Name: Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Aprende una técnica no invasiva de intubación endotraqueal orofaríngea para administrar lipopolisacáridos en ratones. Este método permite evaluar respuestas inflamatorias pulmonares con precisión en modelos preclínicos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.: 81903902), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.: 2019M663457), el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (No.: 2020YJ0172) y el Proyecto de Premoción de Investigación Académica Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No.: QJRC2022053).

El protocolo de experimentación con animales fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/BL (20-25 g, 6-8 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.
1. Preparación
<ol><li>Asegúrese de que la plataforma de intubación consista en una base, un elevador, un clip, dos bandas elásticas y algunas cuerdas. Tome una cuerda, pase la cuerda a través de los dos orificios en la parte superior del elevador y ate los dos extremos de la cuerda, respectivamente, a las pequeñas protuberancias en la parte superior del elevador. NOTA: Deje espacio para que la cabeza del ratón pase entre la cuerda y los dos agujeros.</li>
	<li>Ate dos bandas elásticas a cada extremo del clip y pegue el clip con las bandas elásticas en la parte posterior del elevador. Finalmente, fije el elevador a la base a 90° (Figura 1).</li>
	<li>Seleccione una cánula del tamaño y la longitud adecuados. Para un ratón de 20-30 g, se puede usar un catéter de 22 G (2.5-3.8 cm de largo)11. Ensamble la cánula en un bolígrafo de cánula y encienda la luz de la pluma (Figura 2).</li>
	<li>Prepare pequeños fórceps quirúrgicos y una pipeta Pasteur desinfectándolos con alcohol al 70%.</li>
</ol>2. Preparación del compuesto problema
<ol><li>Pesar y disolver 3 mg de LPS en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.2) para formar una solución de LPS con una concentración de 3 mg/ml.</li>
	<li>Pesar y disolver 10 mg de pentobarbital sódico en 1 ml de solución salina normal para formar una solución de pentobarbital sódico al 1%. Filtre y esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,45 μm.</li>
</ol>3. Instilación orofaríngea no invasiva
<ol><li>Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 50 mg/kg12,13. Determinar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al reflejo de enderezamiento.</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación. Fije los dientes frontales superiores con el hilo y los dos antepiés con las bandas elásticas (Figura 3).</li>
	<li>Saque la lengua con pinzas y sosténgala con la mano izquierda. Empuje la cánula lentamente, a lo largo de la boca, con la mano derecha hacia arriba, hacia la epiglotis. Use la luz de la pluma de la cánula para encontrar la tráquea e insértela lentamente en la tráquea (Figura 4).</li>
	<li>Después de insertar la cánula en la tráquea, retire la pluma de intubación lentamente y deje la cánula dentro. Inserte la pipeta Pasteur en la junta de la cánula y presione el cabezal (figura 5). NOTA: Si el pecho del ratón sobresale, entonces la intubación es exitosa (Figura 6).</li>
	<li>Después de una intubación endotraqueal exitosa, instilar a los ratones 3 mg/ml de LPS a 3 mg/kg a través de la cánula utilizando una microjeringa de cabeza plana14,15 (Figura 7).</li>
	<li>Una vez hecho esto, retire la cánula y la microjeringa. Retire el ratón del andamio y colóquelo en una jaula por separado para recuperarse. Observar el estado respiratorio del ratón hasta que se haya recuperado y recuperado la conciencia. NOTA: A las 12 h después de la instilación traqueal de LPS, eutanasia a los ratones siguiendo el procedimiento aprobado por el comité de ética animal. Los ensayos séricos de TNF-α y las mediciones de peso pulmonar seco-húmedo se realizaron mediante procedimientos estándar.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+human+amnion+epithelial+cells+through+endotracheal+instillation+against+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Xi+Bao+Yu+Fen+Zi+Mian+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice.</a> Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Lab+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
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<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT6+inhibits+ferroptosis+and+alleviates+acute+lung+injury+by+regulating+P53%2FSLC7A11+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway.</a> Cell Death & Disease. 13 (6), 530(2022).</li>
<li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+operational+tolerance+and+generation+of+regulatory+cells+after+intratracheal+delivery+of+alloantigen+combined+with+nondepleting+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).</li>
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<li>Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oridonin+protects+LPS-induced+acute+lung+injury+by+modulating+Nrf2-mediated+oxidative+stress+and+Nrf2-independent+NLRP3+and+NF-%CE%BAB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways.</a> Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62(2019).</li>
<li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).</li>
<li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repeated orotracheal intubation in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60844(2020).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+packaging+IL-1%CE%B2+and+TNF-%CE%B1+enhance+lung+inflammatory+response+to+mechanical+ventilation+in+part+by+induction+of+cofilin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling.</a> International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).</li>
<li>Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Jilin+University%22">Jilin University</a>. , Master's Thesis (2010).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+acute+lung+injury+mice+model+established+by+intranasal+and+intratracheal+instillation+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).</li>
<li>Luckow, B., Lehmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+bronchoalveolar+lavage+in+mice+by+orotracheal+intubation+avoiding+tracheotomy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy.</a> BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inicialmente, miramos dentro de la cavidad oral para encontrar la ubicación de la tráquea19. Sin embargo, durante este proceso, descubrimos que la tráquea de los ratones C57 / BL es estrecha, lo que dificulta encontrar la ubicación correcta por este método sin la ayuda de equipos como un endoscopio20. Tras una exploración adicional, descubrimos que la luz de la lámpara del intubador podría penetrar en la superficie del cuerpo, lo que permite al operador determinar la posici...

La lesión pulmonar aguda (LPA) es un síndrome clínico común. Bajo una variedad de factores patógenos, la ruptura de la barrera fisiológica de las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares conduce a un aumento de la permeabilidad alveolar, causando así disminución de la distensibilidad pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es la forma más grave de LPA. La inflamación incontrolada y el daño por estrés oxidativo se consideran las principales causas de ALI y el SDRA más grave2. Cuando las células epiteliales alveolares se lesionan directamente debido a un traumatismo, se activa la cadena de respuesta inflamatoria de los macrófagos alveolares, lo que lleva a la inflamación en el pulmón3. A nivel mundial, hay más de 3 millones de pacientes con SDRA agudo por año, y representan aproximadamente el 10% de los ingresos en la unidad de cuidados intensivos; Además, la tasa de mortalidad en casos graves es tan alta como 46%4,5,6. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer un modelo animal adecuado de ALI para estudiar su patogénesis. El ratón es el animal experimental más utilizado en el estudio de la ALI, ya que su tracto respiratorio puede simular bien el tracto respiratorio humano para estudios de ALI. Además, ALI se manifiesta como infiltración masiva de células inflamatorias, aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y edema pulmonar. Los cambios en las citocinas inflamatorias en suero y la relación pulmón peso seco-húmedo reflejan el grado de ALI7.
En la actualidad, los principales métodos para modelar la ALI inducida por LPS en ratones incluyen la intubación traqueal intranasal y quirúrgica 8,9. Aquí, proponemos un nuevo método para administrar LPS en la tráquea a través de la intubación orofaríngea no invasiva. Este método utiliza un intubador iluminado para encontrar la tráquea del ratón y luego administra LPS en la tráquea y el pulmón. Este método administra LPS a los pulmones con mayor precisión que el método de administración intranasal. En comparación con la intubación traqueal quirúrgica, este método no requiere cirugía, evita causar heridas y reduce el dolor en ratones10. Por lo tanto, este método se puede utilizar para establecer un modelo de ratón más convincente de ALI.

<table><tbody><tr><td>Lipopolisacárido</td><td>MERK</td><td>L4130</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de microlitro</td><td>LPS SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD</td> 10028505008124 <td></td><td>Para entregar LPS</td></tr><tr><td>Cánula de ratón</td><td>RWD Life Science</td><td>803-03008-00</td><td>Cánula</td>de</tr><tr><td>ratón Kit de intubación para ratón</td><td>RWD Life Science</td><td>903-03027-00</td><td>Incluyendo una base, un elevador, un intubador, una pinza quirúrgica y algunos cuerdas</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Biosharp ciencias</td> de la vida <td>BS-XG-03</td><td>Para verificar el éxito de la intubación</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Beijing Chemical Co., China</td><td>20220918</td><td>Para anestesiar ratones</td></tr></tbody></table>

instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

El modelo de ratón de lesión pulmonar aguda (ALI) inducido por lipopolisacárido (LPS) o endotoxina sigue siendo uno de los modelos más utilizados en estudios con animales de lesión pulmonar aguda o inflamación aguda. Los métodos actuales más utilizados en modelos de ratón con lesión pulmonar aguda son una inyección intraperitoneal de LPS y una traqueostomía para la infusión traqueal de LPS. Sin embargo, el primer método carece de orientación pulmonar y daña otros órganos, y el segundo método induce trauma operatorio, riesgo de infección y una baja tasa de supervivencia. Aquí, recomendamos un método no invasivo de intubación endotraqueal orofaríngea para la instilación de LPS en ratones. En este método, el LPS se introduce de forma no invasiva en la tráquea a través de la cavidad orofaríngea para ser instilado en el pulmón con la ayuda de un aparato para la intubación endotraqueal. Este método no solo asegura la orientación pulmonar, sino que también evita el daño y el riesgo de muerte en los animales. Esperamos que este enfoque se utilice ampliamente en el campo de la lesión pulmonar aguda.

El método propuesto para la instilación de LPS en ratones se verificó evaluando la expresión de la citoquina inflamatoria TNF-α y la relación de peso seco-húmedo del pulmón 12 h después de la instilación de LPS. Hubo cuatro grupos en el experimento: control en blanco (sin ningún tratamiento), intubación quirúrgica16, intranasal17,18 e intubación orofaríngea no invasiva (n = 6). En comparación con el grupo c...

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Nuestro protocolo propone un nuevo método de administración no invasivo de LPS desde la tráquea hasta el pulmón, con mayor precisión. Las personas que están probando este método por primera vez deben poner mucho esfuerzo en encontrar la posición de la tráquea. Para preparar la plataforma de intubación, pase la cuerda a través de los dos orificios y ate sus extremos a las pequeñas protuberancias en la parte superior del elevador.Luego, coloque dos bandas elásticas en cada extremo del clip y péguelas con cinta adhesiva a la parte posterior del elevador. Finalmente, fije el elevador a la base en un ángulo de 90 grados. Ensamble la cánula en una cánula y encienda la luz de la pluma.A continuación, desinfecte las pinzas quirúrgicas pequeñas y la pipeta Pasteur con alcohol al 70%. Para preparar la solución del compuesto de prueba, agregue tres miligramos de lipopolisacárido, o LPS, en un mililitro de pH 7.2 PBS. Luego, disuelva 10 miligramos de pentobarbital sódico en un mililitro de solución salina normal y filtre la solución con un filtro de jeringa de 0.45 micrómetros.Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación. Luego fije los dientes frontales superiores con la cuerda

noninvasive-intratracheal-lipopolysaccharide-instillation-in-mice

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Investigación

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Biología

Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Fuente: Radulovic, K., et al. Inyecciones de lipopolisacáridos en ratones para simular la entrada de productos de origen microbiano tras la ruptura de la barrera intestinal. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra un procedimiento paso a paso para inyectar lipopolisacáridos (LPS) en ratones de forma intraperitoneal para inducir inflamación sistémica.

Inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos bacterianos en ratones para estudiar las respuestas inmunitarias sistémicas

El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.

No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

La instilación de reactivos intratraqueal mediada por intubación (IMIT) es un método excelente y no invasivo para estudiar las enfermedades respiratorias, así como un método para instilar reactivos terapéuticos directamente en el pulmón. Es un método rápido y altamente reproducible que es adecuado para pruebas preclínicas.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Demostramos el procedimiento para la inoculación intratraqueal de Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de ratones. Se trata de una herramienta muy útil para estudiar las vías de señalización que regulan la inflamación de las vías respiratorias en modelos de ratón.

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Las formulaciones de polvo seco para inhalación tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades respiratorias. Antes de entrar en estudios en humanos, es necesario evaluar la eficacia de la formulación de polvo seco en estudios preclínicos. Un método simple y no invasor de la administración del polvo seco en ratones a través de la ruta intratraqueal se presenta.

Administración Intratraqueal De La Formulación De Polvo Seco En Ratones

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende una técnica no invasiva de intubación endotraqueal orofaríngea para administrar lipopolisacáridos en ratones. Este método permite evaluar respuestas inflamatorias pulmonares con precisión en modelos preclínicos.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

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