Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

El objetivo general de este procedimiento es generar neutrofilia consistente y reproducible en las vías respiratorias mediante la exposición a LPS en aerosol. Esto se logra cargando primero LPS suspendido en solución salina en un nebulizador conectado a una cámara de exposición. A continuación, los ratones se exponen al LPS en aerosol y luego se recoge el lavado broncoalveolar y se enumeran las células inflamatorias en el lavado.

Finalmente, el tejido pulmonar se fija, formalmente para su inclusión y seccionamiento y análisis inmunohistoquímico. En última instancia, los recuentos celulares totales y diferenciales del lavado broncoalveolar se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos a los pulmones. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración intratraqueal de LPS, son la distribución uniforme de LPS en aerosol a través de los pulmones, la facilidad de ejecución y la capacitación mínima requerida para una aplicación exitosa. Para generar un aerosol de LPS utilizando el EPP adecuado y dentro de una campana de riesgo biológico ventilada de nivel dos, comience insertando una entrada roja en un nebulizador y luego conectando el nebulizador al aire ambiental presurizado por el tubo proporcionado por el fabricante.

A continuación, use un filtro de aire para conectar la salida del nebulizador a un medidor de flujo másico y luego conecte el medidor de flujo másico a un suministro eléctrico. Ajuste el flujo de aire a cinco litros por minuto, manteniendo la presión a uno o dos bares, y luego retire el medidor de flujo másico y desconecte el flujo de aire. A continuación, conecte la salida del nebulizador a un tubo bifurcado de 15,9 milímetros conectado a 2 cajas de plexiglás de 1 500 por 1 63 por 2 0 5 milímetros equipadas con tapas extraíbles.

Cada caja debe tener un orificio de cinco milímetros en el lado opuesto a la entrada para evitar la acumulación de presión. Ahora coloque hasta cinco ratones en cada caja y cierre las tapas. A continuación, abra el nebulizador.

Llene el inserto con cuatro a ocho mililitros de LPS disueltos en solución salina o solo en un vehículo salino, y vuelva a conectar la entrada al suministro de aire. Permita que el aerosol fluya hacia las cajas de plexiglás cerradas con monitoreo continuo de los animales y asegurándose de que el suministro de aire permanezca firmemente asegurado a la entrada del nebulizador durante la aerosolización. Después de 10 minutos, desconecte el suministro de aire y deje a los animales en las cajas de plexiglás durante otros dos minutos.

A continuación, abra las tapas. Deje que el aerosol se disperse y devuelva a los ratones a sus jaulas en el punto final experimental. Para cada animal a su vez, primero use unas tijeras para hacer un solo corte anterior posterior para exponer el tórax. A continuación, levante la caja torácica por la punta anterior del esternón y perfore el diafragma en el punto más ventral sin cortar ningún tejido pulmonar.

A continuación, abra la caja torácica con dos cortes que se unen por debajo de la mandíbula en la dirección anteroposterior. Una vez que se haya abierto la caja torácica, use fórceps para separarla suavemente y cortar la tráquea debajo de la laringe. Ahora levante la tráquea y corte los ligamentos que conectan los lóbulos pulmonares con la cavidad torácica.

A continuación, tire suavemente de los pulmones y la tráquea hacia arriba y lejos del tejido adiposo y cardíaco y colóquelos en un trozo de papel de paquete de jeringa. A continuación, inserta un tubo de polietileno de 0,965 milímetros en la tráquea y asegúralo con una tira de hilo de seda. Ata también el lóbulo múltiple con hilo de seda y luego inserta una aguja de calibre 23 en el tubo de polietileno.

Luego, para recoger el lavado broncoalveolar, use una jeringa de un mililitro para inyectar lentamente 250 microlitros de hielo llamado PBS estéril en el lóbulo individual, y para golpear cuidadosamente los pulmones y contra la superficie del banco de trabajo 30 veces, extraiga lentamente el líquido de regreso a la jeringa y recójalo en un tubo después de repetir el procedimiento con 200 microlitros de PBS fresco, Colocar el lavado broncoalveolar en hielo para su posterior análisis. Para fijar el tejido pulmonar para el análisis histológico, extraiga el lóbulo múltiple y chasquee. Congélalo sobre hielo seco.

Guarde el lóbulo a menos 80 grados centígrados. Para fijar el tejido para el análisis histológico, monte una jeringa de 60 mililitros sin émbolo en un soporte metálico e insufle el lóbulo individual con formalina durante cinco minutos. A continuación, desconecte la aguja y tire del hilo de seda para retirarlo junto con el tubo de polietileno de la tráquea.

Cerrando simultáneamente la tráquea y reteniendo la presión en el pulmón. A continuación, sumerja el lóbulo en formina durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lavar el tejido fijo tres veces durante al menos 20 minutos cada vez con etanol al 70%.

Después de incrustar el tejido deshidratado en una película para, corte el lóbulo en secciones de cuatro a cinco micras y tiña las secciones con hematina y eoína para la evaluación histológica. El número total de células en el líquido de lavado broncoalveolar de los ratones expuestos a un aerosol generado solo con el vehículo suele ser de alrededor o menos de 200.000 células. Las células consisten en un 95 a 100% de células mononucleares con solo unos pocos linfocitos y sin neutrófilos.

Ratones desafiados con un miligramo por mililitro de aerosol. LPS. Sin embargo, exhiben un aumento del número total de células en el líquido de lavado broncoalveolar, típicamente superior a 500.000 células después de seis horas, con infiltrados celulares que permanecen altos después de 24 horas, y con un perfil celular desplazado hacia un predominio de neutrófilos. También se observa un perfil de células inflamatorias y neutrofilia pulmonar similar con nebulización de cinco miligramos por mililitro de LPS.

Se observaron neutrófilos en la submucosa epitelial, así como en los espacios que rodean las vías respiratorias conductoras y los vasos sanguíneos después de seis y 24 horas de exposición con LPS, pero no en control. Ratones tratados con solución salina. El contenido total de proteínas en el líquido de lavado broncoalveolar de los ratones de desafío con LPS aumenta en comparación con los ratones expuestos a solución salina y la expresión de las quimiocinas atrayentes de neutrófilos c, XCL one y C XCL dos también aumenta en los ratones desafiados con LPS.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la inflamación pulmonar inducida por LP. También se puede aplicar a otros modelos de enfermedades, como infecciones bacterianas o virales, ya que el vapor en aerosol se puede adaptar para ofrecer muchos desafíos diferentes.