Name: Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a aislar células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas mediante digestión enzimática y cultivo. Este método permite obtener cultivos epiteliales puros para aplicaciones en investigación oncológica y medicina personalizada.

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Nos gustaría dar las gracias al personal del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota para obtener ayuda con la recolección de muestras de tejido de pacientes. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa de los Programa de Investigación de Cáncer de ovario (OCRP) OC093424 a MB, por la máquina de afeitar de la Investigación del Cáncer y el Fondo Randy Comunidad MB, por el ovario Cancer Alliance Minnesota para MB y por el fondo de Oncología Ginecológica Departamental de MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Declaración de Ética Muestras sólidas de cáncer de ovario se obtuvieron del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota (TPF), después de Comité de la Junta de Revisión Institucional: Sujeto Humano Board (IRB). 1. Configuración Reactivo <ol><li> Preparar medio DMEM completo completándolo DMEM con FBS al 10%, y 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Almacenar el medio a 4 º C y se calienta a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Alícuota dispasa II en volúmenes separados de 5-10 ml para evitar la congelación múltiple se descongela y se almacenan a -20 ° C en un congelador-nonfrost libre. </li></ol> 2. Tissue Collection <ol><li> Obtener muestras de sólidos de cáncer de ovario (~ 5 g de tamaño) en el momento de la cirugía de las zonas macroscópicamente identificados como cáncer por un patólogo. Las muestras clínicas son de-identificados y registrados de acuerdo con protocolos institucionales. </li><li> Coloque las muestras en un recipiente estéril, sctapa Rew, polipropileno especímenes recipiente lleno con 30 ml de PBS enfriado en hielo. Transportar las muestras del laboratorio de patología quirúrgica para el laboratorio de investigación para el procesamiento en el hielo, y en 30 minutos desde la recogida de muestras (Figura 1). </li></ol> 3. Procesamiento de tejidos <ol><li> Trabajar en condiciones estériles, transferir las muestras en una placa de Petri (60 mm x 60 mm) que contenían 10 ml de fresca, helado de PBS y el uso de una hoja de afeitar estéril, más cortado en los pedazos más pequeños posibles (2 mm o menos) ( Las Figuras 2A y 2 B). </li><li> Transferir los tejidos picados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de precalentado (37 ° C durante 30 min) dispasa II (2,4 U / ml) en DMEM y se incuba a 5% de CO 2 y 37 ° C durante 30 min. Para garantizar una digestión óptima de los especímenes, agitar manualmente la suspensión de células cada 5 min. </li><li> Después de 30 min de incubación, la transferencia (utilizandouna pipeta serológica de 10 ml) de la suspensión de células en un filtro de células (70 micras de malla) colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y se aplica una presión suave contra la malla usando un émbolo de la jeringa. Descarte cualquier tejido no disociado (que queda en la parte superior de la malla) y recoger la suspensión de células obtenida en el tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 xg durante 7 min a 4 ° C (Figura 3). </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS. </li><li> Incubar la suspensión de células en una placa de Petri en 5% de CO 2 y 37 ° C (Figura 4). </li><li> Cambie el medio después de 24 horas a partir de la placa inicial. Esto permite la eliminación de los desechos celulares y la mayoría de los eritrocitos presentes en la cultura. </li><li> Cambie el medio cada tres días para las dos semanas siguientes, después de lo cual las culturas de EOC primaria están listos para aplicaciones posteriores. </li></ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
<li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+normal%2C+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li>
<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una mejor comprensión de la etiología del cáncer de ovario y el desarrollo es crucial para mejorar el resultado de las mujeres afectadas por esta enfermedad devastadora. En este contexto, el uso de establecida y &quot;comercialmente disponible&quot; línea celular de cáncer de ovario, sin duda, ha sido tremendamente útil. Sin embargo, hoy sabemos que las líneas celulares de cáncer no son representativos del tumor humano se originaron en muchos aspectos, incluyendo la falta de heterogeneidad 9,10. <p class=...

A pesar de su relativamente baja incidencia, el cáncer de ovario es el más mortal de las enfermedades ginecológicas y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas fiables y modelos que recapitulan fielmente la iniciación y progresión de la enfermedad 3. La mayor parte de nuestro conocimiento hoy en día sobre el cáncer de ovario ha sido posible mediante el uso de células inmortalizadas de ovario epiteliales superficiales (IOSes), líneas celulares de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario primarios recuperados de fluido ascítico 4-7. Desafortunadamente, su uso tiene varias limitaciones, incluyendo un número de cambios genéticos y fenotípicos asociados con proceso de inmortalización o en pasajes in vitro y la heterogeneidad de la población resultante de la preparación de fluido ascítico. Por lo tanto, las células de cáncer de ovario primarios derivados de muestras sólidas identificables y específicos de cáncer de ovario representan una unique herramienta para el estudio de la progresión del cáncer de ovario. Las principales dificultades de las que obtienen estas células malignas se deben a un crecimiento excesivo de las células del estroma o fibroblastos junto con la pérdida de la viabilidad y la falta prematura de la capacidad proliferativa en el cultivo de estas células EOC. Actualmente, existen diversos métodos para crear suspensiones de una sola célula de tumores sólidos, a través de medios mecánicos o disociación enzimática, sin embargo ciertas técnicas producen una mayor cantidad de la solución preferida 8. Aquí, mostramos que la digestión enzimática con dispasa II resulta en una recuperación efectiva de células EOC-fibroblastos libre viables. Los cultivos de EOC así obtenidos son altamente susceptibles a la manipulación genética y también son útiles en pruebas de detección de drogas, lo que indica que estos cultivos EOC son adecuados para muchas aplicaciones posteriores.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, estéril&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de rosca, recipiente de polipropileno para muestras, estéril</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio, estéril&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, estéril</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II, estéril</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza pequeña de punta fina y hoja de bisturí, estéril</td><td>Pinza Fisher Scientific</td><td>: 08-953E, cuchillas: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección pequeñas, estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos con tapa cónica, estériles</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos con tapa cónica, estériles</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serológica, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Émbolo de jeringa, estéril&nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de nylon (70 &mu; m ) colador de células, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm Placa de Petri, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 10 cm, estéril&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Se necesitan con urgencia herramientas fiables para la investigación de cáncer de ovario iniciación y progresión. Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de ovario sigue siendo una herramienta valiosa para comprender el cáncer de ovario, su uso tiene muchas limitaciones. Estos incluyen la falta de heterogeneidad y la plétora de alteraciones genéticas asociadas con pases prolongado in vitro. Aquí se describe un método que permite la rápida creación de células de cáncer de ovario primarios forman especímenes clínicos sólidos recogidos en el momento de la cirugía. El método consiste en someter las muestras clínicas a la digestión enzimática durante 30 min. Se deja que la suspensión de células aisladas a crecer y se puede utilizar para la aplicación aguas abajo incluyendo la detección de drogas. La ventaja de líneas celulares de cáncer de ovario primarios más de líneas celulares de cáncer de ovario establecidas es que son representativas de las muestras clínicas originales específicas que se derivan de y pueden ser derivados de diferentes sitios si a simplecáncer de ovario RY o metastásico.

Muestras clínicas frescas de cáncer de ovario se recogen después de la cirugía (Figura 1) y se cortan en trozos pequeños (Figuras 2A y 2B) que constituyen la suspensión celular. Esto permite una exposición óptima de las muestras que el tratamiento enzimático. Suspensión de la célula se expone a la digestión enzimática y se incubó a 37 ° C durante 30 min. Durante el tiempo de incubación de la suspensión se vuelve cada vez más nublado (especialmente después de cada agitac...

Este estudio describe un método detallado para el aislamiento y caracterización de células de cáncer de ovario primarios de muestras clínicas sólidos. Especímenes clínicos sobre el cáncer de ovario son sometidas a digestión enzimática para obtener, fibroblastos-epitelial libre de cáncer de ovario de células viables (EOC) muy adecuada para aplicaciones posteriores.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras clínicas sólidas. Esto se logra primero recolectando la muestra del tumor ovárico y colocándola en una placa de Petri. El segundo paso consiste en cortar la muestra en fragmentos y transferirlos a un tubo cónico con reactivos de digestión para su incubación.A continuación, la suspensión celular se pasa a través de un filtro donde solo se recolectan las células. Para la centrifugación, el paso final consiste en descartar el sobrenadante y resuspender las células en medio para incubarlas durante la noche. En última instancia, las células de cáncer ovárico epitelial crecerán en cultivo durante semanas, lo que permite aplicaciones posteriores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de ovario, como cuál es la mejor opción de tratamiento para cada paciente individual.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del cáncer de ovario porque nos permite utilizar cultivos celulares más realistas, que son altamente susceptibles a la manipulación genética y más útiles para pruebas de cribado de fármacos. Para c

method-for-obtaining-primary-ovarian-cancer-cells-from-solid-specimens

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

Este protocolo describe una técnica para la preparación de muestras mediante el cocultivo de explantes de ovario con las células cancerosas de las trompas de Falopio. Estas muestras se visualizan mediante espectroscopia de masas por imágenes, o IMS, para detectar el intercambio de moléculas pequeñas entre las células y los tejidos que conduce al desarrollo de tumores.

Modelado de la comunicación del cáncer de ovario para el análisis de espectrometría de masas por imágenes: un método para identificar comunicadores químicos de moléculas pequeñas en el desarrollo de tumores de ovario metastásicos

En este video, describimos un método para aislar y caracterizar células de cáncer de ovario primario a partir de muestras sólidas de tejido tumoral de ovario. Las células epiteliales de cáncer obtenidas mediante este protocolo son adecuadas para comprender los procesos que pueden conducir a la iniciación y el desarrollo del cáncer de ovario.

Obtención de células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas: un método para cultivar células epiteliales de cáncer de ovario a partir de muestras de tumores de ovario

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Las células iniciadoras de tumores (TICs) pueden representar una diana terapéutica viable para el tratamiento del cáncer de ovario, una enfermedad altamente recurrente y mortal. Presentamos un protocolo para condiciones de cultivo enriquecedoras para esta población de células altamente tumorigénicas.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Aquí, presentamos un protocolo para construir un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal, compuesto por células mesoteliales humanas primarias y fibroblastos estratificados con matriz extracelular, como herramienta para investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Modelado de los primeros pasos de cáncer de ovario Difusión en una cultura organotípicos del Peritoneal Cavity Humano

Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Aprenda a aislar células primarias de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas mediante digestión enzimática y cultivo. Este método permite obtener cultivos epiteliales puros para aplicaciones en investigación oncológica y medicina personalizada.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

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