Name: Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende el procedimiento de injerto mucoso heterotópico para la administración directa de fármacos al cerebro en ratones. Este método supera la barrera hematoencefálica mediante membranas nasales trasplantadas.

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Este estudio fue financiado por la Fundación Mcihael J. Fox para la Investigación del 2011 Innovaciones de Respuesta Rápida de Parkinson Programa de Premios. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Antes de la cirugía asegúrese de todos los procedimientos que hay que hacer son aprobados por IACUC y las autoridades éticas o legales adicionales y utilizan prácticas de tratamiento de los animales sin causarles daño. Esto incluye el uso de cirugía condiciones estériles, anestesiar el ratón usando IACUC método aprobado, lubricantes ojos ratones con la pomada de veterinario durante la cirugía, y la prestación de atención posquirúrgica. No continúe con la cirugía si hay alguna cuestión de si se aprueban aspectos del procedimiento. Todos los procedimientos realizados en este documento fueron aprobados por el Comité Universitario Institucional Cuidado de Animales y Uso Boston. 1. Preparación de los animales y Suministros Quirúrgicos <ol><li> Autoclave todo instrumento quirúrgico que se utiliza durante la cirugía. </li><li> Asegúrese de que todas las técnicas que se van a realizar son aprobados por los organismos reguladores de los animales. </li></ol> 2. La recolección de la mucosa del injerto <ol><li> Elija un ratón genéticamente idéntico de edad similar a lael ratón experimental y practicar la eutanasia en un método aprobado IACUC (aquí: la asfixia isoflurano seguido por dislocación cervical). </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas, quitar la piel alrededor de la región nasal de la cabeza del ratón exponer el cráneo. </li><li> Con un taladro neumático, marca con tres líneas dos de los cuales flanquean lateralmente la región nasal y una tercera en la línea de los ojos que conecta las dos líneas perpendiculares. </li><li> Perforar abajo ventralmente con el fin de separar el tabique nasal del tejido circundante. Un camino más amplio evitará daños a la membrana de la mucosa sin embargo, también hará que sea más difícil aislar la membrana. Se recomienda un corte estrecho cerca de la línea media. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar el tabique libre de cualquier tejido adherido al mismo y guárdelo en una solución salina estéril. En este momento el injerto se puede limpiar para eliminar cualquier tejido conectado. La situación ideal es tener las membranas mucosas no dañadas expuestas en ambos lados del tabique cartílago. Uno grpopa se puede suministrar de membrana para dos ratones proporcionó el área de la superficie de la membrana es suficiente para cubrir los sitios de craneotomía. Se recomienda que el injerto se utiliza lo más rápidamente posible y el investigador procede a la etapa 3, tan pronto como se aísla el injerto. </li></ol> 3. Implantación quirúrgica de la mucosa del injerto <ol><li> El uso de procedimientos estándar, asépticas murinos quirúrgicos, anestesiar y montar un ratón en el marco estereológico. Utilice aproximadamente 2% de isoflurano en oxígeno puro usando una máquina de anestesia de roedores. </li><li> Inmovilizar el ratón en un aparato estereotáxico con barras de oído y un soporte de la nariz. Aplique una pomada oftálmica para los ojos y frote el cuero cabelludo con betadine y etanol al 75% durante tres rondas. El uso de cualquiera de tijeras o un cortador de pelo, quitar el pelo de la cabeza. Exponer el cráneo con una hoja de afeitar y nivelar la cabeza. Realizar una craneotomía por encima de la ubicación del cerebro que se dosifica. Por ejemplo, cuando la orientación del cuerpo estriado cortar un 1,25 mmdiámetro del orificio circular en el cráneo (con centro en AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) usando un taladro neumático. Humedecer la zona perforada con solución salina estéril y utilizar una hoja de afeitar para quitar el cráneo. </li><li> Retire con cuidado la duramadre con la punta de una aguja. Además, esto se puede lograr mediante la aplicación de una cantidad mínima de adhesivo tisular a la superficie de la duramadre húmedo. Una vez que esta capa se ha endurecido, el movimiento lateral con una punta de cuchilla de afeitar se puede utilizar para eliminar la membrana. </li><li> Coloque la membrana de la mucosa por encima de la superficie del cerebro teniendo cuidado extremo para mantener el lado epitelial hacia fuera de la herida. Esto se hace mejor mediante la transferencia de todo el tabique sobre la superficie del cráneo adyacente al sitio de la craneotomía con pinzas. Con la punta de un par de tijeras quirúrgicas, tire de la membrana fuera del cartílago y en la superficie del cráneo y del cerebro. No deje que la membrana se seque o toque con cualquier material absorbente. El injerto debe superponerse generosamente todos los bordes óseos de la craneotomía site. </li><li> Cubra el injerto con una pieza estéril de nitrilo. Esto actúa para impedir la adherencia de la piel al injerto durante la cicatrización. El nitrilo necesita ser lo suficientemente grande como para cubrir toda la membrana de la mucosa. Recorte membrana excesiva si es necesario. Evite cualquier movimiento del nitrilo, una vez que ha entrado en contacto con el injerto. </li><li> Cierre la piel con una sutura 5-0 estéril y dejar correr el ratón recuperar durante 3-7 días antes de proceder a la siguiente etapa. Tenga cuidado de no perturbar la barrera de nitrilo o el injerto de mucosa durante el cierre de la piel. </li></ol> 4. Administración de la solución de dosificación <ol><li> Después de asegurar el ratón anestesiado en el marco estereotáxico, cortar la sutura con unas tijeras y eliminar el exceso de piel alrededor del cráneo. </li><li> Retire la barrera de nitrilo y limpiar la superficie del cráneo. Utilice salinos y algodón hisopos estériles para limpiar el área hasta que el injerto es visible. Puede ser necesario cortar el injerto con una maquinilla de afeitar si ha crecido más grande que el desired superficie. </li><li> Si el experimento será más de unos pocos días, es conveniente implantar al menos dos tornillos del cráneo para reforzar el implante de cabeza. </li><li> Coloque el muy por encima del injerto de modo que los bordes están en contacto con el cráneo. Aplicar el adhesivo de cianoacrilato en la unión entre el pozo y el cráneo. Llene el bien con solución salina estéril y comprobar para asegurarse de que no haya fugas. Wells se hacen de agujas de jeringa corte. </li><li> Aplique cemento para huesos en el cráneo para asegurar el bien en su lugar. </li><li> Quitar la solución salina desde el pozo con una pipeta. Lave bien las varias veces para verificar que el adhesivo no se ha filtrado in Agregar la solución deseada; en este caso se utiliza 50 l de dextrano fluorescente. Se espera que los compuestos solubles en agua de una polaridad similar se comportan de la misma como dextrano. Entrega de compuestos hidrófobos o suspensiones no ha sido explorado con este método. </li><li> Se tapa la parte superior del pozo mediante el uso de una pieza circular de nitrilo asegurado a laarriba usando adhesivo de cianoacrilato. Asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con los contenidos del pocillo. </li></ol> 5. Análisis de transmucosa de entrega <ol><li> Una vez transcurrido el período de tiempo deseado, anestesiar el ratón y el intercambio de los contenidos del pocillo con una solución de colorante azul de Evan. Este colorante se utiliza para verificar que el injerto estaba intacto. </li><li> Después de 30 min, anestesiar el ratón en gran medida, se retira la solución colorante, y la eutanasia mediante decapitación. </li><li> Elimine manualmente el implante y retire el cerebro utilizando tijeras quirúrgicas. Tenga cuidado de mantener el injerto en su lugar. </li><li> Una vez retirado, el flash-congelar el cerebro en una solución de isobutano se enfrió en un baño de hielo seco. </li><li> Incrustar el cerebro en temperatura óptima de corte solución (OCT) y el tramo a 50 micras. </li><li> Colocar las rebanadas deseadas directamente en un portaobjetos de microscopio. </li><li> Imagen de la rebanada utilizando un microscopio de fluorescencia tan pronto como la solución de octubre se ha secado. </li></ol>

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</ol>

Benjamin S. Bleier MD es el inventor de plomo de los métodos de recubrimiento de patente provisional de la administración de fármacos al sistema nervioso central.

El paso más difícil del procedimiento descrito en el presente documento es la transferencia con éxito de una membrana mucosa de tamaño adecuado sobre la superficie del cerebro. Este paso se hace mucho más fácil si el tabique nasal cosechado es lo suficientemente grande y las limpiaban bien. Si se trunca la porción ventral del septum, se debe obtener un nuevo injerto. El ángulo de perforación debe ser perpendicular a la cabeza del ratón para asegurar que la membrana de la mucosa no es dañado por el taladro. Si se toma un...

El tratamiento de la enfermedad neurológica y psiquiátrica está severamente obstaculizada por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​que impide que más del 95% de todos los posibles agentes farmacéuticos de alcanzar el sistema nervioso central 1-3. Por ejemplo, factor neurotrófico derivado del glial (GDNF) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson cuando se inyecta directamente en el cerebro, sin embargo, es ineficaz cuando se entrega sistémica, ya que no puede penetrar la acreditación 4-6. Numerosos acercado se han desarrollado para tratar de solventar este problema. Mejoras en la administración sistémica de neurotheraputics se ha demostrado mediante el uso de conjugados de fármaco que contienen anticuerpos selectivos para proteínas de transporte situados sobre el endotelio capilar cerebral; Sin embargo este método no ha demostrado ser aplicable para una amplia gama de productos farmacéuticos 7,8. Además, la apertura osmótica de la BBB ha sido utilizado clínicaaliado, sin embargo, este método adolece de la dosificación del fármaco sistémico en oposición a una entrega más directo a la región del cerebro de interés 9. Esfuerzo considerable se ha puesto en la optimización de la entrega transnasal con la esperanza de dirigirse directamente al cerebro 10-12. Aunque algo de éxito se ha logrado, resultados concluyentes sólo se han obtenido para fármacos que poseen receptores endógenos, tales como la insulina 13,14. Además, el mecanismo de entrega transnasal ha sido motivo de controversia con la evidencia que sugiere la entrada indirecta en el cerebro a través de la captación de la neurona olfatoria o por el torrente sanguíneo 11. La entrega directa, transcraneal utilizando catéteres implantables se ha conseguido, sin embargo este procedimiento es altamente invasiva y asociada con numerosas complicaciones 15,16. Hasta la fecha, no hay ningún método general, mínimamente invasivo para entregar compuestos de alto peso molecular en el cerebro. Presentado en el presente documento es un procedimiento quirúrgico murinoque crea una interfaz semipermeable con el cerebro. Esto se logra de injerto de un explante de la membrana mucosa 17 sobre un defecto craneotomía quirúrgica en un ratón. El uso de este procedimiento se ha demostrado que los compuestos solubles de hasta 500 kDa pueden ser entregados en el sistema nervioso central (directamente en el parénquima cerebral, así como en el líquido cefalorraquídeo) tanto en un tiempo y manera dependiente de peso molecular 18. Este método de pasar por la acreditación es un modelo para la reparación de defectos de base de cráneo en los seres humanos que utiliza injertos de mucosa vascularizados para reparar agujeros en el cráneo después de la cirugía endoscópica transnasal 19,20.

<table><tbody><tr><td>Ratones</td><td>Taconic</td><td>C57BL/6</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estudiante tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Taladro neumático</td><td>MTI Dental</td><td>333-CB</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de cloruro de sodio al 0,9% USP</td><td>Abbott Laboratories</td><td>4925</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td>para el almacenamiento temporal de injertos</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de oxígeno/isoflurano</td><td>SurgiVet</td><td></td> V720100 <td></td></tr><tr><td>sistema de control de temperatura</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>instrumento estereotáxico para animales pequeños</td><td>KOPF</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Pomada ocular Afeitadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>eléctrica</tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher</td><td>23-400-106</td><td></td></tr><tr><td>7.5% Providone yodo</td><td></td><td></td><td>Betadine exfoliante quirúrgico</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica inoxidable</td><td>Feather</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>3% Peróxido de</td><td></td><td></td> Hydogen <td>para la limpieza del cráneo</td></tr><tr><td>Vetbond adhesivo tisular</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305176</td><td>punta de aguja cortada y utilizada así</td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>G4162</td><td>para el cierre de pozos y la protección del injerto</td></tr><tr><td>5-0 Hilo</td><td></td><td></td><td></td>de sutura de nailon</tr><tr><td>Student Halsey portaagujas Fine</td><td>Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr>Adhesivo <td></td><td></td> de<td>cianoacrilato</td><td>superpegamento disponible de forma inmediata</td></tr><tr><td>Kit de cemento dental, 1 lb, rosa opaco</td><td>Stoelting</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Isobutano (2-metilbutano)</td><td>Aldrich</td><td>M32631</td><td>para baño de hielo seco</td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr></tbody></table>

heterotópico mucosas procedimiento la incorporación del trasplante de drogas entrega directa al cerebro en ratones

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Entrega de agentes terapéuticos en el cerebro se ve impedida por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB), que restringe el paso de compuestos polares y de alto peso molecular de la sangre y en el tejido cerebral. Algún éxito la entrega directa en los seres humanos se ha logrado a través de la implantación de catéteres transcraneal; Sin embargo este método es altamente invasivo y asociada con numerosas complicaciones. Una alternativa menos invasiva sería para dosificar el cerebro a través de un implantado quirúrgicamente, membrana semipermeable tal como la mucosa nasal que se utiliza para reparar defectos de la base del cráneo siguiente transnasal tumor de la cirugía de extracción endoscópica en los seres humanos. Transferencia del fármaco a pesar de esta membrana evitaría eficazmente la acreditación y difundirse directamente en el cerebro y líquido cefalorraquídeo. Inspirado por este enfoque, un enfoque quirúrgico en ratones fue desarrollado que utiliza una membrana donante de la mucosa septal injertado sobre un extracraneal quirúrgica acreditación defecto. Este modelo se ha demostrado que efectivamentepermitir el paso de compuestos de alto peso molecular en el cerebro. Puesto que numerosos fármacos candidatos son incapaces de cruzar la BHE, este modelo es valiosa para la realización de los ensayos preclínicos de nuevas terapias para enfermedades neurológicas y psiquiátricas.

La obtención de una lo suficientemente grande como explante tabique nasal es crucial para las etapas subsiguientes. Esto se puede lograr mediante la perforación en el lugar en el cráneo del ratón donante se muestra en la Figura 1a. Corte a lo largo de este camino producirá un explante de suficiente tamaño como se muestra en la Figura 1b. Si la profundidad de la perforación no es lo suficientemente profunda, el injerto será truncado y que será difícil obtener una membrana lo suficienteme...

Un modelo de ratón de la reconstrucción endoscópica de base de cráneo humano se ha desarrollado que crea una interfaz semipermeable entre el cerebro y la nariz con injertos de mucosa nasal. Este método permite a los investigadores estudiar la entrega al sistema nervioso central de la terapéutica de alto peso molecular que se excluyen de otra manera por la barrera sangre-cerebro cuando se administra sistémicamente.

Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar con éxito una cirugía de injerto mucoso heterotrópico para administrar compuestos al cerebro. Esto se logra primero aislado un injerto de tabique nasal de un ratón donante. El segundo paso consiste en trasplantar la membrana mucosa del tabique sobre un defecto craneal en un ratón receptor.A continuación, el cerebro se administra mediante el injerto durante un período de tiempo determinado. El paso final consiste en analizar la consecuencia del procedimiento de administración en el cerebro utilizando fluorescencia, microscopía o inmunohistoquímica para mostrar la difusión de los compuestos administrados en el parénquima cerebral. El uso de fármacos neuroparénquima. La utilización de fármacos neuroparénquima es muy limitada debido a la presencia de la barrera hematoencefálica.Hemos desarrollado una técnica basada en la cirugía endoscópica transnasal humana en la que podemos injertar mucosa en un orificio de la barrera hematoencefálica y utilizarlo como un conducto para la administración directa de fármacos al cerebro. A continuación, Richie Komen, un estudiante postdoctoral en el laboratorio de Han en la Universidad de Boston, dem

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Fuente: Zamboni, M., et al., Inducción de la modificación de las células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento de administración de un fármaco inductor en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La inyección induce selectivamente la expresión de marcadores fluorescentes en las células de la superficie cerebral accesibles a través del líquido cefalorraquídeo, confirmado por imágenes de fluorescencia.

Administración dirigida de fármacos en un modelo de ratón mediante inyección de cisterna magna

En este video, describimos el procedimiento para introducir células tumorales de origen humano en la cisterna magna del cerebro de un ratón. El modelo ortotópico de ratón se puede utilizar para estudiar la diseminación metastásica del cáncer a las meninges craneales.

Inyección quirúrgica de cisterna magna: un método para administrar células tumorales directamente en el sistema nervioso central de un modelo murino

Este video muestra la inyección intracerebroventricular mediada por ommaya en un modelo de ratón. El método permite la administración localizada de posibles candidatos a fármacos y evade la barrera hematoencefálica.

Inyección intracerebroventricular en ratón: un método de administración directa de fármacos mediado por ommayas para administrar fármacos a los ventrículos cerebrales del cerebro de ratón

Este video presenta un procedimiento para la implantación de cánulas intracraneales en un modelo de ratón con tumor cerebral, para facilitar la administración de un agente inmunoterapéutico. La administración de células T del receptor de antígeno quimérico específico del glipican-2 en el microambiente tumoral desencadena la activación de las células T, lo que da lugar a la lisis tumoral y la regresión tumoral.

Implante canular intracraneal en un ratón para administrar agentes terapéuticos a tumores cerebrales

Fuente: Leda, A. R., et al. Técnica de infusión de microcirugía de ratón para la administración de sustancias dirigidas en el SNC a través de la arteria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un procedimiento microquirúrgico diseñado para facilitar la infusión dirigida de una sustancia de prueba en el cerebro a través de la arteria carótida interna (ICA). El procedimiento implica suturas precisas y manipulación vascular para restringir temporalmente el flujo sanguíneo,...

Administración de sustancias dirigidas al cerebro del ratón mediante infusión en la arteria carótida interna

El presente protocolo describe una técnica de infusión de microcirugía para ratones, que administra sustancias directamente en el cerebro a través de la arteria carótida interna.

Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC vía La arteria carótida interna

Las células madre son portadores terapéuticos prometedores para tratar tumores cerebrales debido a su tropismo tumoral intrínseco. La administración intranasal no intrusiva de células madre evita la barrera hematoencefálica y demuestra un fuerte potencial para la traducción clínica. Este artículo resume los principios básicos de la entrega de células madre intranasales en un modelo de ratón de glioma.

Entrega intranasal de células madre terapéuticas a glioblastoma en un modelo de ratón

Aquí, presentamos un protocolo utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón que permite la colocación adecuada de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro que permite un silenciamiento eficaz del gen en el sistema nervioso central.

Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la entrega de siRNA intranasal al sistema nervioso central

Aquí, describimos un modelo de xenoinjerto murino que se asemeja funcionalmente a un reservorio de Ommaya en pacientes. Desarrollamos el Ommaya murino para estudiar nuevas terapias para la enfermedad leptomeningeal universalmente fatal.

Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

El desarrollo de modelos ortotópicos de tumores cerebrales pediátricos requiere una precisión meticulosa, utilizando un dispositivo estereotáxico para implantar células cancerosas con precisión. La metodología presentada aquí describe los pasos involucrados en la preparación de las células tumorales cerebrales, la realización de inyecciones intracraneales y la implementación de un sistema de monitoreo postoperatorio para evaluar el injerto de tumor cerebral.

Establecimiento de modelos ortotópicos de xenoinjertos derivados de pacientes para tumores cerebrales utilizando un dispositivo estereotáxico

Aprende el procedimiento de injerto mucoso heterotópico para la administración directa de fármacos al cerebro en ratones. Este método supera la barrera hematoencefálica mediante membranas nasales trasplantadas.

Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones

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