Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

L'objectif général de cette procédure est d'analyser les niveaux d'expression génique de cellules souches embryonnaires humaines individuelles à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel après transcription inverse en une cellule unique, ou R-T-P-C-R. Cette analyse est réalisée en premier lieu par tri cellulaire activé par fluorescence afin de séparer des cellules individuelles dans chaque puits d'une plaque 96 puits contenant un tampon de lyse cellulaire. La deuxième étape consiste à rétrotranscrire l'ARN afin de générer de l'ADNc à partir de lysats cellulaires uniques.

Ensuite, l'ADNc est amplifié par réaction en chaîne par polymérase. La dernière étape consiste à effectuer une RT-PCR quantitative sur l'ADNc amplifié. En définitive, ce dosage est utile pour l'étude de l'expression génique dans des populations hétérogènes telles que les cellules souches embryonnaires humaines.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux systèmes artificiels quantitatifs unicellulaires existants réside dans le fait que cette méthode est plus robuste que l'EEG avant la purification par fax. Les cellules souches embryonnaires humaines OCT4-EGFP ou Hess sont détachées de la boîte de 60 millimètres. Éliminer tout le milieu, ajouter un millilitre d'Accutase et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Neutralisez l'Accutane avec un millilitre de milieu ES humain centrifugé pour former un culot cellulaire, puis après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les cellules dans un tampon fax et ajustez la concentration à 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, faites passer l'échantillon cellulaire à travers un tube conique muni d'un tamis cellulaire de 35 µm. Conservez le tube sur de la glace avant le tri cellulaire.

Commencez cette procédure en préparant un mélange maître contenant un microlitre de D Ns unicellulaire et neuf microlitres de solution de lyse unicellulaire. Pour chaque puits, transférez 10 microlitres du mélange dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits destinée au programme d'analyse par fax. Utilisez le trieur cellulaire pour trier les cellules EGFP positives uniques dans les puits de la plaque PCR 96 puits. Après le tri cellulaire, incubez les échantillons cinq minutes à température ambiante pour permettre la lyse cellulaire. Pour arrêter la réaction de lyse, ajoutez un microlitre de solution d'arrêt et incubez deux minutes à température ambiante.

Pour commencer cette procédure, ajouter d'abord dans chaque puits de la plaque de 96 puits 0,5 microlitre d'Eloqua contenant des amorces SMAT 15 et SMAA à 20 micromolaire. Chauffer les échantillons à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis ajouter quatre microlitres de tampon 5 x, deux microlitres de DTT, un microlitre de transcriptase inverse et un microlitre de D et tps.

Effectuer la transcription inverse dans chaque puits à l’aide d’un thermocycleur. Régler le programme thermique à 42 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver la transcriptase inverse une fois la transcription inverse terminée, ajouter quatre microlitres de réactif exo à chaque échantillon d’ADNc, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes afin de digérer les excès d’oligonucléotides, suivi d’une étape à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pour inactiver le réactif exo, préparez le mélange de réaction PCR avec deux nanomolaires du primaire SMAP2. Ajoutez 10 microlitres du mélange de réaction PCR à chaque échantillon ayant fait l'objet d'une transcription inverse.

Réalisez l'amplification en effectuant 20 cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension. Après l'amplification des échantillons, réalisez deux séries de réactions de RT-PCR quantitative sur des plaques séparées afin de confirmer les résultats de RT-PCR. Dans chaque puits des deux plaques de 96 puits, ajoutez 10 microlitres de Green Cyber à 2 x, 1 microlitre d'ADNc amplifié, deux amorces et 7 microlitres d'eau. Réglez le programme sur 95 degrés Celsius pendant trois secondes, suivi de 60 degrés Celsius pendant 30 secondes.

Pendant 40 cycles, une étape de préincubation est supprimée afin de réduire l'erreur liée à l'amorce. Dans cette étude, des quantités en microgrammes d'ARN total de Hess ont été diluées jusqu'à des niveaux de nanogrammes et de picogrammes afin d'évaluer la variabilité technique et la détection de différences pour de faibles quantités d'ARN total. Une RT-PCR quantitative du gène G-A-P-D-H a été réalisée à l'aide d'ARNm provenant de tiges regroupées, diluées en série de 10 nanogrammes par microlitre à 0,1 picogramme par microlitre. Chaque point représente la valeur de CT d'ARNm dilué en série et d'ARNm de cellule unique trié par FACS.

Une corrélation a été observée entre chaque échantillon et les résultats de la PCR en temps réel, plusieurs cellules uniques présentant des valeurs de CT similaires. La FACS a été utilisée pour trier et sélectionner les cellules fortement positives à l'EEG FP à partir d'une lignée de CSH rapporteur OCT4-EGFP. Les résultats montrent une population positive à l'EGFP d'environ 60 % par rapport à la population négative, permettant de valider la cohérence entre différents lots de réactions de transcription inverse et d'amplification.

Des lysats cellulaires simples purifiés par Fax ont été divisés en deux moitiés, et le protocole a été appliqué à chaque moitié pour des comparaisons par lots. Une corrélation significative entre la valeur de CT d’OCT quatre de chaque moitié des lysats cellulaires simples a été observée. Une représentation sous forme de carte thermique de l'expression génique dans une enveloppe unique montre un niveau constant et robuste d'expression d’OCT quatre, mais des niveaux variables d’un autre gène marqueur de cellules souches, NAN og. Dans leur ensemble, nos résultats démontrent que cet essai d'expression génique au niveau de la cellule unique est utile pour l'étude des hétérogénéités au sein des populations de cellules souches pluripotentes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser correctement le QITP pour le transcriptome unicellulaire.