Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Este es el protocolo para la preparación de muestras para el ensayo de plasma. Tenga en cuenta que, para garantizar su integridad, todas las muestras y estándares deben mantenerse entre dos y ocho grados Celsius durante la recolección y el procesamiento. Una vez finalizada la manipulación, almacene todas las muestras a menos 20 grados.

Para la preparación estándar, prepare dos soluciones stock independientes de cada anilida, ivacaftor, metabolito M1, metabolito M6 y lumacaftor en metanol a 100 microgramos por mililitro y 10 microgramos por mililitro. Tenga en cuenta que los compuestos caducan después de 10 días en la mesa de trabajo. Para los estándares, transfiera 100 microlitros de plasma humano a tubos de microcentrifugado de polipropileno de 1,5 mililitros.

Continúe haciendo esto con todas sus demás muestras. Luego agregue el patrón interno a cada tubo. Por ejemplo, elegimos 0,01 microgramos por mililitro del patrón preparado.

Ahora este tubo contiene plasma con el estándar interno añadido. Proceda de esta manera con todos los demás estándares. Tome sus estándares y centrifúguelos durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en la parte inferior del tubo.

Continúe haciendo esto para todos sus 40 estándares. Para las muestras de pacientes, transfiera 100 microlitros desde el tubo de muestra de paciente al tubo de microcentrifuga. La muestra real del paciente no está enriquecida con estándar interno.

Centrifugar la muestra del paciente durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en la parte inferior del tubo. Los siguientes pasos están diseñados tanto para las muestras como para los patrones. Añadir 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo a cada tubo de muestra para precipitar las proteínas plasmáticas.

Continúe haciendo esto con todos los patrones y muestras de pacientes. Vortexe cada muestra vigorosamente durante aproximadamente 15 segundos. Continúe haciendo esto con todos los patrones y muestras analizadas.

Dejar reposar durante 10 minutos en el refrigerador para facilitar la precipitación. A efectos demostrativos, centrifugaré solo una muestra y un estándar. Estamos centrifugando a 10.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Eppendorf Centrifuge 5430 a cuatro grados.

Ahora filtraremos el sobrenadante en los viales de Phenomenex. Para ello, estamos utilizando un filtro de jeringa de 13 milímetros con filtros de nailon Grace de 0,45 micrómetros adquiridos en EE. UU., y estamos filtrando hacia los viales para HPLC que pueden contener 1,5 mililitros. Después de la filtración, transferiremos 100 microlitros del sobrenadante a los viales para LC/MS para el análisis por LC/MS.

Esta muestra ya está lista para el análisis. Ahora coloque simplemente todas sus muestras en el portaviales. Estamos utilizando un sistema LC/MS Shimadzu 8030, acoplado a un espectrómetro de masas con triple cuadrupolo.

Deje que el sistema alcance el equilibrio antes del análisis. Una vez equilibrado, lo que tarda aproximadamente 15 minutos, simplemente presione el botón Inicio. Para cada metabolito, construya una curva de calibración trazando las relaciones del área de los picos de las anilidas frente a la concentración nominal de los estándares de calibración.

Utilice la ecuación de regresión de la curva de calibración para calcular las concentraciones de anilidas en la muestra analizada. En esta figura se muestra un cromatograma típico. Se obtuvo una resolución cromatográfica optimizada utilizando una fase móvil de acetonitrilo al 100 % y ácido fórmico al 0,1 % en agua, con una elución en gradiente en una columna Phenomenex Kinetex C8.

Los tiempos de retención en CL fueron los siguientes. Para M6, un minuto. Para M1, 1,3 minutos.

Para ivacaftor, 1,55 minutos. Para lumacaftor, 2,3 minutos. En todas las muestras de plasma en blanco, no se observó interferencia con el tiempo de retención de cualquiera de las anilidas, ni se detectó interferencia proveniente de la combinación de ivacaftor con lumacaftor.

Mediante el análisis de alto rendimiento de una gran cantidad de muestras de pacientes, hemos optimizado nuestro método descrito utilizando una columna de cromatografía de fase reversa con un tamaño de poro más pequeño, la columna Phenomenex C8, y un sistema de solventes en gradiente en lugar de la elución isotécnica actual. Esto reduce el tiempo de análisis a seis minutos por muestra, incluyendo la fase de lavado. Este método fiable y novedoso ofrece un enfoque sencillo, sensible y rápido para el monitoreo terapéutico de ivacaftor y la combinación de ivacaftor-lumacaftor en fluidos biológicos.

Dado la necesidad de desarrollar relaciones exposición-respuesta para maximizar la eficacia de los medicamentos y al mismo tiempo contener los costos de la atención médica, se deben desarrollar y validar herramientas más sensibles para ayudar a los clínicos a utilizar terapias basadas en evidencia y técnicas analíticas de alto rendimiento en pacientes que padecen fibrosis quística. Al aplicar el método analítico propuesto a estudios clínicos de farmacocinética y farmacodinamia, surge la oportunidad de investigar más a fondo los parámetros farmacocinéticos del ivacaftor o de la combinación ivacaftor-lumacaftor en un colectivo de pacientes más amplio.