <ol><li> Diluir el receptor recombinante en tampón de carbonato a una concentración final de 100 ng / l. recubrir los pocillos de placa de microtitulación de 96 pocillos con una concentración de receptor fija (100 ng / l) pipeteando 100 l a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Excluir paredes exteriores de la placa para evitar así artefacto borde. Cubrir la placa con una tapa e incubar laplaca a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> El bloqueo y la adición de ligandos <ol><li> Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento por la inclinación de la placa contra el fregadero y lavar la placa 3 veces con solución de lavado (PBS + 0,05% v v Tween / 20). </li><li> Bloquear los sitios de unión al receptor libres en la placa recubierta con 200 l de solución de BSA 5% a cada pocillo usando una pipeta multicanal y se incuba la placa durante 2 horas a RT. </li><li> Descartar la solución de bloqueo (vea el paso 2.1.2.1.) Y lavar la placa 3 veces con solución de lavado. </li><li> Preparar el recombinante marcada con His ligandos a diferentes concentraciones (por ejemplo, 8 g / ml, 4 mg / ml, 2 mg / ml, 1 mg / ml, 0,5 g / ml, 0.25 g / ml, 0,125 g / ml, 0,063 g / ml, 0,031 mg / ml, 0,0 mg / ml) en PBS. Agregue sólo PBS en los pocillos de blanco. </li><li> Añadir 100 l de cada concentración de ligando a los pocillos por duplicado y se incuba la placa durante 2 horas a RT permitiendo receptor-ligandoInteracción. </li></ol></li><li> La incubación con anticuerpos <ol><li> Después de la incubación con los ligandos, lavar la placa 3 veces con solución de lavado. </li><li> Pipetear 100 l de su anti-solución primaria anticuerpo monoclonal de ratón (1: 1000) a cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 2 h; Después de la incubación, desechar la solución de anticuerpos (véase el paso 2.1.2.1.) y lavar la placa 3 veces con solución de lavado. </li><li> Añadir 100 l de HRP de cabra acoplados solución de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (1: 10.000) a cada pocillo. Incubar la placa durante 45 min a TA. </li><li> Descartar la solución de anticuerpo (véase el paso 2.1.2.1.) Y lavar la placa 3 veces con solución de lavado. </li></ol></li><li> La adición de sustrato y el Desarrollo <ol><li> Llevar las soluciones de sustrato TMB a TA y preparar la solución de sustrato TMB A y B en la proporción de 1: 1. Añadir 100 l de sustrato recién preparada a cada pocillo y mantener la placa a temperatura ambiente durante 15-30 min. Después de suficientes col<html> o el desarrollo de añadir la solución de parada 50 l. </li></ol></li><li> La lectura de la placa y Análisis de Datos NOTA: El protocolo descrito se basa en la suposición de que la señal medida se eleva de unión específica. Puede ser que sea necesario para estimar la contribución de la unión no específica a la señal, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de este protocolo. <ol><li> Leer la absorbancia (densidad óptica, OD) directamente a 450 nm. </li><li> Restar la señal de fondo a partir de los valores de DO medidos y normalizarlos. Transformar todos los valores de la concentración de ligando a escala logarítmica (base 10, log 10). </li><li> Representar gráficamente los normalizado y corrección de fondo a los valores de DO (eje Y, corresponde a la fracción de sitios de unión del receptor de ocupados) frente al logaritmo de la concentración de ligando (eje X, ingrese 10 escala). </li><li> Para estimar el valor KD, ajustar los datos a la siguiente forma de la ecuación de Hill: tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; NOTA: Aquí Y denota la fracción de sitios de unión de los receptores ocupados e Y max la unión máxima; [L] indica la concentración de ligando libre y el coeficiente de Hill. Si sólo hay un sitio de unión para el ligando, el coeficiente de Hill es n = 1. Para sistemas con sitio de unión a más de un ligando, la unión exposiciones cooperatividad positiva si n&gt; 1, cooperatividad negativa si n &lt;1 y no cooperatividad si n = 1. la constante de disociación microscópico se denomina y corresponde a la mitad de la máxima concentración efectiva CE 50 6. La constante de disociación aparente es Kd ​​= (KD) n. En el caso más simple, donde n = 1, la constante de disociación corresponde a la concentración de ligando a la que la mitad de los sitios de unión del receptor están ocupados y K d = K D. Este modelo supone la acción de masas de unión en condiciones de equilibrio, así como que sólo una pequeña fracción deel ligando añadido se une al receptor, es decir, [L] &gt;&gt; [RL]. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> Figura 1. Un ensayo directo ligando-receptor de la interacción (directa LRA). Protocolo paso a paso para LRA directa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Competencia ligando-receptor-Interacción de ensayo (la competencia LRA) NOTA:. Para una ilustración del flujo de trabajo ver Figura 2 El procedimiento de concurso LRA sigue los mismos pasos que el LRA directa (recubrimiento de la placa, de anticuerpos de incubación, el desarrollo de la placa) a excepción de los cambios importantes en el ligando y péptidos etapa de adición. controles negativos apropiados son esenciales para este ensayo. En un estudio de cribado anterior &lt;sup&gt; 4, el péptido bloqueo revueltos no mostró efectos antagónicos. <ol><li> El bloqueo - La adición de ligandos y Péptidos de bloqueo <ol><li> Al día siguiente, se retira la solución de recubrimiento y lavar la placa (véase 2.1.2.1). </li><li> Bloquear la placa revestida por la adición de 200 l de solución de BSA 5% a cada pocillo y se incuba la placa durante 2 horas a RT. </li><li> Preparar los ligandos recombinantes con cola de histidina (IFNL1-3) a una concentración fija (2x-20 ng / ml) en PBS. </li><li> Preparar el péptido de bloqueo (véase la tabla 3) con diferentes concentraciones que variaban de 10 nM a 100 mM en PBS para garantizar una curva de dosis-respuesta. NOTA: Esto permite la posterior determinación del valor IC50 para el bloqueo péptido. En pocillos de control, añadir la concentración de ligando solamente fija sin péptido para obtener el máximo (100%) de unión. En el espacio en blanco, agregar sólo PBS sin ligando o péptido. </li><li> Añadir 50 l de los ligandos (IFNL1-3) y 50 l de cada peconcentración ptide a los pocillos en los duplicados. </li><li> Incubar la placa durante 2 horas a RT. </li></ol></li><li> La lectura de la placa de datos y análisis NOTA: El protocolo descrito se basa en la suposición de que la señal medida se eleva de unión específica. Puede ser que sea necesario para estimar la contribución de la unión no específica a la señal, pero esto está fuera del ámbito de aplicación de este protocolo. <ol><li> Leer la absorbancia (densidad óptica, OD) directamente a 450 nm. </li><li> Restar la señal de fondo a partir de los valores de DO medidos y normalizarlos. Transformar todos los valores de la concentración de péptido a escala logarítmica (base 10, log 10). </li><li> Representar gráficamente los normalizado y corrección de fondo a los valores de DO (eje Y, corresponde a la fracción de sitios de unión del receptor de ocupados) frente al logaritmo de la concentración de ligando (eje X, ingrese 10 escala). </li><li> Para estimar el valor IC 50, ajustar los datos a la ecuación siguiente: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> NOTA: Aquí [P] es la concentración de péptido y la pendiente de Hill. La pendiente de Hill describe la pendiente de la curva dosis-respuesta. El IC 50 corresponde a la concentración de inhibidor a la que se observó 50% de inhibición de la unión entre ligando y receptor. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> Figura 2. Competencia ensayo ligando-receptor de la interacción (la competencia LRA). Protocolo paso a paso para la competencia LRA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

A.E. fue apoyado por subvenciones de investigación del programa «SNSF Ambizione Score» (PZ00P3_154709), «Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte» de la Universidad de Basilea, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel y Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. reconoce el apoyo de una beca iPhD de la iniciativa SystemsX.ch en el programa de biología de sistemas (9ª convocatoria).

ELISA es un estándar y un método bien establecido para muchos laboratorios. Hemos modificado y mejorado aún más un método publicado previamente 5,7. El protocolo demostrado paso a paso muestra cómo se puede utilizar de una manera sencilla para determinar los valores K D de interacciones ligando-receptor. Además, el IC50 de un péptido de bloqueo que interfiere con la interacción ligando-receptor puede ser determinada. Las principales ventajas son la configuración rápida,...

Una comprensión completa de las vías de señalización requiere un conocimiento detallado acerca de la interacción ligando-receptor. La mayoría de los métodos para evaluar la interacción de un ligando particular con su receptor específico son caros, intensiva consume tiempo, trabajo y requieren equipo y la experiencia 1 específico. Este artículo describe dos protocolos rápidos y fiables punto por punto para investigar la interacción ligando-receptor basado en una enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA): el ensayo de interacción ligando-receptor directo (LRA) y el LRA competencia. ELISA es una técnica altamente sensible, específica y fácilmente disponible, que se utiliza de forma rutinaria en casi todos los laboratorios. ELISA se puede realizar y adaptada de varias maneras. Los protocolos presentados están optimizados para la investigación de la interacción entre diferentes interferones lambda (infls) y su receptor. El LRA directa permite una quantificatien de unión ligando-receptor con respecto a la concentración de ligando y por lo tanto produce una curva de unión. El uso de un modelo apropiado para la interacción ligando-receptor, los datos pueden ser analizados para estimar la constante de disociación (K D). En el protocolo presentado, la ecuación de Hill de uso común se aplica al modelo de la unión de ligando-receptor. Aunque otros métodos tales como la tecnología de resonancia de plasmón de superficie 2,3 permiten la determinación de las afinidades de unión entre dos proteínas, esta tecnología es a menudo un trabajo intensivo, costoso y requiere un equipo especial de laboratorio. El LRA competencia permite el cribado de péptidos inhibidores de: la unión ligando-receptor se cuantifica con respecto a la concentración de péptido. Esto produce una curva de dosis-respuesta que describe el efecto inhibitorio del péptido. Los datos pueden ser analizados para estimar la media máxima concentración inhibitoria (IC 50 </sub&gt;) del péptido de bloqueo. Ambos protocolos de ELISA son fáciles de usar y pueden adaptarse a una amplia gama de temas de investigación. Las proteínas recombinantes de cualquier tipo se pueden utilizar para determinar de forma fiable y rápido de las partes de interacción. Además, el LRA competencia puede ser utilizado para determinar los sitios de interacción crítica de ligandos y receptores mediante el uso de péptidos de bloqueo, que están diseñados para imitar el ligando o el receptor. Si el péptido de bloqueo muestra la inhibición eficiente y específica, el péptido se encuentra en un sitio crítico interacción del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos del receptor) o del ligando (si los compuestos peptídicos miméticos el ligando). El primer protocolo describe la determinación K D valor de diferentes infls y la subunidad alfa de su receptor, es decir, el receptor de la interleucina-28 (IL28RA) utilizando el directo LRA. A continuación, el segundo protocolo se muestra cómo determinar la capacidad de un péptido largo de 20 amino ácido parainhibir las interacciones INFL-IL28RA. El péptido está diseñado para competir con IFNLs en su sitio de unión al receptor y por lo tanto permite una comprensión molecular de la interacción. Además, este péptido puede ser usado para bloquear IL28RA en experimentos in vitro para determinar el impacto sobre los efectos de señalización corriente abajo 4.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>Plato de ELISA</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>Para el tampón de recubrimiento de la placa ELISA</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>Para el tampón de recubrimiento de la placa ELISA</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>5% BSA en PBS para Bloqueo</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Receptor alfa recombinante de interleucina-28 humana</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Interleucina-29 humana recombinante/Libre de portador/Etiqueta His C-terminal</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Interleucina-28A humana recombinante/Libre de portador/Etiqueta His C-terminal</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Interleucina-28B humana recombinante/Libre de portador/Etiqueta His C-terminal</td></tr><tr><td>6x His Monoclonal antibody (Mouse)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Anticuerpo primario para capturar Ligandos marcados con His</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reagent set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>Solución de sustrato TMB para ELISA</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>H2SO4 5 N (Solución de parada de reacción enzimática)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Microplate reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>Lector de placas ELISA</td></tr></tbody></table>

un elisa basado encuadernación y método competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Una comprensión integral de las vías de señalización requiere un conocimiento detallado sobre la interacción ligando-receptor. Este artículo describe dos protocolos rápidos y confiables punto por punto de ensayos de inmunoabsorción enlazada a enzimas (ELISA) para la investigación de interacciones ligando-receptor: el ensayo de interacción directa ligando-receptor (LRA) y el LRA de competición. Como estudio de caso, se presenta el análisis basado en ELISA de la interacción entre diferentes interferones lambda (IFNL) y la subunidad alfa de su receptor (IL28RA): el LRA directo se utiliza para la determinación de las constantes de disociación (valores de KD) entre el receptor y los ligandos del IFN, y el LRA de competición para la determinación de la capacidad inhibidora de un oligopéptido, que fue diseñado para competir con los IFNL en su sitio de unión al receptor. Se describen los pasos analíticos para estimar los valores de KD y la concentración inhibitoria media (IC50). Finalmente, la discusión destaca las ventajas y desventajas del método presentado y cómo los resultados permiten una mejor comprensión molecular de las interacciones ligando-receptor.

Las constantes de disociación entre INFL1-3 y su subunidad alfa del receptor de IL28RA se determinaron utilizando el directo LRA. Los resultados se muestran en la Figura 3: La fracción de sitios de unión ocupados se representa frente al logaritmo de la respectiva concentración de IFN. La representación de Scatchard de los datos se muestra en la esquina inferior derecha. Los resultados ilustran que el LRA directa produce una curva de unión, que puede ser analizada más a e...

Los protocolos presentados describen dos técnicas basadas en el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la investigación rápida de interacciones ligando-receptor: El primer ensayo permite la determinación de la constante de disociación entre ligando y receptor. El segundo ensayo permite una detección rápida de péptidos bloqueadores para las interacciones ligando-receptor.

Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Los objetivos de este método basado en ELISA son primero determinar la afinidad de unión de una citocina a su receptor y, segundo, medir los efectos de bloqueo de péptidos inhibitorios de la interacción ligando-receptor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones proteína-proteína, como la unión citocina-receptor. Las afinidades de unión y el bloqueo de estas pueden aumentar la comprensión general de la dinámica de interacción.La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, genera receptores marcados y es relativamente económico, debido al fácil acceso a equipos disponibles como el lector ELISA. Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción citocina-receptor, también puede aplicarse a otros sistemas como las interacciones proteína-proteína generales y el diseño de compuestos bloqueadores para inhibir las interacciones específicas. Prepare las soluciones como se describe en el protocolo del texto.Asegúrese de filtrar el tampón de recubrimiento de carbonato con una membrana de PES de 0.22 micrones. Utilice un vacío. Además, haga 10 concentraciones diferentes de cada ligando o péptido.Hay dos ensayos descritos en este video, el primero es la interacción directa ligando-receptor, ELISA. Se puede utilizar para medir la constante de disociación receptor-ligando, que representa la afinidad de unión receptor-ligando. El segundo ensayo es un ELISA recientemente optimizado de interacción ligando-receptor en competición.Esto permite la selección de péptidos y otros compuestos bloqueadores, que actúan para interferir con la interacción receptor-ligando. Para mayor eficiencia, prepare el uso de pipetas multicanal para placas de 96 pocillos y, al decantar, simplemente vacíe su contenido. Comience este procedimiento recubriendo la placa con un receptor recombinante.Primero, diluya el receptor en tampón de carbonato a 100 nanogramos por microlitro. Luego, cargue los pozos de la placa con 100 microlitros de solución de receptor. Excluya las paredes exteriores para evitar lidiar con el artefacto del borde de la placa.Cubra la placa e incúbela a 4 grados Celsius durante la noche. Realice todas las incubaciones de la placa con suave agitación. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con la solución de lavado, PBS con un toque de Tween 20.A continuación, bloquee los sitios de unión receptor libre añadiendo 200 microlitros de 5%PSA. Deje que la placa se incube durante dos horas a temperatura ambiente para completar el bloqueo. Más tarde, vacíe los pozos y lave la placa como antes.Ahora, cargue los pozos con 100 microlitros de las varias diluciones de ligando recombinante his-tag. Cargue cada concentración en duplicado. Cargue los pozos en blanco con PBS solo.Luego, incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación con los ligandos, lave la placa tres veces con la solución de lavado. Luego, pipetee 100 microlitros de alicuotas de anticuerpo monoclonal anti-his de ratón primario en cada pozo e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas.Después de lavar el anticuerpo, a cada pozo, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IGG acoplado a HRP. Envuelva la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, incube la placa durante 45 minutos a temperatura ambiente.Utilice la técnica de lavado estándar para eliminar el anticuerpo secundario. Ahora, a cada pozo, agregue 100 microlitros de TMB recién preparado hecho de cantidades iguales de soluciones de sustrato de stock A y B. Luego, mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Luego, después de un desarrollo de color suficiente, agregue 50 microlitros de solución de stock a cada pozo.El protocolo se basa en la suposición de que la señal medida se eleva a partir de la unión específica. Puede ser necesario estimar la contribución de la unión no específica a la señal. Luego, lea los valores de absorbancia de la placa a 450 nanómetros y proceda con el cálculo del valor de KD.El procedimiento de LRA por competencia sigue los mismos pasos que el procedimiento de LRA directo, excepto por algunos cambios importantes. Después de lavar los ligandos de recubrimiento excesivos de la placa, bloquee los pozos de la placa. Agregue 200 microlitros de solución de 5%BSA a cada pozo e incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente.Durante la incubación, prepare los ligandos recombinantes his-tag a una concentración fija de 10 nanogramos por mililitro en PBS. Luego, prepare el péptido bloqueador a diferentes concentraciones en PBS, que van desde 10 nanomolares a 100 micromolares para garantizar una curva dosis-respuesta. Por lo tanto, se puede encontrar el valor de IC50 para el péptido bloqueador.En los pozos de control, cargue la concentración fija de ligando sin péptido para derivar la unión máxima. En los pozos en blanco, agregue solo PBS sin ligando ni péptido. En los otros pozos, agregue 50 microlitros de los ligandos y 50 microlitros de cada concentración de péptido.Luego, incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente y proceda como de costumbre. Las constantes de disociación entre tres diferentes péptidos ligando del interferón y el subunidad receptor alfa IL28R-a se determinaron utilizando el LRA directo, la fracción de sitios de unión ocupados se trazó contra el logaritmo de la respectiva concentración de interferón. Estos resultados ilustran una curva de unión que se puede analizar para estimar el valor de KD ajustando los datos a la ecuación de Hill.Un gráfico de Scatchard ilustra la cooperativa en la unión del ligando, en última instancia, el ligando del interferón 1 tiene la mayor afinidad de unión, seguido por el ligando del interferón 2 y el ligando del interferón 3. El valor del coeficiente de Hill mayor que 1 sugiere una mayor afinidad por ligandos adicionales después de la interacción inicial ligando-receptor. Luego, se utilizó LRA competitivo para cuantificar el impacto de un péptido bloqueador en la interacción entre los péptidos ligando del interferón y la subunidad receptora.La fracción de sitios de unión ocupados para un péptido ligando del interferón a 10 nanogramos por mililitro se trazó contra el log de la concentración del péptido del interferón. A partir de estos datos, se estimaron los valores de IC50. Según los valores calculados, el péptido bloqueador inhibió la interacción entre el ligando del interferón 3 e IL28R-a en la mayor medida.Una vez dominada, esta técnica, se puede hacer en ocho horas. Si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada concentración de saturación de unión ligando-receptor, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para obtener valores de KD más detallados.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de las interacciones ligando-receptor para explorar sustancias inhibitorias para bloquear estas interacciones.

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Investigación

JoVE Journal

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Química

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