Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Este es el protocolo para la preparación de la muestra para el ensayo de plasma. Tenga en cuenta que, para garantizar su integridad, todas las muestras y estándares deben mantenerse a una temperatura de dos a ocho grados centígrados durante la recolección y el procesamiento. Una vez completada la manipulación, almacene todas las muestras a menos 20 grados.

Para la preparación estándar, prepare dos soluciones madre independientes de cada anilida, ivacaftor, metabolito M1, metabolito M6 y lumacaftor en metanol a 100 microgramos por mililitro y 10 microgramos por mililitro. Tenga en cuenta que los compuestos caducan después de 10 días en la mesa de trabajo. Para los estándares, transfiera 100 microlitros de plasma humano a los tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros.

Continúe haciéndolo para todas las demás muestras. A continuación, añada el patrón interno a cada tubo. Por ejemplo, elegimos 0,01 microgramos por mililitros del estándar preparado.

Ahora este tubo contiene plasma enriquecido con el patrón interno. Proceda de esta manera con todas las demás normas. Tome sus estándares y gírelo hacia abajo durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo.

Continúe haciendo esto para todos sus 40 estándares. Para las muestras del paciente, transfiera 100 microlitros del tubo de muestra del paciente al tubo de microcentrífuga. La muestra de paciente real no está enriquecida con el estándar interno.

Gire la muestra del paciente durante unos segundos para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo. Los siguientes pasos están diseñados tanto para las muestras como para los estándares. Añadir 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo en cada tubo de muestra para precipitar las proteínas plasmáticas.

Continúe haciéndolo para todos los estándares y muestras de pacientes. Agite cada muestra vigorosamente durante unos 15 segundos. Continúe haciéndolo para todos los estándares y muestras incurridas.

Dejar reposar durante 10 minutos en la nevera para facilitar la precipitación. Para fines de demostración, solo centrifugaré una muestra y un patrón. Estamos centrifugando a 10.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Eppendorf 5430 a cuatro grados.

Ahora filtraremos el sobrenadante en los viales de Phenomenex. Para ello, estamos utilizando un filtro de jeringa de 13 milímetros con filtros Grace de nailon de 0,45 micrómetros comprados en EE. UU., y estamos filtrando en los viales de HPLC que pueden contener 1,5 mililitros. Después de la filtración, transferiremos 100 microlitros de sobrenadante a los viales de LC/MS para el análisis de LC/MS.

Esta muestra ya está lista para el análisis. Ahora simplemente coloque todas sus muestras en el estante de viales. Estamos utilizando un sistema Shimadzu 8030 LC/MS, junto con una especificación de masa de triple cuadrupolo.

Deje que el sistema se equilibre antes del análisis. Una vez equilibrado, lo que tarda unos 15 minutos, basta con pulsar el botón Inicio. Para cada metabolito, construya una curva de calibración trazando las proporciones de área máxima de los anilides frente a la concentración nominal de los patrones de calibración.

Utilice la ecuación de regresión de la curva de calibración para calcular las concentraciones de anilides en la muestra incurrida. En esta figura se muestra un cromatograma típico. La resolución cromatográfica optimizada se obtuvo utilizando una fase móvil de 100% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico en agua con una elución en gradiente en una columna Phenomenex Kinetex C8.

Los tiempos de retención de LC fueron los siguientes. Para M6, un minuto. Para M1, 1,3 minutos.

Para ivacaftor, 1,55 minutos. Para lumacaftor, 2,3 minutos. En todas las muestras de plasma en blanco, no se observó interferencia con el tiempo de retención de ninguno de los anilidos, ni se detectó interferencia de la combinación de ivacaftor con lumacaftor.

A través del análisis de alto rendimiento de una gran cantidad de muestras de pacientes, hemos optimizado nuestro método informado mediante el uso de una columna de cromatografía de fase reversa de menor tamaño de poro, columna Phenomenex C8 y un sistema de solvente de gradiente en lugar de la elución isocrática actual. Esto reduce el tiempo de funcionamiento a seis minutos por muestra, incluida la fase de lavado. Este método fiable y novedoso ofrece un enfoque sencillo, sensible y rápido para la monitorización terapéutica de fármacos de ivacaftor y de la combinación ivacaftor-lumacaftor y de fluidos biológicos.

Dada la necesidad de desarrollar relaciones exposición-respuesta para maximizar la eficacia del fármaco, así como para contener los costes sanitarios, es necesario desarrollar y validar herramientas más sensibles para ayudar a los médicos a utilizar terapias basadas en la evidencia y técnicas analíticas de alto rendimiento para los pacientes que sufren de CF.By de aplicar el método analítico propuesto a estudios clínicos farmacocinéticos y farmacodinámicos, surge la oportunidad de investigar más a fondo los parámetros farmacocinéticos de ivacaftor o Combinación de ivacaftor-lumacaftor en un colectivo de pacientes más grande.