Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido
15 de diciembre de 2014
Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.
El objetivo general de este procedimiento es generar neutrofilia consistente y reproducible en las vías respiratorias mediante la exposición a LPS en aerosol. Esto se logra cargando primero LPS suspendido en solución salina en un nebulizador conectado a una cámara de exposición. A continuación, los ratones se exponen al LPS en aerosol y luego se recoge el lavado broncoalveolar y se enumeran las células inflamatorias en el lavado.
Finalmente, el tejido pulmonar se fija, formalmente para su inclusión y seccionamiento y análisis inmunohistoquímico. En última instancia, los recuentos celulares totales y diferenciales del lavado broncoalveolar se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos a los pulmones. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración intratraqueal de LPS, son la distribución uniforme de LPS en aerosol a través de los pulmones, la facilidad de ejecución y la capacitación mínima requerida para una aplicación exitosa. Para generar un aerosol de LPS utilizando el EPP adecuado y dentro de una campana de riesgo biológico ventilada de nivel dos, comience insertando una entrada roja en un nebulizador y luego conectando el nebulizador al aire ambiental presurizado por el tubo proporcionado por el fabricante.
A continuación, use un filtro de aire para conectar la salida del nebulizador a un medidor de flujo másico y luego conecte el medidor de flujo másico a un suministro eléctrico. Ajuste el flujo de aire a cinco litros por minuto, manteniendo la presión a uno o dos bares, y luego retire el medidor de flujo másico y desconecte el flujo de aire. A continuación, conecte la salida del nebulizador a un tubo bifurcado de 15,9 milímetros conectado a 2 cajas de plexiglás de 1 500 por 1 63 por 2 0 5 milímetros equipadas con tapas extraíbles.
Cada caja debe tener un orificio de cinco milímetros en el lado opuesto a la entrada para evitar la acumulación de presión. Ahora coloque hasta cinco ratones en cada caja y cierre las tapas. A continuación, abra el nebulizador.
Llene el inserto con cuatro a ocho mililitros de LPS disueltos en solución salina o solo en un vehículo salino, y vuelva a conectar la entrada al suministro de aire. Permita que el aerosol fluya hacia las cajas de plexiglás cerradas con monitoreo continuo de los animales y asegurándose de que el suministro de aire permanezca firmemente asegurado a la entrada del nebulizador durante la aerosolización. Después de 10 minutos, desconecte el suministro de aire y deje a los animales en las cajas de plexiglás durante otros dos minutos.
A continuación, abra las tapas. Deje que el aerosol se disperse y devuelva a los ratones a sus jaulas en el punto final experimental. Para cada animal a su vez, primero use unas tijeras para hacer un solo corte anterior posterior para exponer el tórax. A continuación, levante la caja torácica por la punta anterior del esternón y perfore el diafragma en el punto más ventral sin cortar ningún tejido pulmonar.
A continuación, abra la caja torácica con dos cortes que se unen por debajo de la mandíbula en la dirección anteroposterior. Una vez que se haya abierto la caja torácica, use fórceps para separarla suavemente y cortar la tráquea debajo de la laringe. Ahora levante la tráquea y corte los ligamentos que conectan los lóbulos pulmonares con la cavidad torácica.
A continuación, tire suavemente de los pulmones y la tráquea hacia arriba y lejos del tejido adiposo y cardíaco y colóquelos en un trozo de papel de paquete de jeringa. A continuación, inserta un tubo de polietileno de 0,965 milímetros en la tráquea y asegúralo con una tira de hilo de seda. Ata también el lóbulo múltiple con hilo de seda y luego inserta una aguja de calibre 23 en el tubo de polietileno.
Luego, para recoger el lavado broncoalveolar, use una jeringa de un mililitro para inyectar lentamente 250 microlitros de hielo llamado PBS estéril en el lóbulo individual, y para golpear cuidadosamente los pulmones y contra la superficie del banco de trabajo 30 veces, extraiga lentamente el líquido de regreso a la jeringa y recójalo en un tubo después de repetir el procedimiento con 200 microlitros de PBS fresco, Colocar el lavado broncoalveolar en hielo para su posterior análisis. Para fijar el tejido pulmonar para el análisis histológico, extraiga el lóbulo múltiple y chasquee. Congélalo sobre hielo seco.
Guarde el lóbulo a menos 80 grados centígrados. Para fijar el tejido para el análisis histológico, monte una jeringa de 60 mililitros sin émbolo en un soporte metálico e insufle el lóbulo individual con formalina durante cinco minutos. A continuación, desconecte la aguja y tire del hilo de seda para retirarlo junto con el tubo de polietileno de la tráquea.
Cerrando simultáneamente la tráquea y reteniendo la presión en el pulmón. A continuación, sumerja el lóbulo en formina durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lavar el tejido fijo tres veces durante al menos 20 minutos cada vez con etanol al 70%.
Después de incrustar el tejido deshidratado en una película para, corte el lóbulo en secciones de cuatro a cinco micras y tiña las secciones con hematina y eoína para la evaluación histológica. El número total de células en el líquido de lavado broncoalveolar de los ratones expuestos a un aerosol generado solo con el vehículo suele ser de alrededor o menos de 200.000 células. Las células consisten en un 95 a 100% de células mononucleares con solo unos pocos linfocitos y sin neutrófilos.
Ratones desafiados con un miligramo por mililitro de aerosol. LPS. Sin embargo, exhiben un aumento del número total de células en el líquido de lavado broncoalveolar, típicamente superior a 500.000 células después de seis horas, con infiltrados celulares que permanecen altos después de 24 horas, y con un perfil celular desplazado hacia un predominio de neutrófilos. También se observa un perfil de células inflamatorias y neutrofilia pulmonar similar con nebulización de cinco miligramos por mililitro de LPS.
Se observaron neutrófilos en la submucosa epitelial, así como en los espacios que rodean las vías respiratorias conductoras y los vasos sanguíneos después de seis y 24 horas de exposición con LPS, pero no en control. Ratones tratados con solución salina. El contenido total de proteínas en el líquido de lavado broncoalveolar de los ratones de desafío con LPS aumenta en comparación con los ratones expuestos a solución salina y la expresión de las quimiocinas atrayentes de neutrófilos c, XCL one y C XCL dos también aumenta en los ratones desafiados con LPS.
Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la inflamación pulmonar inducida por LP. También se puede aplicar a otros modelos de enfermedades, como infecciones bacterianas o virales, ya que el vapor en aerosol se puede adaptar para ofrecer muchos desafíos diferentes.
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Descripción general
Este artículo describe un método para inducir inflamación pulmonar neutrófila mediante nebulización de lipopolisacárido (LPS) en aerosol, modelando una lesión pulmonar aguda. También describe técnicas quirúrgicas básicas para aislamiento pulmonar, intubación traqueal y lavado broncoalveolar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inflamación pulmonar
- Lesión pulmonar aguda
Antecedentes
- El LPS aerosolizado se utiliza para crear un modelo para el estudio de la inflamación neutrófila.
- El lavado broncoalveolar permite la recolección de células inflamatorias.
- Comprender el reclutamiento de neutrófilos es fundamental para estudiar las enfermedades pulmonares.
- Este método ofrece ventajas frente a las técnicas tradicionales de administración de LPS.
Objetivo del estudio
- Generar una neutrofilia en las vías respiratorias de manera consistente en un entorno controlado.
- Evaluar el reclutamiento de neutrófilos hacia los pulmones.
- Mejorar los métodos existentes para inducir inflamación pulmonar.
Métodos Utilizados
- Cargar LPS suspendido en solución salina en un nebulizador.
- Exponer a los ratones al LPS en aerosol en una cámara de exposición.
- Recoger el lavado broncoalveolar para la enumeración celular.
- Fijar el tejido pulmonar para el análisis inmunohistoquímico.
Resultados principales
- Se demostró una reclutamiento eficaz de neutrófilos mediante LPS aerosolizado.
- Se proporcionó un método confiable para evaluar la inflamación pulmonar.
- Se mostraron ventajas en distribución y facilidad de uso en comparación con los métodos intratraqueales.
- Permitió un análisis detallado de las respuestas inflamatorias en el tejido pulmonar.
Conclusiones
- El método de LPS aerosolizado es una herramienta valiosa para estudiar la inflamación pulmonar.
- Esta técnica permite obtener resultados reproducibles en entornos de investigación.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar intervenciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la inducción reproducible de neutrofilia pulmonar, una característica patológica clave en lesión pulmonar aguda y enfermedades pulmonares inflamatorias. Al proporcionar un sistema estandarizado y de bajo costo para la administración por aerosol, apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en programas tempranos de descubrimiento centrados en la patología pulmonar mediada por neutrófilos. El enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos mediante la generación de lecturas inflamatorias cuantificables relevantes para el cribado terapéutico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de reclutamiento de neutrófilos y las vías de quimioquinas, como CXCL1 y CXCL2, en un entorno inflamatorio controlado.
- Valor operativo: Proporciona un modelo estandarizado para evaluar la interacción con el blanco y la modulación de vías en la inflamación pulmonar mediada por neutrófilos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantificables de lavado broncoalveolar, incluyendo recuentos totales y diferenciales de células y niveles totales de proteínas, para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita el desarrollo de puntos finales inflamatorios reproducibles para la selección de compuestos que modulan la afluencia o activación de neutrófilos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela la inflamación neutrófila relevante para la enfermedad observada en lesión pulmonar aguda humana, lo que apoya la alineación translacional de biomarcadores.
- Valor operativo: Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la evaluación consistente de compuestos antiinflamatorios o moduladores de neutrófilos entre estudios.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para programas centrados en la inflamación pulmonar y la lesión tisular mediada por neutrófilos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre las vías de quimiotaxis de neutrófilos y la modulación de la cascada inflamatoria en el parénquima pulmonar.
- Tamizaje: Proporciona una inflamación neutrófila estandarizada para un tamizaje fiable de compuestos y validación de dianas en modelos de enfermedades pulmonares.
- Analítica: Ofrece lecturas cuantitativas de lavado broncoalveolar (recuentos celulares, niveles de proteína, porcentaje de neutrófilos) para comparar respuestas inflamatorias entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Modela una inflamación pulmonar neutrófila relevante para el ser humano, permitiendo continuidad preclínica para lesión pulmonar aguda y otras indicaciones relacionadas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de bajo costo y con mínima capacitación requerida, apta para uso repetido en múltiples proyectos que estudian inflamación pulmonar o interacciones huésped-patógeno.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la variabilidad en la inducción de la inflamación neutrófila.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y escalabilidad mediante la administración estandarizada de aerosoles y requisitos mínimos de experiencia técnica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar fenotipos inflamatorios mecanísticamente relevantes y cuantificables en las primeras etapas del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basándose en datos consistentes de reclutamiento de neutrófilos y expresión de quimioquinas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación básica en la generación de aerosoles, manipulación de ratones y técnica de lavado broncoalveolar.
- Depende del acceso a un nebulizador, fuente de aire comprimido, cámara de exposición de plexiglás y cabina de seguridad biológica para el manejo de LPS.
- Necesita la estandarización de la concentración de LPS, la duración de la exposición y las condiciones posteriores a la exposición entre laboratorios para permitir la comparabilidad entre estudios.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el sistema para la administración de otros agentes aerosolizados, como patógenos virales o bacterianos.
- Limitado a investigaciones exploratorias no GMP; no es adecuado para toxicología regulada ni para la producción de materiales clínicos sin una validación adicional.
