Name: Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a expresar proteínas glicosiladas secretadas en células 293F de mamífero con este protocolo rápido y eficiente. Obtén cantidades de miligramos de proteínas plegadas nativamente para estudios estructurales y cristalización.

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Este trabajo fue apoyado por NIH R01-HL119813 (a T.J.B.), la Asociación Americana del Pulmón RG-196051 (a T.J.B.), una beca piloto y de viabilidad de CIMED (a T.J.B.), las becas predoctorales de la Asociación Americana del Corazón 14PRE19970008 (a Z.Y.) y 15PRE22110004 (a D.L.K.).

1. Producción de cantidades de miligramos de ADN de plásmido para la transfección transitoria a gran escala <ol><li> Clonar la proteína de interés en un vector de expresión mamífero número elevado de copias usando la clonación sitio de restricción, u otra técnica apropiada. <ol><li> Para obtener resultados óptimos, utilice pHLsec 7 vector, que tiene incorporado un C-terminal 6His-tag, una fuerte secuencia Kozak promotor y una señal de secreción optimizado. </li></ol></li><li> Transformar el plásmido en las células competentes. <ol><li> Añadir 20 l de células competentes de E. coli en 1 g de ADN plásmido y se incuba en hielo durante 30 min. </li><li> Células choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, y luego incubar en hielo durante 2 min. </li><li> Añadir 300 l de medio de crecimiento microbiano (SOC) y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos, agitando a 220 rpm. </li><li> Células de la placa en la placa de agar con la selección de antibiótico apropiado. <ol><li> Utilice 100 mg / ml de carbenicilina si el plásmido se encuentra en el vector pHLsec. </li></ol></li></ol></li><li> Colonias Cultura en 250 ml de caldo Luria (LB) los medios suplementados con 100 g / ml a los antibióticos (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm. </li><li> Purificar el ADN de cultivo utilizando el kit de alta velocidad plásmido Maxi según el protocolo del fabricante. <ol><li> Eluir el ADN en tampón EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), en lugar de tampón TE. </li><li> Alícuota del plásmido purificado en cantidad necesaria para la transfección y se almacena a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. A gran escala cultura y transfección transitoria de células 293F <ol><li> Suplemento medios 1 L 293F con 10 ml de glutamina y 5 ml Pen / Strep (tanto 100x). Almacenar a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep es una resistencia suficiente en condiciones libres de suero y la concentración del antibiótico reducido mejora la viabilidad de las células durante la transfección, lo que mejora los rendimientos de proteína. </li><li> Cultura células 293F en 300 ml de medio en 1 L de policarbonato desconcertados matraces Erlenmeyer con tapón de ventilacións a 37 ° C con 8% de CO 2, mientras se agitaba en una incubadora de cultivo de tejidos estándar. </li><li> Diluir las células a 5 x 10 5 / ml de densidad un día antes de la transfección. </li><li> En el día de la transfección, el medio de cultivo mediante la adición de suplemento de volumen de 10% de 2% w / v Cell Boost en medios 293F. <ol><li> Medir la concentración de glucosa utilizando un monitor de glucosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y suplementos uso cuando sea necesario para lograr una concentración de glucosa de 500 mg / dL. </li></ol></li><li> Añadir kifunensine (/ ml de concentración final 1 g) en este paso para controlar la glicosilación de proteínas. </li><li> Calcular el volumen de ADN plásmido requerido para 1 g por 1 x 10 6 células. En condiciones estériles, diluir ADN en medio libre de suero 5 ml. </li><li> Calcular el volumen de reactivo de transfección requeridos para el plásmido 1 g por 2 l de reactivo de transfección. En condiciones estériles, diluir reactivo de transfección (PEI-TMC-25) en medio libre de suero de 5 ml. </li><li> Añadirreactivo de transfección de ADN en solución en incrementos de 1 ml, mezclando suavemente. Incubar durante 30 min a TA para los complejos de ADN-reactivo para formar. A continuación, añadir la solución sobre las células de una manera gota a gota. </li><li> Permitir que las células transfectadas para expresar la proteína de 72 a 96 h. Suplemento con ~ 10% del alza del volumen celular Medios diarias, o si es necesario para mantener la glucosa en la lectura de 400 a 600 mg / dl. </li></ol> 3. Purificación <ol><li> Decantar la cultura en un matraz de centrífuga, centrifugar durante 20 min a 1.300 xg para sedimentar las células y luego recoger el sobrenadante. Si es necesario, girar un segundo tiempo y / o utilizar filtro de 0,22 micras para aclarar sobrenadante. </li><li> Añadir tampón de unión 10% volumen 10x Ni-NTA (M NaCl 1,5, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol). </li><li> Preparar una columna de gravedad mediante la adición de 2 ml de Ni-NTA suspensión en una columna y equilibrar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de unión 1X. Si es posible, hacer todos los pasos de columna en una habitación de 4 ° C. Alternatively, proteína de frialdad y todos los tampones en hielo antes de la etapa de columna y mantener proteínas y recogida de flujo continuo en el hielo. Nota: Ni-NTA suspensión es la resina de 50% en volumen y capacidad de unión declarado de la fabricación es 50 mg / ml. Perlas de Ni-NTA pueden ser re-cargadas para múltiples usos </li><li> El flujo del sobrenadante sobre la resina y recoger flujo a través. Repita este paso. </li><li> Lavar con 10 CV de tampón de lavado (NaCl 300 mM, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM imidazol pH 8). </li><li> Eluir la proteína en 5 CV de tampón de elución (NaCl 300 mM, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM de imidazol pH 8). </li><li> Si se requiere desglicosilación: <ol><li> Para un volumen final de 0,5 ml, eluido concentrado a 0,43 ml usando un concentrador de centrifugación. Si se forman precipitados, sedimentar los residuos por centrifugación a 16.000 xg y 4 ° C. </li><li> Añadir 50 l de 500 mM Na-citrato de pH 5,5. </li><li> Añadir 20 l de EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr. Noe: La enzima funciona de manera óptima a 37 ° C, lo que puede causar que la proteína concentrada a agregarse. Extender la incubación RT, si desglicosilación, evaluada por SDS-PAGE o inmunotransferencia, es incompleta. La enzima no tiene actividad a 4 ° C. </li><li> Para eliminar EndoHf: Wash amilosa Resina 3x en tampón fosfato salino (PBS) o tampón de almacenamiento final. Incubar proteína con resina durante 1 hora a 4 ° C. Girar 5 min a 1000 xg para sedimentar los granos y recoger el sobrenadante. </li><li> Concentrado de proteína usando el filtro molecular apropiado centrifugación corte de peso y intercambio de tampón en tampón de almacenamiento (NaCl 150 mM y HEPES 20 mM pH 7,5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
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<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Células HEK 293F ofrecen la producción de robusta de las proteínas que requieren modificaciones posteriores a la traducción. Este sistema permite la expresión rápida y escalable de las proteínas plegadas de forma nativa que contienen disulfuros, glicosilación, fosforilación y que de otra manera estaría ausente el uso de herramientas de expresión más rutinarias. Además, este sistema puede ser utilizado para la expresión y purificación de varios complejos de proteínas simplemente mediante la co-transfección de múltiples p...

La comprensión de la estructura de proteínas a nivel atómico es clave para descubrir las bases moleculares de las vías biológicas y enfermedades. Cristalografía de rayos X de proteínas es más utilizado el método / aplicable para la determinación de estructuras macromoleculares. El principal reto de este método es la obtención de cantidades suficientes de correctamente plegada, proteína pura. Esto se convierte en un problema particular cuando se trabaja con proteínas de mamífero secretada, que experimentan modificaciones post-traduccionales específicas. Las proteínas expresadas en bacterias son la principal fuente de proteínas cristalizadas depositadas en el Protein Data Bank 1. Sistemas de expresión bacterianos se prefieren en gran parte porque son rápidos, de bajo costo y típicamente producen altos rendimientos de proteína. Sin embargo, los dominios extracelulares de proteínas de mamífero expresadas en bacterias a menudo no están correctamente plegadas, en la que se requieren pasos caso de replegamiento y purificación extensa para obtener homogéneamente foproteína LDED. Además, muchas proteínas de mamíferos requieren glicosilación postraduccional para lograr plegamiento apropiado 2. Aunque la expresión y la glicosilación en células de levadura o de insectos pueden superar el problema de plegado, modificaciones post-traduccionales, incluyendo glicosilación, difieren significativamente de los de células de mamífero 3, produciendo proteínas con modificaciones incorrectas o no homogéneos. Las células de mamíferos expresan toda la maquinaria molecular necesaria para garantizar modificaciones post-traduccionales adecuadas y plegado; sin embargo, estos sistemas de expresión no son típicamente preferidas por la mayoría de los laboratorios, debido a los rendimientos limitados y altos costos de reactivos y consumibles. Polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección estándar es relativamente barato, pero impone considerable la citotoxicidad y la baja eficiencia de la transfección, lo que resulta en aumento de los costos en los medios de comunicación celular, el ADN, y el equipo de cultivo. Muchas alternativas a PEI son prohibitivamente caros. Abordamosestos problemas mediante la descripción de una combinación de herramientas mejoradas de cultivo de células y químicamente modificado PEI para el método rápido y relativamente barato para la expresión de proteínas de mamíferos secretadas, seguido de purificación de un solo paso. Este método robusto da rendimientos suficientes para estudios funcionales y bioquímicos 4, y en algunos casos, da lugar a la proteína susceptible a la cristalización sin purificación adicional. Este protocolo describe varias técnicas para maximizar la expresión y el rendimiento de las proteínas de mamíferos secretadas en el riñón embrionario humano (HEK) 293F células cultivadas en suspensión. La eficacia de transfección (y costo), la producción y purificación de proteínas están enormemente mejorado siguiendo este protocolo. PEI modificado por la adición de carbamatos a través de una reacción de apertura de anillo de un solo paso (PEI-TMC-25, síntesis y propiedades se describe en detalle en la ref 5) mejora en gran medida la eficiencia de transfección, reduce la citotoxicidad de catiónicodisrupción de la membrana y por consiguiente reduce los costes de experimentación. Por otra parte, la viabilidad celular y la expresión de proteínas se mejoran en gran medida con la adición de suplementos de cultivo para el suministro de glucosa y vitaminas. Es importante destacar que para la producción de proteínas glicosiladas, el tratamiento con kifunensine, un inhibidor químico no tóxico de manosidasa I, produce proteínas con definidos, glicanos inmaduras, que pueden ser eliminados por el EndoHf endoglicosidasa para producir proteínas con un solo N-acetilglucosamina en lugar de un álbum de glicanos 6 N-ligado. Finalmente, la secreción de proteínas en un, medio químicamente definido libre de suero permite la purificación rápida y fácil para estudios estructurales y bioquímicos. Níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) de purificación de resina Single-step elimina la mayoría de las especies contaminantes en el sobrenadante y, en algunos casos, puede producir la proteína de pureza suficiente para la cristalización.

<table><tbody><tr><td>Matraces de cultivo</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Uso en lugar de Glutamine</td></tr><tr><td>Hype 5 reactivo de transfección</td><td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293reactivo de transfección de fectina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>reactivo de transfección de PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Suplemento de cultivo celular</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>Sistema de monitoreo</td></tr><tr><td>de glucosa Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Medio libre de suero para la transfección de ADN</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Células competentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

efficient expresión células de mamíferos y single-step la purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

La producción de proteínas de mamíferos secretadas para estudios estructurales y biofísicos puede ser desafiante, lenta y costosa. Aquí se describe un protocolo eficiente en tiempo y costo para la expresión de proteínas secretadas en células de mamíferos y la purificación en un solo paso mediante cromatografía de afinidad de níquel. El sistema se basa en la transfección transitoria a gran escala de células de mamíferos en suspensión, lo que disminuye en gran medida el tiempo de producción de proteínas, ya que elimina pasos, como el desarrollo de virus de expresión o la generación de líneas celulares de expresión estables. Este protocolo utiliza agentes de transfección baratos, que se pueden producir fácilmente mediante una simple modificación química, o agentes de transfección de precio moderado, que aumentan el rendimiento a través de una mayor eficiencia de transfección y una disminución de la citotoxicidad. El monitoreo cuidadoso y el mantenimiento de los niveles de glucosa de los medios aumentan el rendimiento de proteínas. El control de la maduración de los glicanos nativos en la etapa de expresión aumenta el rendimiento final de las proteínas de mamíferos correctamente plegadas y funcionales, que son propiedades ideales para realizar la cristalografía de rayos X. En algunos casos, la purificación en un solo paso produce proteínas de suficiente pureza para la cristalización, lo que se demuestra aquí como caso de ejemplo.

Aquí sigue los resultados de este sistema de expresión se aplica a un dominio de inmunoglobulina secretada 13 kDa (Ig) de la proteína de activación de receptor humano expresado en las células mieloides (2 hTREM2, residuos 19-132). TREM2 es una proteína transmembrana de tipo I que contiene un único dominio de Ig extracelular que tiene dos enlaces disulfuro y dos sitios de glicosilación unidos a N. A diferencia de muchas otras proteínas de dominio Ig 8, TREM2 no era susceptible de replegado de cuerpos de inclus...

Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

El objetivo general de esta técnica de expresión de proteínas de mamíferos es producir cantidades en el orden de miligramos de proteínas plegadas de forma nativa, adecuadas para estudios estructurales, biofísicos y funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un protocolo rápido y sencillo para obtener proteínas secretadas de mamíferos en la concentración y pureza necesarias para estudios estructurales. En general, observamos que la mayoría de los problemas relacionados con el rendimiento proteico se deben a la salud y viabilidad celular.Al monitorear de cerca la viabilidad celular y también los niveles de azúcar en el medio, se mejora considerablemente el rendimiento de proteína y se prolonga la utilidad de las células. También es muy importante monitorear la densidad celular. Hemos encontrado que si en algún momento antes de la transfección las células superan los 2 millones de células por mililitro, el rendimiento de proteína se reduce considerablemente. Para realizar un cultivo a gran escala de células 293F, suplemente un litro de medio 293F con 10 mililitros de glutamina 100x y cinco mililitros de penicilina-estreptomicina 100x.El antibiótico se encuentra a una concentración suficiente en condiciones libres de suero, y la concentración reducida de antibiótico mejora la viabilidad celular durante la transfección, lo que incrementa los rendimientos proteicos en el cultivo. Incubar las células 293F en 300 mililitros de medio en matraces Erlenmeyer de un litro de policarbonato con aletas y tapas ventiladas a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono, bajo agitación en un incubador estándar de cultivo celular, un día antes de la transfección; diluir las células hasta una densidad de 0,5 millones de células por mililitro el día de la transfección. Suplementar el medio de cultivo añadiendo un 10% en volumen de Cell Boost al 2% en peso por volumen en el medio 293F.Agregue kafu observado en este paso para controlar la glicosilación de las proteínas. Prepare soluciones de ADN y reactivo de transfección en medio libre de suero e incube durante cinco minutos. A continuación, agregue el reactivo de transfección a la solución de ADN en incrementos de un mililitro, mezclando.Incube suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de los complejos de ADN con el reactivo. Luego, agregue la solución a las células gota a gota y permita que las células transfectadas expresen la proteína durante 72 a 96 horas para purificar la glucoproteína. Primero, vierta cuidadosamente el cultivo en un frasco para centrífuga y centrifugue durante 20 minutos a 1300 Gs. Para obtener el sedimento celular, recoja el sobrenadante y, si es necesario, centrifugue una segunda vez y/o utilice un filtro de 0,22 micrones para clarificar el sobrenadante.A continuación, agregue un 10% en volumen de nitrato de níquel al 10x, ácido triacético o tampón de unión NTA-níquel. Luego, prepare una columna por gravedad a cuatro grados Celsius añadiendo dos mililitros de la suspensión de NTA-níquel a una columna y equilibrando con 10 volúmenes de columna del tampón de unión 1x, trabajando a cuatro grados Celsius. Pase el sobrenadante a través de la resina y recoja el flujo que atraviesa.Después de verter el sobrenadante a través de la columna, lave con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado. Luego, eluya la proteína en cinco volúmenes de columna de tampón de elución. Si se requiere desglicosilación para un volumen final de 0,5 mililitros, concentre el EIT hasta 0,43 mililitros utilizando un concentrador por centrifugación y pelete cualquier residuo mediante centrifugación a 16.000 ×g y 4 grados Celsius.Luego, agregue 50 microlitros de citrato de sodio 500 milimolar, pH 5,5 y 20 microlitros de endo hf. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas para eliminar el endo HF; primero lave la resina de amilosa tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Incube la proteína con la resina lavada durante una hora a cuatro grados Celsius.Después de la incubación, centrifugar durante cinco minutos a 1000 G para sedimentar la resina y recoger el sobrenadante. Concentrar la proteína utilizando un filtro de centrifugación con corte de peso molecular apropiado e intercambiar el tampón al tampón de almacenamiento indicado. A continuación se muestran resultados representativos de electroforesis SDS-PAGE para una proteína secretada expresada en células tratadas con cine tras cromatografía de afinidad por níquel.La primera banda corresponde a la proteína antes de la desglicosilación, y la segunda banda corresponde a la proteína después de la desglicosilación mediante endo Hf. La proteína glicosilada migra aproximadamente 10 kilodalton más alto y luego colapsa en una sola banda, consistente con el peso molecular predicho tras la desglicosilación, tras el único paso de purificación. Las cribas cristalográficas se montaron utilizando el método de gota colgante.La imagen superior muestra el primer cristal obtenido y la imagen inferior muestra las condiciones de cristalización optimizadas. Esto demuestra que la homogeneidad bioquímica de la proteína de interés puede ser un factor determinante para el éxito de la cristalización, y que un sistema de expresión mamífero optimizado produce proteínas adecuadas para esta cristalización. La purificación adicional de la proteína purificada por níquel se realiza fácilmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño.Este también es un paso útil para evaluar la producción de proteínas y optimizar las condiciones para obtener proteínas correctamente plegadas. La proteína de interés debe ser la especie predominante en la elución cromatográfica, y el volumen de elución debe corresponder al peso molecular de la proteína. Anteriormente, tiempos de EEU más tempranos pueden sugerir agregación o mal plegamiento de la proteína una vez dominado.Esta técnica puede realizarse en cuatro días si se lleva a cabo correctamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante mantener condiciones estériles para el cultivo celular. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como exclusión por tamaño, cromatografía, dispersión de luz de múltiples ángulos y fluorometría de exploración diferencial, con el fin de evaluar el estado de oligomerización y la estabilidad térmica de la proteína.

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Investigación

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Biología

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Presentamos los enfoques para la caracterización Biofísica y estructural de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por interferometría de biocapa, calorimetría isotérmica de titulación y Cristalografía de rayos x.

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Este protocolo describe una configuración para la cristalización del transportador de esteroles ABCG5/G8. ABCG5/G8 se reconstituye en biceles para la cristalización en gotas colgantes. El protocolo no requiere materiales ni sustratos especializados, por lo que es accesible y fácil de adaptar en cualquier laboratorio para la determinación de la estructura de la proteína mediante cristalografía de rayos X.

Cristalización ABCG5/G8 en un entorno de bicelas lipídicas para cristalografía de rayos X

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Aprende a expresar proteínas glicosiladas secretadas en células 293F de mamífero con este protocolo rápido y eficiente. Obtén cantidades de miligramos de proteínas plegadas nativamente para estudios estructurales y cristalización.

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

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