Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

Los objetivos de este método basado en ELISA son, en primer lugar, determinar la afinidad de unión de una citocina a su receptor y, en segundo lugar, medir los efectos de bloqueo de los péptidos inhibidores de la interacción ligando-receptor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones proteína-proteína, como la unión citocina-receptor. Las afinidades de unión y el bloqueo de estas pueden aumentar la comprensión general de la dinámica de interacción.

La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, genera receptores de etiquetas y es relativamente barata, debido al fácil acceso de un lector ELISA fácilmente disponible. Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción del receptor de citocinas, también se puede aplicar a otros sistemas, como las interacciones generales proteína-proteína y el diseño de compuestos bloqueantes para inhibir las interacciones específicas. Prepare las soluciones como se describe en el protocolo de texto.

Asegúrese de filtrar el tampón de recubrimiento de carbonato con una membrana PES de 0,22 micras. Usa una aspiradora. Además, haga 10 concentraciones diferentes de cada ligando o péptido.

Hay dos ensayos descritos en este video, el primero es la interacción directa del receptor del ligando, ELISA. Se puede utilizar para medir la constante de disociación receptor-ligando, que representa la afinidad de unión receptor-ligando. El segundo ensayo es un ELISA de interacción ligando-receptor de competición recientemente optimizado.

Esto permite la detección de péptidos y otros compuestos bloqueantes, que actúan para interferir con la interacción receptor-ligando. Para mayor eficiencia, prepárese para usar pipetas multicanal para placas de 96 pocillos y, al decantar, simplemente descargue su contenido. Comience este procedimiento recubriendo la placa con un receptor recombinante.

Primero, diluya el receptor en tampón de carbonato a 100 nanogramos por microlitro. Luego, cargue los pocillos de la placa con 100 microlitros de solución receptora. Excluya las paredes exteriores para evitar tratar con el artefacto del borde de la placa.

Cubra la placa e incube a 4 grados centígrados durante la noche. Realice todas las incubaciones de placas con un suave remolino. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con la solución de lavado, PBS con un toque de Tween 20.

A continuación, bloquee los sitios de unión del receptor libre añadiendo 200 microlitros de PSA al 5%. Deje que la placa se incube durante dos horas a temperatura ambiente para completar el bloque. Más tarde, vacíe los pozos y lave el plato como antes.

Ahora, cargue los pocillos con 100 microlitros de las diversas diluciones de ligando recombinante his-tag. Cargue cada concentración por duplicado. Cargue los pozos en blanco solo con PBS.

Luego, incuba la placa durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación con los ligandos, lave la placa tres veces con solución de lavado. A continuación, pipetear 100 alícuotas de microlitros de anticuerpo monoclonal primario anti-his de ratón en cada pocillo e incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de lavar el anticuerpo, agregue a cada pocillo 100 microlitros de solución secundaria de anticuerpos IGG anti-ratón de cabra acoplada a HRP. Envuelva el plato con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, incuba la placa durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Utilice la técnica de lavado estándar para eliminar el anticuerpo secundario. Ahora, a cada pocillo, agregue 100 microlitros de TMB recién preparado hecho con cantidades iguales de soluciones de sustrato madre A y B. Luego, mantenga el plato a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Luego, después de un desarrollo de color suficiente, agregue 50 microlitros de solución madre a cada pocillo.

El protocolo se basa en la suposición de que la señal mensajeada se genera a partir de un enlace específico. Puede ser necesario estimar la contribución de la unión no específica a la señal. A continuación, lea los valores de absorbancia de la placa a 450 nanómetros y proceda a calcular el valor KD.

El procedimiento de competencia de los LRA sigue los mismos pasos que el procedimiento directo de los LRA, excepto por algunos cambios importantes. Después de lavar el exceso de ligandos de recubrimiento de la placa, bloquee los pozos de la placa. Agregue 200 microlitros de solución de BSA al 5% a cada pocillo e incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente.

Durante la incubación, prepare los ligandos recombinantes his-tag a una concentración fija de 10 nanogramos por mililitro en PBS. A continuación, prepare el péptido bloqueante a diferentes concentraciones en PBS, que van desde 10 nanomolares hasta 100 micromolares para garantizar una curva dosis-respuesta. Por lo tanto, se puede encontrar el valor IC50 para el péptido bloqueador.

En los pozos de control, cargue la concentración fija de ligando sin péptido para derivar la unión máxima. En los pocillos en blanco, agregue solo PBS sin ligando ni péptido. En los otros pocillos, agregue 50 microlitros de los ligandos y 50 microlitros de cada concentración de péptido.

Luego, incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente y proceda como de costumbre. Las constantes de disociación entre tres péptidos ligando de interferón diferentes y la subunidad del receptor alfa IL28R-a se determinaron utilizando el LRA directo, la fracción de sitios de unión ocupados se traza contra el logaritmo de la concentración de interferón respectiva. Estos resultados ilustran una curva de enlace que puede analizarse para estimar el valor de KD ajustando los datos a la ecuación de Hill.

Un diagrama de Scatchard ilustra la cooperatividad en la unión de ligandos, en última instancia, el ligando de interferón 1 tiene la mayor afinidad de unión, seguido por el ligando de interferón 2 y el ligando de interferón 3. El valor del coeficiente de Hill de más de 1 sugiere una mayor afinidad por ligandos adicionales después de la interacción inicial del receptor del ligando. A continuación, se utilizó LRA competitivo para cuantificar el impacto de un péptido bloqueante en la interacción entre los péptidos del ligando de interferón y la subunidad receptora.

La fracción de sitios de unión ocupados para un péptido de ligando de interferón a 10 nanogramos por mililitro se traza contra el logaritmo de la concentración del péptido de interferón. A partir de estos datos, se estimaron los valores de IC50. De acuerdo con los valores calculados, el péptido bloqueante inhibió en mayor medida la interacción entre el ligando interferón 3 y la IL28R-a.

Una vez dominada esta técnica, se puede realizar en ocho horas. Si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada concentración de saturación de unión al receptor del ligando, siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos similares para obtener valores de KD más detallados.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones ligando-receptor exploraran sustancias inhibidoras para bloquear estas interacciones.