Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones

El objetivo general de este procedimiento es realizar con éxito una cirugía de injerto de mucosa heterótrofa para administrar compuestos en el cerebro. Esto se logra aislando primero un injerto de tabique nasal de un ratón donante. El segundo paso es trasplantar la membrana mucosa del tabique a un defecto del cráneo en un ratón receptor.

A continuación, el cerebro se dosifica a través del injerto durante un período de tiempo deseado. El paso final es analizar las consecuencias del procedimiento de dosificación cerebral mediante el uso de fluorescencia, microscopía o inmunohistoquímica para mostrar la difusión de los compuestos administrados en el cerebro. Parénquima. La utilización de los fármacos neuropónicos es muy limitada debido a la presencia de la barrera hematoencefálica.

Hemos desarrollado una técnica basada en la cirugía endoscópica transnasal humana en la que podemos graficar la mucosa en un agujero en la barrera hematoencefálica y utilizarla como conducto para la administración de fármacos directamente al cerebro. Aquí, Richie Komen, estudiante postdoctoral en el laboratorio de Han en la Universidad de Boston, va a demostrar esta técnica en un modelo de ratón. Comience este procedimiento quitando la piel alrededor de la región nasal de un ratón sacrificado para exponer el cráneo.

A continuación, marque tres líneas con el taladro neumático. Dos de las líneas flanquean lateralmente la región nasal, y la tercera está en línea con los ojos, lo que conecta las dos líneas perpendicularmente. A continuación, profundice ventralmente.

Para separar el tabique nasal del tejido circundante, corte el tabique para liberarlo de cualquier tejido adherido a él. Luego guárdelo en una solución salina estéril bajo el microscopio, limpie el injerto y retire cualquier tejido conectado. La situación ideal es eliminar con éxito todo el tejido conectivo sin dañar las membranas mucosas presentes a ambos lados del tabique cartilaginoso.

Después de anestesiar a un ratón utilizando procedimientos quirúrgicos estándar de espejo aséptico montados en un marco teológico, aplique ungüento en los ojos para prevenir la sequedad. A continuación, exponga el cráneo y nivele la cabeza. A continuación, corta un agujero circular de 1,25 milímetros de diámetro en el cráneo con un taladro neumático.

Al apuntar al atu, humedezca el área perforada con solución salina estéril y use una cuchilla de afeitar para extraer el cráneo. Después de eso, retire manualmente la duramadre con la punta de una aguja de calibre 30. Posteriormente, coloque la membrana mucosa por encima de la superficie cerebral, teniendo mucho cuidado de mantener el lado epitelial alejado de la herida.

Con la punta de unas tijeras quirúrgicas, sostenga la membrana fuera del cartílago y sobre la superficie del cráneo y el cerebro para superponer generosamente todos los bordes óseos del sitio de la craneotomía. A continuación, cubra el injerto con un trozo estéril de nitrilo. Esto actúa para evitar la adhesión de la piel al injerto durante la cicatrización.

Recorte el exceso de membrana si es necesario y evite cualquier movimiento del nitrilo una vez que haya entrado en contacto con el injerto. A continuación, cierre la piel con sutura y deje que el ratón se recupere durante tres a siete días antes de pasar al siguiente paso. Asegúrese de que se realizan los tratamientos postquirúrgicos adecuados y se administran analgésicos regulares para dosificar al animal.

Después de asegurar el ratón anestesiado en el marco estereotáxico, corte la sutura con unas tijeras y retire el exceso de piel alrededor del cráneo. Retire la barrera de nitrilo y limpie la superficie del cráneo. Use solución salina estéril e hisopos de algodón para limpiar el área hasta que el injerto sea visible.

Puede ser necesario cortar el injerto con la navaja si crece más que el área de superficie deseada. A continuación, coloque el pocillo por encima del injerto de modo que los bordes queden en contacto con el cráneo. A continuación, aplique adhesivo de cianoacrilato en la unión entre el pocillo y el cráneo.

Llene el pozo con solución salina estéril y verifique que no haya fugas. Posteriormente, aplique cemento en el cráneo para asegurar el pozo en su lugar. A continuación, retire la solución salina del pocillo con una pipeta.

Lave el pozo varias veces para verificar que el adhesivo no se haya filtrado. Luego agregue 50 microlitros de dextrano fluorescente. Tape la parte superior del pozo con una pieza circular de nitrilo asegurada a la parte superior con adhesivo de cianocrilato y asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con el contenido del pocillo.

Después de que haya pasado la cantidad de tiempo deseada, eutanasiar al animal y retirar el implante y el cerebro. Tenga cuidado de mantener el injerto en su lugar. Una vez extraído, flash, congele el cerebro en una solución de isobutano enfriada en un baño de hielo seco, incruste el cerebro en una solución OCT y corte a 50 micrómetros.

Coloque las rodajas deseadas directamente en un portaobjetos de microscopio. A continuación, obtenga una imagen del corte con un microscopio fluorescente tan pronto como la solución de OCT se haya secado. Esta es una imagen de microscopio fluorescente de un corte de cerebro de ratón después de la administración de una dosis transmucosa.

Con 40 kilodalton tetraetil rumina conjugado con dextrano durante 24 horas, el injerto de mucosa es visible en la superficie del cerebro. Una vez dominada, esta técnica debería tomar un total de cuatro horas de tiempo de cirugía para funcionar correctamente. Después de ver este video, uno debería ser capaz de aislar un tabique nasal y transferir la membrana mucosa sobre el sitio de una craneotomía con el propósito de administrar el medicamento al cerebro.