Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

El objetivo general de esta técnica de expresión de proteínas en mamíferos es producir cantidades de miligramos de proteínas plegadas de forma nativa adecuadas para estudios estructurales, biofísicos y funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un protocolo rápido y sencillo para la obtención de proteínas secretadas de mamíferos y una concentración de pureza necesaria para los estudios estructurales. En general, encontramos que la mayoría de los problemas con el rendimiento de proteínas se deben a la salud y viabilidad de las células.

Al monitorear de cerca la viabilidad celular y también monitorear los niveles de azúcar de los medios, mejora en gran medida el rendimiento de proteínas y prolonga la utilidad de las células. También es muy importante controlar la densidad celular. Encontramos que si en cualquier momento antes de la transfección las células superan los 2 millones de células por mililitro, entonces la producción de proteínas se reduce considerablemente. Para realizar un cultivo a gran escala de 2 células 93 F, suplementar un litro de medio 2 93 F con 10 mililitros de 100 x glutamina y cinco mililitros de 100 x pluma estreptococo.

El antibiótico tiene una concentración suficiente en condiciones libres de suero y la concentración reducida de antibiótico mejora la viabilidad celular durante la transfección, lo que mejora el cultivo de proteínas y rendimientos. Los 2 matraces de Erlenmeyer con deflectores de policarbonato de un litro en 300 mililitros de medio en un litro con deflectores con tapas ventiladas a 37 grados Celsius con 8% de dióxido de carbono mientras se agitan en una incubadora de cultivo de tejidos estándar un día antes de la transfección diluyen las células a una densidad de 0,5 millones de células por mililitro el día de la transfección. Complemente el medio de cultivo agregando un 10% de volumen de 2% de peso por volumen de aumento de celda en 2 medios de 93 F.

Agregue kafu en este paso para controlar la glicosilación de proteínas. Prepare soluciones de ADN y reactivos de transfección en medios libres de suero, incube durante cinco minutos. A continuación, agregue el reactivo de transfección en la solución de ADN en incrementos de mezcla de un mililitro.

Incubar suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente para que se formen complejos de ADN reactivo. A continuación, añada la solución a las células gota a gota, deje que las células transfectadas expresen proteínas durante 72 a 96 horas para purificar la glicoproteína. Primero decantar el cultivo en un matraz centrífugo durante 20 minutos a 1300 Gs.To pellet las células, recoger el supernat y, si es necesario, centrifugar por segunda vez y/o utilizar un filtro de 0,22 micras para clarificar el sobrenadante.

A continuación, agregue un 10% de volumen de 10 x carga nitro de níquel, ácido triacético o tampón de unión NTA de níquel. A continuación, prepare una columna de gravedad a cuatro grados centígrados añadiendo dos mililitros de lechada de níquel NTA a una columna y equilibrándola con 10 volúmenes de columna de un tampón de unión x que funcione a cuatro grados centígrados. Hacer fluir el sobrenadante sobre la resina y recoger el flujo a través de ella.

Después de verter el sobrenadante, fluya sobre la columna, lave con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado. A continuación, eluir la proteína en cinco volúmenes de columna de tampón de elución. Si se requiere desglicosilación para un volumen final de 0,5 mililitros, concentre el EIT en 0,43 mililitros utilizando un concentrador de centrifugación para pellets los residuos mediante centrifugación a 16.000 GS y cuatro grados Celsius.

A continuación, añadir 50 microlitros de citrato de sodio de 500 milimolares, pH 5,5 y 20 microlitros de endo hf. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas para eliminar el endo HF, primero lavar tres veces la resina de amilosa en solución salina tamponada con fosfato. Incubar la proteína con la resina lavada durante una hora a cuatro grados centígrados.

Después de la incubación, centrifugar durante cinco minutos a 1000 Gs para pellet la resina y recoger el sobrenadante. Concentre la proteína utilizando un corte de peso molecular adecuado, un filtro de centrifugación y un intercambio de tampón en el tampón de almacenamiento que se muestra. Estos son los resultados representativos de la página SDS para una proteína secretada expresada en células tratadas con cine después de la cromatografía de afinidad de níquel.

El primer carril es la proteína antes de la desglicosilación, y el segundo carril es la proteína que sigue a la desglicosilación por endo hf. La proteína glicosilada corre unos 10 kilodaltons más alto y luego colapsa a una sola banda consistente con el peso molecular predicho después de la desglicosilación, después del único paso de purificación. Las pantallas de cristal se instalaron utilizando el método de caída colgante.

La imagen superior muestra el impacto inicial del cristal y la imagen inferior muestra las condiciones de cristalización optimizadas. Esto demuestra que la homogeneidad bioquímica de la proteína de interés puede ser un factor determinante para el éxito de la cristalización, y un sistema de expresión optimizado de mamíferos produce proteínas susceptibles para esta cristalización. La purificación adicional de la proteína purificada con níquel se realiza fácilmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Este también es un paso útil para evaluar la producción de proteínas y optimizar las condiciones para producir proteínas correctamente plegadas. La proteína de interés debe ser la especie principal en la elución cromatográfica, y el volumen de elución debe corresponder al peso molecular de la proteína. Anterior. Los tiempos de EEU pueden sugerir la agregación o el plegamiento incorrecto de la proteína una vez dominada.

Esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante mantener las condiciones estériles para el cultivo celular Después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como el tamaño, la cromatografía de exclusión, la dispersión de luz multiángulo y el escaneo diferencial, la fluorometría para evaluar el estado de oli ización y la estabilidad térmica de la proteína.