Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización
23 de diciembre de 2015
Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.
El objetivo general de esta técnica de expresión de proteínas de mamíferos es producir cantidades en el orden de miligramos de proteínas plegadas de forma nativa, adecuadas para estudios estructurales, biofísicos y funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un protocolo rápido y sencillo para obtener proteínas secretadas de mamíferos en la concentración y pureza necesarias para estudios estructurales. En general, observamos que la mayoría de los problemas relacionados con el rendimiento proteico se deben a la salud y viabilidad celular.
Al monitorear de cerca la viabilidad celular y también los niveles de azúcar en el medio, se mejora considerablemente el rendimiento de proteína y se prolonga la utilidad de las células. También es muy importante monitorear la densidad celular. Hemos encontrado que si en algún momento antes de la transfección las células superan los 2 millones de células por mililitro, el rendimiento de proteína se reduce considerablemente. Para realizar un cultivo a gran escala de células 293F, suplemente un litro de medio 293F con 10 mililitros de glutamina 100x y cinco mililitros de penicilina-estreptomicina 100x.
El antibiótico se encuentra a una concentración suficiente en condiciones libres de suero, y la concentración reducida de antibiótico mejora la viabilidad celular durante la transfección, lo que incrementa los rendimientos proteicos en el cultivo. Incubar las células 293F en 300 mililitros de medio en matraces Erlenmeyer de un litro de policarbonato con aletas y tapas ventiladas a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono, bajo agitación en un incubador estándar de cultivo celular, un día antes de la transfección; diluir las células hasta una densidad de 0,5 millones de células por mililitro el día de la transfección. Suplementar el medio de cultivo añadiendo un 10% en volumen de Cell Boost al 2% en peso por volumen en el medio 293F.
Agregue kafu observado en este paso para controlar la glicosilación de las proteínas. Prepare soluciones de ADN y reactivo de transfección en medio libre de suero e incube durante cinco minutos. A continuación, agregue el reactivo de transfección a la solución de ADN en incrementos de un mililitro, mezclando.
Incube suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de los complejos de ADN con el reactivo. Luego, agregue la solución a las células gota a gota y permita que las células transfectadas expresen la proteína durante 72 a 96 horas para purificar la glucoproteína. Primero, vierta cuidadosamente el cultivo en un frasco para centrífuga y centrifugue durante 20 minutos a 1300 Gs. Para obtener el sedimento celular, recoja el sobrenadante y, si es necesario, centrifugue una segunda vez y/o utilice un filtro de 0,22 micrones para clarificar el sobrenadante.
A continuación, agregue un 10% en volumen de nitrato de níquel al 10x, ácido triacético o tampón de unión NTA-níquel. Luego, prepare una columna por gravedad a cuatro grados Celsius añadiendo dos mililitros de la suspensión de NTA-níquel a una columna y equilibrando con 10 volúmenes de columna del tampón de unión 1x, trabajando a cuatro grados Celsius. Pase el sobrenadante a través de la resina y recoja el flujo que atraviesa.
Después de verter el sobrenadante a través de la columna, lave con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado. Luego, eluya la proteína en cinco volúmenes de columna de tampón de elución. Si se requiere desglicosilación para un volumen final de 0,5 mililitros, concentre el EIT hasta 0,43 mililitros utilizando un concentrador por centrifugación y pelete cualquier residuo mediante centrifugación a 16.000 ×g y 4 grados Celsius.
Luego, agregue 50 microlitros de citrato de sodio 500 milimolar, pH 5,5 y 20 microlitros de endo hf. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas para eliminar el endo HF; primero lave la resina de amilosa tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Incube la proteína con la resina lavada durante una hora a cuatro grados Celsius.
Después de la incubación, centrifugar durante cinco minutos a 1000 G para sedimentar la resina y recoger el sobrenadante. Concentrar la proteína utilizando un filtro de centrifugación con corte de peso molecular apropiado e intercambiar el tampón al tampón de almacenamiento indicado. A continuación se muestran resultados representativos de electroforesis SDS-PAGE para una proteína secretada expresada en células tratadas con cine tras cromatografía de afinidad por níquel.
La primera banda corresponde a la proteína antes de la desglicosilación, y la segunda banda corresponde a la proteína después de la desglicosilación mediante endo Hf. La proteína glicosilada migra aproximadamente 10 kilodalton más alto y luego colapsa en una sola banda, consistente con el peso molecular predicho tras la desglicosilación, tras el único paso de purificación. Las cribas cristalográficas se montaron utilizando el método de gota colgante.
La imagen superior muestra el primer cristal obtenido y la imagen inferior muestra las condiciones de cristalización optimizadas. Esto demuestra que la homogeneidad bioquímica de la proteína de interés puede ser un factor determinante para el éxito de la cristalización, y que un sistema de expresión mamífero optimizado produce proteínas adecuadas para esta cristalización. La purificación adicional de la proteína purificada por níquel se realiza fácilmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Este también es un paso útil para evaluar la producción de proteínas y optimizar las condiciones para obtener proteínas correctamente plegadas. La proteína de interés debe ser la especie predominante en la elución cromatográfica, y el volumen de elución debe corresponder al peso molecular de la proteína. Anteriormente, tiempos de EEU más tempranos pueden sugerir agregación o mal plegamiento de la proteína una vez dominado.
Esta técnica puede realizarse en cuatro días si se lleva a cabo correctamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante mantener condiciones estériles para el cultivo celular. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como exclusión por tamaño, cromatografía, dispersión de luz de múltiples ángulos y fluorometría de exploración diferencial, con el fin de evaluar el estado de oligomerización y la estabilidad térmica de la proteína.
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Descripción general
Este protocolo describe un método rápido y rentable para producir proteínas mamíferas secretadas y glicosiladas. Destaca la importancia del estado celular y del monitoreo de las condiciones para obtener altos rendimientos adecuados para estudios estructurales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Expresión de proteínas
- Estudios biofísicos
- Cristalografía de rayos X
Antecedentes
- Enfóquese en producir proteínas con plegamiento nativo.
- Importancia de la viabilidad celular y las condiciones del medio.
- El monitoreo de la densidad celular es crucial para el rendimiento.
- Utiliza células 293F para cultivo a gran escala.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo rápido para obtener proteínas de mamíferos.
- Asegurar que las proteínas sean adecuadas para estudios estructurales.
- Mejorar el rendimiento de las proteínas mediante un monitoreo cuidadoso.
Métodos Utilizados
- Transfección de células 293F.
- Suplementación del medio de cultivo con glutamina y penicilina-estreptomicina.
- Monitoreo de la salud celular y niveles de azúcar en el medio.
- Técnicas de cultivo a gran escala.
Resultados principales
- Obtuvo cantidades de miligramos de proteínas secretadas.
- Identificó las condiciones óptimas para el crecimiento celular y el rendimiento de proteínas.
- Demostró la eficacia del monitoreo de la densidad celular.
- Proporcionó un método confiable para la purificación de proteínas.
Conclusiones
- Este protocolo es eficaz para producir proteínas de mamíferos de alta calidad.
- La salud celular y su monitoreo son fundamentales para una expresión proteica exitosa.
- Adecuado para diversas aplicaciones estructurales y biofísicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción rápida y escalable de glicoproteínas de mamífero con plegado nativo es un cuello de botella crítico para la biología estructural y la caracterización biofísica en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Este protocolo permite la generación eficiente y la purificación en un solo paso de proteínas secretadas, apoyando directamente el diseño de fármacos basado en estructuras y la reducción de riesgos mecanicistas. Los flujos de trabajo optimizados reducen los obstáculos de tiempo y costo, acelerando el avance desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la producción de cantidades miligramo de glicoproteínas funcionales para el análisis estructural.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al proporcionar proteínas plegadas de forma nativa para ensayos biofísicos.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis y la confianza en los objetivos mediante reactivos proteicos de alta calidad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona proteínas purificadas adecuadas para el desarrollo de ensayos posteriores y plataformas de cribado.
- Mejora la reproducibilidad y la estandarización de los ensayos al garantizar la homogeneidad y calidad de las proteínas.
- Reduce la complejidad del flujo de trabajo mediante una purificación en un solo paso, facilitando la preparación para cribados a escala.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Proporciona proteínas validadas estructuralmente para estudios traslacionales de biomarcadores cuando sea pertinente.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar análisis biofísicos avanzados.
- Reduce el riesgo de fracasos en fases avanzadas al garantizar la calidad de las proteínas para estudios funcionales y estructurales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, proporcionando reactivos proteicos de alta calidad para flujos de trabajo estructurales, biofísicos y funcionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación de dianas basada en hipótesis y la elucidación de vías con glicoproteínas nativas.
- Selección: Proporciona proteínas homogéneas y reproducibles para el desarrollo robusto de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa del plegamiento proteico, la pureza y el estado de glicosilación para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación con formas proteicas relevantes a enfermedades para estudios posteriores, cuando sea aplicable.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y reutilizable para la producción rápida de proteínas frente a múltiples dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Optimiza los plazos de producción mediante protocolos estandarizados y escalables.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al permitir conocimientos estructurales tempranos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo y el avance de objetivos con estructuras tratables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células de mamífero y técnicas de purificación de proteínas.
- Necesita acceso a líneas celulares adaptadas a cultivo en suspensión, infraestructura para cultivo de tejidos y sistemas de cromatografía.
- Exige un monitoreo riguroso de la viabilidad celular, densidad y composición del medio para obtener rendimientos óptimos.
- Es adaptable a diversos blancos de glucoproteínas, aunque puede requerir optimización para constructos específicos.
- La evaluación de la calidad de la proteína (por ejemplo, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño) es esencial para el éxito en aplicaciones posteriores.
