Name: Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a generar neutrofilia pulmonar mediante aerosol de lipopolisacárido en ratones. Este método permite evaluar la inflamación aguda pulmonar con distribución uniforme y reproducibilidad en modelos de lesión pulmonar.

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Nos gustaría dar las gracias a Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Suecia), Benita Dahlberg y el Dr. Anders Eklund (Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia), así como el Dr. Martin Stampfli (Universidad McMaster, Hamilton, ON, Canadá) para la asistencia hábil y el asesoramiento de expertos.

Los estudios con animales fueron aprobados por el comité de ética de bienestar animal Estocolmo norte. Los procedimientos experimentales se realizaron en cumplimiento de la legislación sueca. 1. Generación de un Aerosol LPS <ol><li> Disolver 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS en 50 ml de solución salina estéril con agitación suave y verificar la disolución. Diluir 1 ml disueltos LPS en 9 ml de solución salina estéril, a una concentración final de 1 mg / ml. Proteger de la luz con papel de aluminio y se almacena a -20 ° C. </li><li> Descongelar LPS solubilizados en la oscuridad a temperatura ambiente y mezclar bien inmediatamente antes del uso. </li><li> En un nivel II campana de bioseguridad ventilado, insertar una entrada de rojo en un nebulizador, y conectar el nebulizador al aire ambiente presurizado a través de la tubería proporcionada por el (esquema de revisión la presentación de los dispositivos experimentales en la Figura 1) fabricante. PRECAUCIÓN: el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una media pieza facial respirat reutilizableo con filtros de partículas, gafas, guantes y ropa de protección debe utilizarse durante el transcurso de la exposición. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Presentación esquemática de los dispositivos experimentales utilizados para la generación de un aerosol La entrada del nebulizador está conectado a un suministro de aire. La salida del nebulizador se conecta primero a un medidor de flujo a través de un tubo de 15,9 mm y un filtro de aire, y el suministro de aire se ajusta a 5,0 L / m en 2 kbar de presión. La salida está al lado conectado a una caja de plexiglás equipado con tapas removibles y 5 agujeros mm para evitar la acumulación de presión. <ol start="4"><li> Conectar la salida del nebulizador para un medidor de flujo de masa a través de un filtro de aire. Conectar el medidor de flujo de masa a un suministro eléctrico. </li><li> Ajuste el suministro de aire a 5 L / min, con una presión restante en 1,0-2,0 bar. </li><li> Retire el medidor de flujo de masa ydesconecte el suministro de aire. </li><li> Conectar la salida del nebulizador a un tubo de 15,9 mm, que se bifurca y se conecta a dos cajas de plexiglás con las dimensiones: 150 x 163 x 205 mm, equipados con tapas removibles. Cada caja debe tener un agujero de 5 mm en el lado opuesto a la entrada, para evitar la acumulación de presión. </li><li> Coloque un máximo de 5 ratones en cada caja de plexiglás y cerrar los párpados. </li><li> Abra el nebulizador y llenar el inserto con al menos 4 ml de LPS disuelto en solución salina o vehículo estéril solo (solución salina estéril; el volumen no debe superar los 8 ml). Vuelva a conectar la entrada de suministro de aire. </li><li> Permitir que el aerosol fluya hacia las cajas de plexiglás cerrados durante 10 min. Supervise a los animales de forma continua. Asegúrese de que el suministro de aire se mantiene firmemente asegurada a la entrada del nebulizador. </li><li> Desconecte el suministro de aire. Con los párpados cerrados, dejar que los animales permanecen en las cajas de plexiglás durante 2 min. </li><li> Abra las tapas y permitir el aerosol para dispersar, y devolver los animales a tél jaulas. Si los animales aparecen en húmedo, coloque las jaulas en una almohadilla térmica a baja temperatura, para evitar la hipotermia. </li><li> Supervise a los animales de forma continua durante los primeros 30 minutos, y posteriormente cada 2 h durante las primeras 6 horas. Los animales deben exhibir patrón respiratorio normal y la actividad durante y después del procedimiento de nebulización. </li></ol> 2. lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li> En el punto final experimental, profundamente anestesiar a los animales con isoflurano a efecto según lo recomendado por el personal veterinario de la institución. Apriete la pata posterior para verificar el reflejo de retirada para garantizar la suficiente profundidad de la anestesia para llevar a cabo una cirugía mayor. Pulverizar abajo de la piel de los animales con etanol al 70%. </li><li> Abra el abdomen con unas tijeras, y apartarán de la aorta para Exsanguinate animal. Coloque un pedazo de tejido sobre el abdomen para absorber la sangre. </li><li> Follwing eutanasia, utilice un solo corte anterior-posterior de las tijeras paraexponer el tórax. Levante la caja torácica por el extremo anterior del esternón y usar las tijeras para perforar el diafragma en el punto ventral más, sin cortar en cualquier lóbulo pulmonar. Abra la caja torácica haciendo dos cortes en la dirección antero-posterior (reuniones por debajo de la mandíbula). </li><li> Tire suavemente aparte de las costillas con unas pinzas, y cortar la tráquea por debajo de la laringe. </li><li> Levantar la tráquea con las pinzas y quitar los pulmones mediante la reducción de los ligamentos que conectan los lóbulos a la cavidad torácica, y tirando suavemente por el tejido adiposo y cardíaco. </li><li> Insertar un tubo de polietileno (diámetro interno: 0,58 mm; diámetro exterior: 0.965 mm) en la tráquea y asegurar el tubo con una cadena de hilo de seda. </li><li> Ate la multilobular (los cuatro lóbulos del pulmón derecho) con hilo de seda. </li><li> Inserte una aguja de calibre 23 en el tubo de polietileno e inyectar lentamente 250 l de PBS estéril fría en el lóbulo individual con una jeringa de 1 ml. </li><li> Golpee suavemente los pulmones30 veces y recoger el líquido a través de la jeringa. Repetir el procedimiento con 200 l de PBS (aproximadamente 300 l de PBS debería ser recuperado de la solo lóbulo del volumen total inyectado de 450 l). </li><li> Mantenga el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) en hielo, o enumerar las células BAL inmediatamente. Contar las células con un heamocytometer, utilizando la solución de Turk para teñir las células 11. Calcular el número total de células multiplicando el número de células con el factor de dilución de la solución de tinción y el volumen dentro del campo de contado de la heamocytometer. </li><li> Preparar los recuentos de células diferenciales a partir de células citocentrifugadas como se describe en otra parte 11. </li></ol> 3. La formalina Fijación de tejido pulmonar para la evaluación histológica <ol><li> Retire la multilobular y complemento de congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Montar una jeringa de 60 ml con el émbolo retirado en un soporte de apoyo de metal. Llene la jeringa con formol al 10% parala altura de 20 cm por encima de la mesa de laboratorio, que representan a 20 cm de presión constante. </li><li> Conectar la aguja de calibre 23 fijada a la tráquea a la jeringa 60 ml a través de un tubo de plástico con una válvula para controlar el flujo de formalina. </li><li> Insuflar el lóbulo pulmonar con formalina durante 5 min. Desconectar y retirar la aguja junto con el tubo de polietileno de la tráquea mientras tira del hilo de seda para cerrar la tráquea y retener la presión en el pulmón. </li><li> Sumerja el lóbulo pulmonar en formalina y fijar durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar el tejido fijado tres veces durante al menos 20 min con etanol al 70%, y deshidratar a xileno a través de la siguiente régimen (1 hr cada uno): <ul><li> 3x 70% de etanol </li><li> 3x 95% de etanol </li><li> 3x 100% de etanol </li><li> 3x xileno </li><li> 1x (líquido) de parafina </li></ul></li><li> Incrustar el tejido se deshidrataron en parafina, se cortaron en secciones de 4-5 micras, y mancha con hematoxilina y eosina para permitir la evaluación histológica.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
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</ol>

Abraham Roos ha recibido una cuota profesor de Boehringer Ingelheim, becas de viaje de AstraZeneca I + D y una beca de investigación de AstraZeneca I + D. Magnus Nord es un empleado a tiempo completo de AstraZeneca I + D y ha recibido becas de investigación de AstraZeneca I + D. Johan Grunewald y Tove Berg son co-investigadores en un proyecto de investigación relacionado financiado por AstraZeneca I + D.

Aerosol LPS genera una respuesta inflamatoria en las vías respiratorias, que se caracteriza por los neutrófilos en la submucosa epitelial, espacios que rodean las vías respiratorias conductoras, así como los espacios alveolares. Esto es, junto con el aumento del contenido de proteína total en BALF, indicativo de pérdida de plasma, representante de la patología de la lesión pulmonar aguda. Como LPS induce una inflamación estéril, la reacción es independiente de la respuesta inmune adaptativa, y hay limitaciones a la rele...

El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gram negativas 1. Desafío a LPS es un modelo bien documentado de la lesión pulmonar aguda, un síndrome caracterizado por la inflamación neutrofílica aguda y edema 2. Además, neutrofilia pulmonar es también una característica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) 3, y el desafío LPS en los seres humanos se ha utilizado para modelar las exacerbaciones de EPOC 4. Así, los modelos experimentales de la exposición LPS son clínicamente relevantes y herramientas valiosas para entender la patología humana. El objetivo de la administración pulmonar de aerosol LPS descritas aquí es generar una respuesta inflamatoria neutrofílica en la realización y vías respiratorias, sin afectación sistémica. Varias técnicas de exposición a LPS se han descrito anteriormente. Inyección intra-venosa de LPS es la ruta más común de administración. Aunque esta técnica es fácilmente accesible, tél daño primario es al endotelio, con la destrucción secundaria del epitelio pulmonar después de la migración de neutrófilos al pulmón. Administración intra-venosa también induce la inflamación sistémica 2, lo que puede complicar el cuadro clínico en modelos animales. La inflamación sistémica está en contraste no observado con la administración intra-traqueal. Esta técnica, sin embargo, es una labor intensiva y requiere anestésicos así como una considerable formación 5, 6. Además, la deposición pulmonar por esta vía de administración depende de la respiración 7. Por lo tanto, la deposición pulmonar se ve afectada por la profundidad de la anestesia necesaria para se pueden observar la administración traqueal intra y deposición variable en las vías respiratorias. En contraste, la administración pulmonar con LPS en aerosol requiere una formación mínima, y se puede lograr fácilmente en un gran número de animales con poca o ninguna variación entre individuos 5, 8.Un estudio reciente confirma que la administración en aerosol es superior a la ruta intra-traqueal con respecto a la deposición, y que las dosis más relevantes de LPS induce la inflamación neutrofílica con este modelo 8. Estudios anteriores han demostrado que desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS genera una respuesta inflamatoria marcada en el lumen de la vía aérea y parénquima pulmonar, incluyendo los espacios alveolares 9, 10. La inflamación se caracteriza por el predominio de neutrófilos y la presencia de edema pulmonar, y por lo tanto se puede utilizar para hacer frente a la patogénesis de la lesión pulmonar aguda y adquirir un mayor conocimiento de los mecanismos que contribuyen a la patología de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>LPS purificada de &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Peligrosa. Se recomienda purificación. Puede utilizarse LPS purificada de otras bacterias.</td></tr><tr><td>Nebulizador Pari LC sprint star</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>Flujómetro de masa TSI 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>Puede utilizarse un producto alternativo del proveedor.</td></tr><tr><td>Tubo Tygon de Saint-Gobain de 15,9 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>Marca recomendada.</td></tr><tr><td>Cajas de plexiglás con tapas extraíbles</td><td>Construcción personalizada</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (un orificio de 2 mm en el lateral).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirador semimascarilla reutilizable 3M</td><td>3M</td><td>7503</td><td>Marca recomendada.</td></tr><tr><td>Filtros particulados avanzados 3M (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>Marca recomendada.</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>Pueden utilizarse tijeras preferidas.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>Pueden utilizarse pinzas preferidas.</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno Intramedic PE50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Marca recomendada.</td></tr><tr><td>Hilo de seda Perma-hand 2-0 de Ethicon</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Marca recomendada.</td></tr><tr><td>Aguja de calibre 26 &amp;frac12;</td><td></td><td></td><td>Existen proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml con punta deslizable, no estéril, de BD</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>Existen proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Jeringa Luer-Lok de 60 ml, no estéril, de polipropileno, de BD</td><td>BD</td><td>301035</td><td>Existen proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Hematoxilina-Eosina Fluka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>Existen proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Solución de &amp;uuml;rk</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td></td><td></td><td>Existen fabricantes alternativos.</td></tr><tr><td>Citocentrífuga Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Puede utilizarse una centrífuga alternativa.</td></tr><tr><td>Kit de tinción HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>Existen kits de tinción alternativos.</td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Existen proveedores alternativos.</td></tr></tbody></table>

un método para generar pulmonar neutrofilia usando aerosol lipopolisacárido

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad grave caracterizada por neutrofilia alveolar, con opciones de tratamiento limitadas y una elevada mortalidad. Los modelos experimentales de ALI son clave para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad. El lipopolisacárido (LPS) derivadas de bacterias gram positivas induce la inflamación neutrofílica en las vías respiratorias y parénquima pulmonar de los ratones. La administración pulmonar eficiente de compuestos tales como LPS es, sin embargo, difícil de lograr. En el método descrito aquí, la administración pulmonar en ratones se logra mediante desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS. Disuelto LPS fue aerosol mediante un nebulizador conectado a aire comprimido. Los ratones fueron expuestos a un flujo continuo de LPS aerosol en una caja de plexiglás durante 10 min, seguido de 2 min acondicionado después se suspendió el aerosol. La intubación traqueal y posterior lavado broncoalveolar, seguido de una perfusión de formalina se realizaron siguiente, que permite la caracterización de la p estérilinflamación ulmonary. Aerosol LPS genera una inflamación pulmonar que se caracteriza por neutrofilia alveolar, detectado en el lavado broncoalveolar y por evaluación histológica. Esta técnica se puede configurar en un pequeño coste con unos aparatos, y requiere una formación mínima y experiencia. El sistema de exposición de este modo se puede realizar de forma rutinaria en un laboratorio, con el potencial de mejorar nuestra comprensión de la patología pulmonar.

Desafío a aerosol P. aeruginosa LPS por lo general produce una marcada respuesta inflamatoria en el lumen de las vías respiratorias y el espacio alveolar, que se caracteriza por el predominio de neutrófilos en ambos puntos temporales tempranos y tardíos. Aerosol LPS induce neutrofilia pulmonar Ratones C57BL / 6BY y BALB / c fueron expuestas a aerosol P. aeruginosa LPS o vehículo solo y neutrófilos se enumeran en BALF. El número total de células en ...

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

El objetivo general de este procedimiento es generar una neutrofilia en las vías respiratorias consistente y reproducible mediante la exposición a LPS nebulizado. Esto se logra primero cargando LPS suspendido en solución salina en un nebulizador conectado a una cámara de exposición. A continuación, los ratones se exponen al LPS nebulizado y luego se recoge el lavado broncoalveolar y se cuentan las células inflamatorias presentes en el lavado. Finalmente, el tejido pulmonar se fija, formalmente, para su inclusión, corte y análisis inmunohistoquímico. En última instancia, los recuentos totales y diferenciales de células en el lavado broncoalveolar pueden utilizarse para evaluar el reclutamiento de neutrófilos en los pulmones. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes, como la administración intratraqueal de LPS, son la distribución uniforme del LPS en aerosol en todo el pulmón, la facilidad de realización y la mínima capacitación necesaria para su aplicación exitosa. Para generar un aerosol de LPS utilizando el EPP adecuado y dentro de una campana de bioseguridad de nivel dos con ventilación, comience insertando una entrada roja en un nebulizador y luego co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Este video describe el procedimiento para generar una bolsa de aire en el tejido subcutáneo de ratones y recolectar exudados inflamatorios en respuesta a la administración de lipopolisacáridos in vivo. Este video también cubre el análisis de la infiltración de neutrófilos en la bolsa de aire.

Un modelo de ratón con bolsa de aire para la recolección de exudado inflamatorio inducido por lipopolisacáridos

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

El presente trabajo ilustra la conveniencia de utilizar la inmunoterapia sublingual para estimular la respuesta inmune innata en los pulmones y conferir protección contra la neumonía neumocócica aguda en ratones.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar que se empaquetan con miRNAs. Utiliza un sistema de cocultivo, demostramos que los exosomas liberados en el líquido del BAL interrumpen la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales y aumentan la expresión de citoquinas pro-inflamatorias que acentúan la lesión pulmonar.

Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a generar neutrofilia pulmonar mediante aerosol de lipopolisacárido en ratones. Este método permite evaluar la inflamación aguda pulmonar con distribución uniforme y reproducibilidad en modelos de lesión pulmonar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

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