Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

Los objetivos de este método basado en ELISA son primero determinar la afinidad de unión de una citocina a su receptor y, segundo, medir los efectos de bloqueo de péptidos inhibitorios de la interacción ligando-receptor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones proteína-proteína, como la unión citocina-receptor. Las afinidades de unión y el bloqueo de estas pueden aumentar la comprensión general de la dinámica de interacción.

La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, genera receptores marcados y es relativamente económico, debido al fácil acceso a equipos disponibles como el lector ELISA. Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción citocina-receptor, también puede aplicarse a otros sistemas como las interacciones proteína-proteína generales y el diseño de compuestos bloqueadores para inhibir las interacciones específicas. Prepare las soluciones como se describe en el protocolo del texto.

Asegúrese de filtrar el tampón de recubrimiento de carbonato con una membrana de PES de 0.22 micrones. Utilice un vacío. Además, haga 10 concentraciones diferentes de cada ligando o péptido.

Hay dos ensayos descritos en este video, el primero es la interacción directa ligando-receptor, ELISA. Se puede utilizar para medir la constante de disociación receptor-ligando, que representa la afinidad de unión receptor-ligando. El segundo ensayo es un ELISA recientemente optimizado de interacción ligando-receptor en competición.

Esto permite la selección de péptidos y otros compuestos bloqueadores, que actúan para interferir con la interacción receptor-ligando. Para mayor eficiencia, prepare el uso de pipetas multicanal para placas de 96 pocillos y, al decantar, simplemente vacíe su contenido. Comience este procedimiento recubriendo la placa con un receptor recombinante.

Primero, diluya el receptor en tampón de carbonato a 100 nanogramos por microlitro. Luego, cargue los pozos de la placa con 100 microlitros de solución de receptor. Excluya las paredes exteriores para evitar lidiar con el artefacto del borde de la placa.

Cubra la placa e incúbela a 4 grados Celsius durante la noche. Realice todas las incubaciones de la placa con suave agitación. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con la solución de lavado, PBS con un toque de Tween 20.

A continuación, bloquee los sitios de unión receptor libre añadiendo 200 microlitros de 5%PSA. Deje que la placa se incube durante dos horas a temperatura ambiente para completar el bloqueo. Más tarde, vacíe los pozos y lave la placa como antes.

Ahora, cargue los pozos con 100 microlitros de las varias diluciones de ligando recombinante his-tag. Cargue cada concentración en duplicado. Cargue los pozos en blanco con PBS solo.

Luego, incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación con los ligandos, lave la placa tres veces con la solución de lavado. Luego, pipetee 100 microlitros de alicuotas de anticuerpo monoclonal anti-his de ratón primario en cada pozo e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de lavar el anticuerpo, a cada pozo, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IGG acoplado a HRP. Envuelva la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, incube la placa durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Utilice la técnica de lavado estándar para eliminar el anticuerpo secundario. Ahora, a cada pozo, agregue 100 microlitros de TMB recién preparado hecho de cantidades iguales de soluciones de sustrato de stock A y B. Luego, mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Luego, después de un desarrollo de color suficiente, agregue 50 microlitros de solución de stock a cada pozo.

El protocolo se basa en la suposición de que la señal medida se eleva a partir de la unión específica. Puede ser necesario estimar la contribución de la unión no específica a la señal. Luego, lea los valores de absorbancia de la placa a 450 nanómetros y proceda con el cálculo del valor de KD.

El procedimiento de LRA por competencia sigue los mismos pasos que el procedimiento de LRA directo, excepto por algunos cambios importantes. Después de lavar los ligandos de recubrimiento excesivos de la placa, bloquee los pozos de la placa. Agregue 200 microlitros de solución de 5%BSA a cada pozo e incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente.

Durante la incubación, prepare los ligandos recombinantes his-tag a una concentración fija de 10 nanogramos por mililitro en PBS. Luego, prepare el péptido bloqueador a diferentes concentraciones en PBS, que van desde 10 nanomolares a 100 micromolares para garantizar una curva dosis-respuesta. Por lo tanto, se puede encontrar el valor de IC50 para el péptido bloqueador.

En los pozos de control, cargue la concentración fija de ligando sin péptido para derivar la unión máxima. En los pozos en blanco, agregue solo PBS sin ligando ni péptido. En los otros pozos, agregue 50 microlitros de los ligandos y 50 microlitros de cada concentración de péptido.

Luego, incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente y proceda como de costumbre. Las constantes de disociación entre tres diferentes péptidos ligando del interferón y el subunidad receptor alfa IL28R-a se determinaron utilizando el LRA directo, la fracción de sitios de unión ocupados se trazó contra el logaritmo de la respectiva concentración de interferón. Estos resultados ilustran una curva de unión que se puede analizar para estimar el valor de KD ajustando los datos a la ecuación de Hill.

Un gráfico de Scatchard ilustra la cooperativa en la unión del ligando, en última instancia, el ligando del interferón 1 tiene la mayor afinidad de unión, seguido por el ligando del interferón 2 y el ligando del interferón 3. El valor del coeficiente de Hill mayor que 1 sugiere una mayor afinidad por ligandos adicionales después de la interacción inicial ligando-receptor. Luego, se utilizó LRA competitivo para cuantificar el impacto de un péptido bloqueador en la interacción entre los péptidos ligando del interferón y la subunidad receptora.

La fracción de sitios de unión ocupados para un péptido ligando del interferón a 10 nanogramos por mililitro se trazó contra el log de la concentración del péptido del interferón. A partir de estos datos, se estimaron los valores de IC50. Según los valores calculados, el péptido bloqueador inhibió la interacción entre el ligando del interferón 3 e IL28R-a en la mayor medida.

Una vez dominada, esta técnica, se puede hacer en ocho horas. Si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada concentración de saturación de unión ligando-receptor, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para obtener valores de KD más detallados.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de las interacciones ligando-receptor para explorar sustancias inhibitorias para bloquear estas interacciones.