Name: Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprende a identificar proteínas compañeras de interacción en células de mamífero utilizando SILAC e inmunoprecipitación cuantitativa. Este método potente distingue interacciones verdaderas de contaminantes con alta sensibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por becas de la Wellcome Trust y BBSRC a IG. IG es un Wellcome Senior Fellow.

1. Generación y El pase de Líneas Celulares SILAC marcado Nota: el uso de tripsina-EDTA se debe evitar en todas las etapas de pases y la preparación de las muestras experimentales para el análisis como la tripsina puede contener aminoácidos sin etiqueta, lo que llevaría al etiquetado incompleto de muestras. <ol><li> Para preparar una botella de medios SILAC añadir una alícuota de una arginina marcada de manera apropiada-SILAC (84 mg / ml en PBS) y lisina (146 mg / ml en PBS) a una botella de 500 ml de Arg / Lys DMEM libre (que contiene 0,5 ml L-glutamina). </li><li> A continuación, añadir 50 ml de FBS dializado y 5 ml de penicilina / estreptomicina a la botella de 500 ml. Nota: Las celdas HEK 293T (ATCC) deben mantenerse en medio DMEM que carecen de arginina y lisina y se completará con la luz (R0K0), media (R6K4) o fuerte (R10K8) aminoácidos, suero bovino fetal dializado (10 kDa de corte), y la penicilina / estreptomicina. Las células deben ser mantenidos en los medios de comunicación durante un mínimo de 5 divisiones celulares para asegurar una completaetiquetado. En la mayoría de los casos las células se marcan con facilidad en ≥ 2 semanas. </li><li> Para dividir celdas para pases, las células deben ser desalojados de la monocapa golpeando el frasco. Las alternativas incluyen el uso de raspadores de células o mediante el uso de tampón de disociación celular basada en PBS libre de enzimas. Nota: Para conservar los medios de comunicación, las células deben ser pasados ​​en matraces T25 y el número de células más grandes generan sólo inmediatamente antes de un experimento. </li><li> 24 horas antes de la transfección de las células, semillas de 3,5 x 10 6 células SILAC marcado en un único plato de 10 cm 2 para cada condición experimental bajo investigación. </li></ol> 2. La transfección de células marcadas con construcciones pEGFP-fusión <ol><li> Retire el papel de las células y reemplazarlo con 9 ml de antibiótico libre SILAC DMEM (Luz, medio o pesado). Nota: Los antibióticos no deben añadirse a los medios de comunicación ya que pueden interferir con la eficacia de los reactivos de transfección basadas en liposomas. </li><li> Prepare una mezcla de 10 g de plásmido apropiado (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) en 500 l de antibiótico-libre SILAC DMEM y se mezcla con 500 l de DMEM SILAC libre de antibióticos que contienen 10 l de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina 2000). Mezcle la reacción a fondo con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 min y a continuación añadir gota a gota a la monocapa de células. Rock the placa suavemente de lado a lado. </li><li> Se incuban las células transfectadas a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 24 horas. Nota: Si la expresión de una proteína de resultados de interés en cualquier toxicidad aparente, entonces puede ser necesario reducir la cantidad de plásmido transfectado y / o la duración del período de expresión posterior. </li></ol> 3. Lisados ​​celulares de cosecha <ol><li> Las células de la cosecha del plato en helada PBS utilizando un rascador de células. Recoger las células por centrifugación a 220 xg, 476; C durante 5 min. Lavar las células una 3x más en 10 ml de PBS enfriado en hielo. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón de lisis celular (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,5% de NP40) que contiene recién añadido cóctel inhibidor de la proteasa III a una concentración de 1x y cóctel de RNasa (opcional) en 5 l por ml. Nota: Para las proteínas con ácido nucleico conocida la actividad de unión, puede ser necesario añadir nucleasas al lisado antes de la precipitación. En los casos en donde se añade nucleasa, las muestras se deben incubar en hielo durante 30 min en hielo, con pipeteando cada 10 min. La extracción de ácido nucleico total de una pequeña fracción de la muestra y el análisis por electroforesis en gel de agarosa puede probar la eficacia de la nucleasa. </li><li> Centrifugar las muestras a 13.000 xg, 4 ° C durante 10 min retienen el sobrenadante como el lisado celular soluble. </li><li> La concentración del lisado celular debe ser evaluada por ensayo BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li>Utilizar una solución tampón de lisis que contenía cóctel inhibidor de la proteasa III para normalizar la concentración de proteína en un volumen final de 500 l. </li><li> Ajustar el volumen a 1 ml con la adición de 500 l de tampón de dilución (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM) que contenía cóctel inhibidor de la proteasa III a una concentración de 1x final. Una alícuota de 50 l de la muestra debe conservarse como la entrada de la muestra y el lisado se mantuvo en hielo mientras que la preparación perlas anti-GFP (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias-trampa). Nota: Por lo general los rendimientos varían entre 1 a 3,5 mg de proteína en la final de 1 ml de muestra. Mientras que los tampones anteriores son adecuados para muchas proteínas de interés, para otros puede ser necesario modificar los componentes del tampón para asegurar el cebo de proteína se solubiliza y mantener interacciones proteína-proteína. Alteraciones posibles incluyen el agente tampón (fosfato, HEPES), concentración de sal (150-500 mM), la elección del detergente, u otros aditivos. </li></ol> 4. La unión a anti-GCuentas de PF <ol><li> Brevemente vórtex con la suspensión de perlas para resuspender las perlas. Con una punta de pipeta de 200 l con el extremo cortado, transferir 25 l de los granos por muestra a un tubo nuevo. Nota: El usuario debe preparar las cuentas para un solo experimento SILAC como una mezcla maestra para minimizar la variación de muestra a muestra. </li><li> Por cada 25 l de suspensión de perlas, añadir 20 volúmenes (1.500 l por 75 l purines) de tampón de dilución, y centrifugar las cuentas a 2.700 xg durante 5 min. A continuación, lavar las perlas de un 2x más en 20 volúmenes de tampón de dilución. </li><li> Añadir 100 l de tampón de dilución por cada 25 l de talón suspensión. Utilizando una punta de 200 l con el extremo cortado, transferir 85 l de esta suspensión se resuspendieron a cada una de las muestras de SILAC marcado de paso 3.6. </li><li> Incubar las muestras con las cuentas de un rotador a 4 º C durante 2 horas. </li></ol> 5. Lavar, elución, y preparación de muestras para análisis MS <ol><li> Centrifugar las muestras a 2700 xg, 46; C durante 5 min. 50 l del sobrenadante deben ser retenidos como la muestra no unida, con el resto del sobrenadante descartado. </li><li> Tampón de dilución de 1 ml, debe añadirse a cada tubo para resuspender las perlas y la muestra se centrifugó a 2700 xg, 4 ° C durante 5 min. El sobrenadante se debe desechar. Esto se debe realizar dos veces. </li><li> Eluir la proteína de las perlas por la adición de 50 l de tampón de carga 2x SDS, y calentamiento a 95 ° C durante 10 min. Se precipitan las perlas mediante centrifugación a 2700 xg durante 2 min a 4 ° C </li><li> Conservar el sobrenadante en tubos prelubricados, donde puede ser después se almacenó a -80 ° C hasta que sea necesario. Para el envío a un centro de la espectrometría de masa, mezclar muestras etiquetadas 01:01:01 (por ejemplo, 10 l de cada uno) y presentar la muestra mixta. Nota: En este punto, las muestras pueden ser probadas por Western blot, tinción de plata o de otros medios de prueba para la interacción con los compañeros de unión conocidos / desconocidos. Un ejemplo se da en la figuraUre 2 que muestra la unión específica de un socio conocido interacción - eIF4G por Western blot, y la aparición de bandas de tinción de plata presentes en las muestras desplegables de una proteína de interés, pero no una muestra de control. </li><li> Someter la muestra para el análisis LC-MS/MS. Nota: una vez satisfecho de que una proteína de la etiqueta de interés se vincula con éxito los compañeros de interacción, volúmenes iguales de cada muestra marcada (ligero, medio y pesado) son combinados y presentados para su análisis LC-MS/MS. Es habitual que presente 30 l total de una muestra de IP para el análisis. Esto implicaría la mezcla 10 l de muestra de luz marcada con 10 l de muestras marcado pesados ​​marcado con medianas y 10 l para dar un total de 30 l. </li></ol> 6 Análisis de Datos I:. Interpretación de los resultados, y la eliminación de Identificaciones de baja confianza Nota: Una lista de los títulos de las columnas devueltas por el software proteoma Descubridor se da en la Tabla 1 Dif.rentes software (por ejemplo, MSQuant, MaxQuant) volverá a partidas distintas, sin embargo, sólo un subconjunto de ellos son necesarios para el análisis y éstos son comunes a los diferentes paquetes de software. Los datos siempre deben incluir un número de acceso para cada proteína identificada, la relación de la comparación de cada relación de la muestra (luz vs media, ligera vs pesados, medianos vs etc pesado), el número único de péptidos identificados, y algún tipo de tasa de falsos positivos o indicación confianza. <ol><li> Antes de ir a través de los datos, en primer lugar, copie los datos en bruto a una nueva hoja de cálculo. A partir de esta hoja de cálculo de eliminar todas las columnas salvo los que den el número de acceso, número único de péptidos, los ratios que comparan muestras, relación de la variabilidad y la descripción de proteínas. Si se realizaron réplicas de los experimentos, estos deben ser combinados en un solo archivo de Excel, con cada experimento que aparece en una ficha independiente. Nota: los datos de confianza baja incluye proteínas identificadas por un solo péptido único, y los waquí cuantificación no era posible. </li><li> Utilice la función &#39;sort&#39; Sobresale &#39;para ordenar los datos por el número de péptidos y eliminar las entradas para las proteínas que carecen de más de un péptido. Luego, ordenar por relación y eliminar las proteínas que carecen de relaciones SILAC (proteínas no cuantificados). </li><li> Convertir proporciones SILAC en un registro de 2 valores utilizando la fórmula: &#39;= log (ratio de SILAC, 2)&#39;, donde se sustituye «Ratio SILAC &#39;para el identificador de celda. Nota: como una relación de SILAC resultados en los datos para las proteínas que muestran una disminución en la abundancia está restringida a valores entre 0 y 1, que es habitual para convertir una relación de SILAC a una relación de SILAC registro 2, ya que esto significa proteínas tanto aumentado o disminuido en una muestra están representados en una escala logarítmica, donde 2 o -2 representa un aumento de 4 veces o disminución de la abundancia, y 3 o -3 un aumento de 9 veces o disminución de la abundancia, respectivamente. A raíz de esta transformación, los datos deben ajustarse a una Gadistribución usia centrado alrededor de una relación de SILAC registro 2 de 0. Un ejemplo de esto se da en la Figura 3. </li><li> Crear nuevas columnas en el archivo de Excel y calcular log 2 ratios SILAC para todas las muestras / columnas simuladas. Para la conversión de una relación fingida / muestra a una relación muestra / maqueta, utilice la fórmula: &quot;= 1/ratio&quot; </li></ol> 7 Análisis de Datos II:. Selección de interacciones de alta confianza de estudio adicional <ol><li> Abrir Graphpad Prism, seleccione Nuevo&gt; Tabla de datos y gráfico ... Select &#39;columna&#39; de la lista en el lado izquierdo de la ventana y seleccione el botón ENTER / Importar datos&gt; Introduzca los valores de réplica, apilados en columnas opciones. Presione &#39;Crear&#39;. </li><li> Seleccione y copie una columna determinada proporción de 2 log de ​​la muestra / Mock SILAC de la hoja de cálculo de Excel en el nuevo archivo de Prism. </li><li> Haga clic en el menú desplegable &quot;Insertar&quot; y seleccione &quot;Nuevo análisis&quot;. Conforme al análisis de la columna, seleccione &#39;Distribución de frecuencias. Mantener las opciones por defecto, haga clic en &#39;Aceptar&#39;. Nota: Este paso genera un histograma que ilustra el número de proteínas identificadas en una relación dada. Esto debería formar una distribución gaussiana. </li><li> En la carpeta de &quot;Resultados&quot; se habrá generado una nueva sección &quot;Histograma&quot;. Seleccione la sección de distribución de frecuencias. </li><li> Haga clic en el menú desplegable &quot;Insertar&quot; y seleccione Nuevo análisis&gt; XY&gt; Regresión no lineal (ajuste de la curva). Haga clic en &#39;distribución de Gauss&#39; y haga clic en Aceptar. Nota: Este paso se ajusta a una curva a los datos de distribución de frecuencia generados en la etapa 7.3, los valores que pueden utilizarse posteriormente para calcular los umbrales de significación rendimiento. </li><li> En la ventana de resultados que aparece, se dan la media y la desviación estándar. Generar un umbral mediante la adición de 1,96 desviaciones estándar de la media. Nota: Estos valores representan la media y la desviación estándar de la dist Gaussribution, no el conjunto de datos total. 1.96 desviaciones estándar colocarían un umbral en el límite de confianza del 95% (p ≤ 0,05). 2.58 SD daría el 99%, y el 3,3 SD 99,9%. El umbral debe determinarse individualmente para cada réplica experimento, ya que puede variar. </li></ol> 8 Análisis de Datos III. Fusión de los conjuntos de datos de réplica Nota: Para tener confianza en la identificación de socios de la interacción de una típica desplegable experimento SILAC idealmente se debe realizar tres veces, con el medio y muestras etiquetadas pesados ​​conmutada por una de las repeticiones de controlar para cualquier efecto de los medios de comunicación de los resultados. Una proteína que se muestra como la interacción en al menos dos de los tres experimentos, con la &#39;muestra switched&#39;-medios de comunicación ideal que representa uno de estos, es una interacción de alta confianza. <ol><li> Volver al archivo de Excel, cree una nueva pestaña llamada &#39;Combinado&#39;. Columna Etiqueta A &#39;adhesión&#39; y copiar todos los números de la adhesión de cada uno of los experimentos individuales en esta sola columna. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Datos&quot;, y luego la opción &quot;Eliminar Duplicados. </li><li> Crear columnas para las relaciones de SILAC, y la relación de la variabilidad de cada experimento, así como para la columna Nombre / Descripción de la proteína. </li><li> En la ficha Descripción, utilice la fórmula BUSCARV para recoger la descripción de cada número de entrada. Arrastre la fórmula hacia abajo la columna para anotar la descripción de proteínas. La fórmula BUSCARV es: &quot;= BUSCARV (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)&quot;, donde: AccessionNo es $ aX siendo X el número de fila WheretoLook es la &#39;pestaña Experiment Name&#39; $ A $ 2:.! $ Y $ Z donde Y y Z son la pieza inferior derecha de los datos en la hoja de cálculo que se hace referencia. ColumnsAccross es el número de columnas a través del número de la adhesiónbre en la columna A un valor deseado miente. Nota: Por ejemplo, si el número de acceso se encuentra en la columna A, y los datos de interés se encuentra en la columna E. El valor aquí sería 5 (columna A cuenta como 1). Como los números de acceso se agruparon en el paso b, es más probable que vlookup no obtendrá todos los nombres requeridos a partir de un experimento. Cuando regresa N / A, modifique la fórmula para obtener la descripción de cada experimento, a su vez hasta que se adquieran todas las descripciones. </li><li> Para resaltar las proteínas que interactúan en la combinación de datos, seleccione cada columna relación individual y haga clic en la ficha Inicio, seguido de reglas células Formato condicional&gt; Resaltar&gt; Más reglas. </li><li> Seleccione el estilo &#39;Classic&#39;. Formato únicas células que contienen &#39;Valor de la celda&#39;, &#39;Mayor que o igual a &quot;. En el cuadro, escriba el valor de la desviación estándar de 1,96, y haga clic en &#39;Aceptar&#39;. </li><li> Evaluar la variabilidad ratio para cada interacción positiva. Si restando la var%ESPONSABILIDAD caería un &#39;hit&#39; por debajo del valor umbral, este debe ser tratado con precaución. Nota: Esto representa la consistencia de las relaciones individuales de cada péptido que componen relación SILAC &#39;unas proteínas son, y se da como un porcentaje. Cuando se toma la variabilidad relación en cuenta y una proteína da una relación de SILAC por encima del umbral, esta proteína representa un éxito. Si la variabilidad relación da un rango que está por debajo del umbral, el &#39;hit&#39; puede representar un contaminante. </li><li> Repita esto para cada una de las columnas de resultados y compararlos a través de experimentos. Proteínas destacadas identificadas en dos o más experimentos representan una interacción de alta confianza. Nota: En función de la base de datos utilizada para asignar los números de acceso de proteínas, en diferentes experimentos una proteína puede haber sido identificada en una diferente, o incluso múltiples números de acceso. Es importante verificar esto para asegurarse de que las proteínas no se incluyeron, accidentalmente. </li&gt; </ol>

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li>
<li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li>
<li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factors+4A+%28eIF4A%29+and+4G+%28eIF4G%29+mutually+interact+in+a+1%3A1+ratio+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li>
<li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li>
<li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li>
<li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li>
<li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li>
<li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La estrategia desplegable SILAC descrito aquí representa un medio muy sensibles y de gran alcance de la detección de la proteína novedosa: las interacciones de proteínas, y además permite la discriminación rápida y simple de los patrones alterados de unión entre las muestras estrechamente relacionados de interés. En este ejemplo se utilizó esta técnica para investigar la proteína: proteína interacciones de las proteínas eIF4AI y eIF4AII 6. Para el conocimiento del autor, este es el primer estudio en la literatura explotar la utilidad de la proteómica SILAC para investigar el interactome celular de estas dos isoformas de eIF4A. El enfoque descrito anteriormente utiliza un GFP-etiqueta y anti-GFP bolas 9, 10 y, por tanto, las modificaciones pueden ser necesarias para que este enfoque que se utilizará para una proteína específica de interés, por ejemplo, si la etiqueta se coloca en el extremo N-o C-terminal de una proteína. Siempre que sea posible, transferencias Western o ensayos funcionales deberíanllevar a cabo para detectar la unión de una pareja de interacción proteína conocida. En caso de una proteína no tolerar la fusión con una etiqueta de las buenas prácticas agrarias, otra de marcado o estrategias desplegables se han aplicado a jalones SILAC utilizando tanto otras etiquetas (FLAG 11, biotina 12, PEIF (datos propios, sin publicar)), o mediante el uso de anticuerpos primarios contra una proteína de interés en la que siRNA desmontables de la proteína diana ofrece una muestra de control 13. Tales experimentos se han descrito en otra parte en la literatura, pero en breve, paso 1 y pasos 5.4-8 se aplica como anteriormente, con los pasos 2-5.3 modificados según sea apropiado para el sistema de expresión / desplegable de selección utilizando las entradas iguales de proteína como se describe en pasos 2.4 a 2.5. Dado que el grado de cuantificación permiten proteínas de unión no específica a ser retirados en el nivel de análisis, se recomienda omitir la pre-incubación con cuentas de control, o lavados elevadas de sal con el fin de preservar las proteínas de baja afinidad: interacciones de proteínas con una proteína de interés . Una ma nucleasay pueden incluir u omitir de este protocolo de acuerdo con las características específicas de una experiencia particular. Por ejemplo: como las proteínas utilizadas en este método son helicasas de ARN, RNasa cóctel se incluyó en el protocolo para eliminar interacciones indirectas mediadas a través de la ARN (paso 3.2). En algunos casos, sin embargo, podría haber un beneficio de llevar a cabo experimentos paralelos con y sin nucleasa para identificar las interacciones dependientes de ácidos nucleicos. Dentro de este protocolo, se recomienda el cambio de muestras &#39;pesados&#39; en replicar experimentos &quot;medio&quot; y para controlar la variación introducida por las diferencias en los medios de comunicación SILAC o el crecimiento celular. Un control alternativo incluye la modificación secuencial de los tres (&quot;light&quot;, &quot;medio&quot; y &quot;pesado&quot;) los medios de comunicación en la réplica de experimentos. Mientras que este enfoque es potencialmente más estrictas, sí aumenta la complejidad del análisis, como en al menos una repetición, una proteína de interés Wenfermo se produce en las células &quot;light&quot; etiquetados y por lo que es necesario distinguir entre las proteínas identificadas consistentemente en las muestras de &quot;light&quot; (contaminantes ambientales, tales como las queratinas), y los que sólo se enriquecen en las muestras &quot;light&quot; cuando se une a una proteína de interés. Aunque el uso de datos de cuantificación permite la discriminación de-específica de las interacciones no específicas mediante el uso de un umbral, inevitablemente algunas interacciones genuinas puede ser desechada. El enfoque anterior es un método sencillo y rápido para la identificación de proteínas: proteína interacciones que pueden ser fácilmente intentaron por investigadores sin experiencia previa con la espectrometría de masas, o el análisis de grandes conjuntos de datos de proteínas: proteína interacción. Para la mayoría de usos esto es más que suficiente para la identificación de nuevas proteínas de interés. Otras modificaciones a este enfoque para ayudar a reducir esta pérdida de datos se describen en la literatura y en otros lugares incluyen el uso de un PRbiblioteca frecuencia Otein donde conoce proteínas contaminantes para un conjunto específico de parámetros experimentales (línea celular, matriz de grano, las condiciones de tampón) puede ser excluido 10, 14. Sin embargo, dependiendo de los parámetros experimentales particulares puede ser necesario para realizar un número de experimentos de control para generar un proteoma de talón y por lo tanto esto puede aumentar tanto el gasto y la complejidad del experimento. Para más información sobre esta técnica se encuentra disponible en el sitio web www.peptracker.co.uk 14. También debe tenerse en cuenta que el protocolo descrito anteriormente consiste en mezclar muestras marcadas de manera diferente en el final del proceso de inmunoprecipitación (denominado una mezcla después de la purificación - MAPA SILAC experimento). Esto se hace en forma de proteínas: proteína interacciones se producen en un equilibrio determinado 15. Debe tenerse en cuenta que otros grupos han combinado este enfoque SILAC MAPA se describe en este protocolo con la incubación de las muestrasantes de la desplegable (purificación después de la mezcla - PAM SILAC) para diferentes periodos de tiempo (20 min a 2 horas se han utilizado en la literatura) 15, 16. Sobre la base de la rapidez con gotas de una relación de proteína a 01:01, es posible investigar cualitativamente afinidades de unión y para definir las proteínas como las proteínas que interactúan estables o dinámicos 15. En resumen, jalones SILAC representan un medio muy poderoso para identificar las proteínas que interactúan con una determinada proteína de interés, en un ambiente fisiológicamente relevante. La técnica se puede adaptar muy fácilmente a un número de diferentes estrategias de purificación, lo que permite su aplicación a cualquier proteína dada de interés. La cuantificación de los resultados simplifica enormemente la identificación de interacciones auténticos, y permite la relajación de las condiciones de tampón estrictas utilizadas para eliminar los aglutinantes no específicos, y por lo tanto preserva las interacciones de baja afinidad. Como hasta tres muestras se pueden comparar en lo anteriorestrategia, la técnica tiene ventajas claras en comparación de las diferencias en la proteína de unión entre las diferentes isoformas de proteínas, las proteínas mutantes, o el efecto de los inhibidores farmacológicos. A medida que se analizaron cortes de gel enteras en lugar de las bandas individuales que mancha por Coomassie, el número de proteínas identificadas en el alto grado de confianza suelen ser mayores que las señaladas en el GST / TAP-menú desplegable estándar y experimentador sesgo en la selección de proteínas de interés se quita. Por tanto, la técnica se compara muy favorablemente con otras técnicas utilizadas comúnmente utilizados en la identificación de nuevas proteínas-las interacciones (levadura de 2 híbridos, GST / His o TAP Pulldowns).

Un paso esencial en la comprensión de la función de proteínas es la identificación de las proteínas que interactúan pertinentes. Cuando tales proteínas son desconocidos hay una serie de técnicas disponibles, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Estos incluyen el sistema de levadura de dos híbridos, menú desplegable ensayos que utilizan proteínas recombinantes, así como la purificación por afinidad en tándem o TAP-etiquetado 1, 2. Una adición más reciente a estas técnicas es la combinación de la purificación por afinidad de una proteína de interés a partir de una línea celular de mamífero relevante, seguido de espectrometría de masas cuantitativa utilizando el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) 3. Esto tiene ventajas sobre el enfoque de la levadura de dos híbridos en que la localización celular y modificaciones post-traduccionales no son perturbados, así como las ventajas más tradicional de TAP-de marcado en la que se trata de un enfoque cuantitativo en lugar de cualitativo que permite al usuario REAdily distinguir de forma no específica las proteínas que interactúan y contaminantes, de los factores del huésped que se unen específicamente. Además, como una muestra normalmente se analizó su conjunto, en lugar de las bandas de proteínas como individuales, proteínas de interés no están enmascaradas por la migración de manera similar las proteínas en un gel, ni tampoco suelen necesitar estar presentes en niveles suficientes para ser visibles después de la tinción, lo que lleva a aumento del número de proteínas identificadas con confianza 4. Para demostrar esta técnica, GFP fusiones del factor de iniciación de la traducción eucariótica estrechamente relacionado eIF4AI y eIF4AII que comparten más de una identidad de aminoácidos del 90% fueron investigados por SILAC-inmunoprecipitación proteómica cuantitativa. EIF4AI humano y II fueron clonados dentro de pEGFP-C1 para formar una proteína de fusión de GFP donde se fusiona con el extremo N-terminal de eIF4A. Para evitar la necesidad de generar líneas celulares estables de transfección transitoria se utilizó para entregar estas construcciones a células 293T de isótopos estables etiquetados. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Las células se marcaron primero durante dos semanas en SILAC medios de cultivo celular, seguido de la transfección del plásmido de ADN que codifica una proteína de interés. Las células se lisaron a continuación, la concentración de proteína normalizaron, y cantidades iguales de afinidad de lisado purificaron en agarosa anti-GFP. Igual cantidad de eluido se combinaron después y se sometieron a análisis LC-MS/MS. Los resultados de este análisis se procesan entonces para identificar proteínas de alta confianza: las interacciones proteína (Figura 1). Inmunoprecipitación SILAC permite identificar no sólo las interacciones directas, sino también de baja afinidad o interacciones indirectas con complejos de proteínas 4. Usando este sistema, eIF4AI y II inmunoprecipitaciones permitió la identificación reproducible y seguro de la pareja principal de unión eIF4G (isoformas I / II y III) 5, así como las interacciones indirectas con eIF4E, y numerosos componentes del complejo eIF3.

<table><tbody><tr><td>Águila Modificada de Dulbecco Medio &nbsp;( DMEM)</td><td>Dundee Cell Products</td><td>LM010</td><td>DMEM que carece de arginina y lisina. (y que contiene L-glutamina)</td></tr><tr><td>FBS dializado (corte de 10 kDa) 500 ml</td><td>Dundee Cell Products</td><td>DS1003</td><td></td></tr><tr><td>Arginina (R0) 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094</td><td>Resuspender 0,5 g en 6 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 84 mg/ml)</td></tr><tr><td>Arginina (R6) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CLM-2265</td><td>Resuspender 0,5 g en 6 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 84 mg/ml)</td></tr><tr><td>Arginina (R10) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CNLM-539</td><td>Resuspender 0,5 g en 6 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 84 mg/ml)</td></tr><tr><td>Lisina (K0) 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8662</td><td>Resuspender 0,5 g en 3,5 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 146 mg/ml)</td></tr><tr><td>Lisina (K4) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>DLM-2640</td><td>Volver a suspender 0,5 g en 3,5 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 146 mg/ml)</td></tr><tr><td>Lisina (K8) 0,5 g</td><td>Cambridge Isotope Labs</td><td>CNLM-291</td><td>Resuspender 0,5 g en 3,5 ml de PBS, esterilizar con filtro y congelar en alícuotas de 0,5 ml (da un stock de 146 mg/ml)</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina, líquido. 100 ml</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Trampa GFP Agarosa (500 &mu; l resina)</td><td>Chromotek</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>5x SDS Tampón de carga de muestras</td><td>Fisher Scientific</td><td>PN39000</td><td>Se recomienda el uso de tampón de muestra comprado en lugar de casero para minimizar la contaminación por queratina.</td></tr><tr><td>Set cóctel de inhibidores de proteasas III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>tubos prelubricados de 1,7 ml Kit</td> de ensayo de proteínas <td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>BCA (1 L)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Trizma)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Rnase cóctel</td><td>Ambion</td><td>AM2286</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 alternativa</td><td>Millipore</td><td>492016</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando silac-inmunoprecipitación cuantitativos proteómica

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Proteómica cuantitativa, junto con la purificación de inmunoafinidad, inmunoprecipitación SILAC, representan un poderoso medio para el descubrimiento de la nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones pueden distinguirse fácilmente de los contaminantes experimentales. Interacciones de baja afinidad se pueden preservar mediante el uso de condiciones de tampón menos estrictos y siguen siendo fácilmente identificable. Este protocolo describe el etiquetado de las células de cultivo de tejidos con isótopos estables etiquetados aminoácidos, la transfección y la inmunoprecipitación de una afinidad etiquetado proteína de interés, seguido de la preparación para la presentación a una instalación de espectrometría de masas. Este protocolo a continuación explica cómo analizar e interpretar los datos devueltos por el espectrómetro de masas con el fin de identificar a los socios celulares que interactúan con una proteína de interés. A modo de ejemplo se aplica esta técnica para identificar proteínas de unión a los factores de iniciación de la traducción eucarióticos: eIF4AI y eIF4AII.

En un experimento típico de pulldown SILAC, la gran mayoría de las proteínas identificadas (&gt; 90%) representan los contaminantes, así como proteínas de unión no específica a la matriz de afinidad y esto se ilustra en la figura 2B, aun cuando los protocolos de lavado eliminan la mayoría de los contaminantes citoplasmáticos tales como GAPDH (Figura 2A). Sin embargo, el agrupamiento de la unión no específica de proteínas en una distribución normal permite que las proteínas que se unen específicamente a una proteína de interés para ser distinguidos como estos tienen mayores proporciones de muestra / simulacros de que el fondo. Mientras que los contaminantes deben agruparse teóricamente en torno a una relación de SILAC registro 2 de 0, esto no es necesariamente el caso, un ejemplo de esto se da en la Figura 3. Las posibles razones para esto incluyen el etiquetado de SILAC imperfecta de las células, la carga de volúmenes o concentraciones de lisado desiguales en las perlas anti-GFP, la pérdida accidental de los granos durante la purificación o la mezcla desigualción de las muestras al final del procedimiento de purificación 3. Sin embargo, suponiendo que los datos se analizaron sobre la base de una desviación estándar de umbral de la media de los contaminantes normalmente distribuidos, cambios menores en el centrado de los datos no deben afectar a la calidad de los resultados. Al comparar las diferencias en las interacciones de proteína entre dos proteínas relacionadas, puede producirse una situación similar en el que una proteína de interés se produce a niveles más altos dentro de las células de un segundo (ya sea debido a la variación en la eficiencia de transfección, o una propiedad intrínseca de la proteína o ARNm) . Algunos variación en la expresión (por ejemplo, la Figura 2A) pueden ser corregidos por el análisis de la relación de SILAC para estas dos muestras. En este ejemplo, estos serían los ejemplos de buenas prácticas agrarias-eIF4AI y GFP-eIF4AII. Mediante el análisis de la relación 4AI/4AII SILAC como se discutió en la sección 7, es posible identificar las proteínas cuya unión varía significativamente entre las isoformas. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; En la figura 4, una representación de las proteínas de unión a eIF4A-identificados en uno de los experimentos llevados a cabo réplicas se muestra que ilustra la cobertura del complejo de factor de iniciación de este protocolo logra. Las proporciones más altas se observaron típicamente con eIF4G, que se une directamente a eIF4A, con relaciones más bajas para eIF4E, que se une a eIF4G en un sitio lejos del sitio de unión eIF4A-. Se observaron índices más bajos para los miembros del complejo eIF3. Sin embargo, esto ilustra claramente que el experimento identificado satisfactoriamente parejas de unión tanto directos como indirectos de eIF4AI y II. Como se podría esperar a partir de su alta identidad de secuencia 6, las interacciones proteína: proteína aparecieron muy conservada entre las dos isoformas en este sistema experimental 7, 8. Una selección de algunas de las proteínas que interactúan se dan en la Tabla 2, que ilustra el formato de datos. <table border="0" cellpadding="0" cellsporrida = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Encabezado de columna </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> Adhesión </td><td> Muestra el número de acceso para la secuencia </td></tr><tr><td> Cobertura </td><td> Proporción de la secuencia de la proteína cubierto por los péptidos identificados </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Péptido partido espectral </td></tr><tr><td> ♯ péptidos </td><td> Número total de péptidos únicos identificados para una proteína </td></tr><tr><td> ♯ AA </td><td> La longitud de una proteína en aminoácidos </td></tr><tr><td> MW (Da) </td><td> El peso molecular de una proteína en Daltons. Excluye modificaciones </td></tr><tr><td> calc. PI </td><td> El punto isoeléctrico teórico de una proteína </td></tr><tr><td> Puntuación </td><td> La puntuación total de una proteína (que representa la suma de la Indivlas puntuaciones de péptidos iDual). La puntuación exacta requerida para la significación varía entre los experimentos. Una instalación de MS suele aplicar un corte falso descubrimiento tasa del 5%. </td></tr><tr><td> Secuencia </td><td> La secuencia de aminoácidos que constituyen la proteína </td></tr><tr><td> Proporción </td><td> La intensidad relativa de los péptidos en una muestra marcada con nombre, en comparación con una segunda muestra marcada </td></tr><tr><td> Count Ratio </td><td> El número de relaciones de péptidos que se utilizaron para calcular la relación de una proteína dada </td></tr><tr><td> Variabilidad Ratio (%) </td><td> La variabilidad de los ratios de péptidos individuales que se utilizan para calcular una relación de proteína dada </td></tr><tr><td> Descripción </td><td> El nombre de la proteína </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Encabezados de columna estándar de un informe proteoma de Discoverer.Mientras que la información útil se puede obtener de todas estas columnas, los críticos de este análisis se muestran en negrita. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Adhesión </td><td> Péptidos </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Nombre </td><td> Análisis SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> Proteína &#39;Bait&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90.855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Interactuando proteínas </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Contaminantes no específicamente de unión </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> La histona H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Queratina-1 </td><td rowspan="2"> Los contaminantes ambientales </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> Queratina-1 citoesqueleto 9 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Datos típicos de un experimento de inmunoprecipitación SILAC. Dando datos de ejemplo para una proteína de interés / cebo (altas péptidos, alto cociente), proteínas que interactúan con una proteína de interés (péptidos de alta / baja, alta relación), no específicamente de unión proteínas (alto-bajo Pept /ides, la relación cae por debajo de corte - en este experimento 0.96), y los contaminantes ambientales (a menudo péptidos altos, relación negativa / por debajo del umbral). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Figura 1. Plan experimental. En primer lugar las células se cultivan en medios que carecen de arginina y lisina y sustituidos con isótopos estables marcado con arginina y lisina durante 2 semanas (1). (2) Las células se sembraron en 10 cm 2 platos y transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican GFP (Mock) o proteínas de fusión de GFP (muestras). (3) Las células se lisan y las proteínas GFP o de fusión GFP se inmunoprecipitaron a partir de lisados ​​celulares. (4) Las muestras se combinan en una proporción de 1:1 y se sometieron a análisis de LC-MS/MS. Luego se analiza los datos para eliminar bajo ident proteína confianzacaciones y para seleccionar un nivel de enriquecimiento de proteína correspondiente a las proteínas que interactúan genuinos. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Figura 2. Confirmación de las condiciones de inmunoprecipitación adecuados. A) Análisis de transferencia de Western de lisados ​​de células, así como las fracciones no unidas y unidas de la inmunoprecipitación confirma la expresión y la inmunoprecipitación de la proteína de interés. Un western blot contra GAPDH confirma el agotamiento de proteínas no interaccionan y un western blot, además, una interacción socio conocido de eIF4A confirma la inmunoprecipitación con éxito de las proteínas de unión a la proteína de interés. B) Cuando no se sabe que interactúan los socios de una proteína de interés, un gel teñido con plata puede confirmar inmunoprecipitación de las proteínas que interactúan. En esta plata-mancha<html> bandas de gel ed para GFP y GFP-eIF4AI/II son claras, y una banda que migraba a la talla correcta para eIF4G está presente sólo en los carriles GFP-4AI/II-bound y no en el carril de control GFP. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos. Histograma que muestra la distribución de las proporciones de proteínas a partir de una repetición de (A) GFP-eIF4AI o (B)-GFP eIF4AII desplegable. El punto de corte 1,96 desviación estándar se marca con una línea discontinua. Proteínas que interactúan caen fuera de los contaminantes normalmente distribuidas-son evidentes a partir de ~ 0,25 y 1 en (A), y ~ 0,3-1,5 en (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Identificación de los miembros del complejo eIF desde una sola réplica de un experimento SILAC IP. Proteínas en verde fueron la proteína de interés utilizada para el pulldown Interactuando proteínas están sombreadas de rojo a blanco, según la relación de log 2 SILAC en el IP SILAC con rojo siendo la proteína más abundante en el análisis, y siendo el blanco el corte 1,96 SD. Proteínas sombreadas en gris no se identificaron en este análisis.

Experimentos de inmunoprecipitación SILAC representan un poderoso medio para descubrir nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones se puede distinguir fácilmente de los contaminantes experimentales, y las interacciones de baja afinidad conservada a través del uso de condiciones de tampón menos estrictos.

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar los socios de interacción proteica para una proteína determinada de interés. Esto se logra primero cultivando las células en medios de cultivo celular que contienen arginina y lisina marcadas con diferentes isótopos estables de carbono y nitrógeno. El segundo paso consiste en transfectar plásmidos y recubrir una proteína de interés o un plásmido control en las células marcadas.A continuación, se lisan las células y se inmunoprecipitan muestras a partir de los lisados. Luego, se combinan volúmenes iguales de inmunoprecipitados de control y de muestra, y se someten a análisis por LC-MS/MS. El paso final consiste en analizar los datos de espectrometría de masas para identificar las proteínas que interactúan con la proteína de interés.En última instancia, el marcado con isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular o las precipitaciones de aminoácidos SILAC son capaces de identificar un gran número de interacciones tanto directas como indirectas con una proteína de interés a partir de células de cultivo tisular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la etiqueta TAP, es que elimina la necesidad de que el investigador envíe bandas individuales para espectrometría de masas. Esto elimina una fuente importante de sesgo mientras aumenta la sensibilidad.Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre proteínas celulares, las interacciones proteína-proteína también pueden aplicarse a otros sistemas, como el estudio de las interacciones entre patógenos y huéspedes. Para comenzar, raspe las células HEK 293 T marcadas con SLAC, que expresan la proteína de interés etiquetada con GFP o el control GFP, desde la placa de cultivo celular hacia PBS frío con hielo, luego centrifugue la suspensión celular a 220 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Lave las células tres veces adicionales con 10 mililitros de PBS frío con hielo, re suspenda el sedimento celular en 200 microlitros de tampón de lisis celular que contenga una mezcla fresca de inhibidores de proteasas al 1X de concentración, y agregue cinco microlitros de la mezcla de inhibidores de RNAsa por mililitro de tampón de lisis. Incube en hielo durante cinco minutos. Luego, centrifugue el lisado celular a 13.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y conserve el sobrenadante como el lisado celular soluble.Mida la concentración de proteína del lisado celular utilizando un ensayo BCA. Luego, normalice la concentración de proteína en cada lisado de muestra en un volumen final de 500 microlitros utilizando el tampón de lisis que contiene inhibidores de proteasas. Añada 500 microlitros de tampón de dilución que contenga un cóctel de inhibidores de proteasas al uno por ciento a cada uno de los lisados celulares normalizados para ajustar el volumen total a un mililitro.Mantenga los lisados en hielo mientras prepara las perlas anti-GFP y conserve un alícuota de 50 microlitros de cada muestra para usar como entrada de muestra. Vortexe la suspensión de perlas para resuspenderlas. Luego, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con el extremo recortado para transferir 25 microlitros de perlas por muestra a un tubo nuevo.Por cada 25 microlitros de suspensión de perlas, añada 20 volúmenes de tampón de dilución para lavar, centrifugue las perlas a 2.700 × g durante cinco minutos. Lave las perlas adicionales veces con 20 volúmenes de tampón de dilución. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de dilución por cada 25 microlitros de suspensión de perlas.Luego, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con el extremo recortado para transferir 85 microlitros de la suspensión de perlas reconstituida a cada uno de los lisados de muestras etiquetados como SLAC. Incube las muestras con las perlas en un rotador a cuatro grados Celsius durante dos horas; después de que las muestras hayan incubado con las perlas, centrifugue las muestras a 2 700 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Retenga 50 microlitros del sobrenadante como muestra no ligada y deseche el resto del sobrenadante.Re-suspender las perlas en cada tubo en un mililitro de tampón de dilución y, a continuación, centrifugar a 2.700 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Repetir este paso de lavado dos veces para eluir la proteína de las perlas. Añadir 50 microlitros de tampón de carga 2X SDS a cada muestra y calentar a 95 grados Celsius durante 10 minutos.Una vez finalizado el calentamiento, centrifugar cada muestra a 2.700 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transferir el sobrenadante a tubos previamente lubricados y almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para enviar al análisis de espectrometría de masas. A continuación, mezclar volúmenes iguales de los precipitados de aminoácidos de control y de muestra y enviar la muestra combinada a una instalación de espectrometría de masas para análisis por LC-MS/MS.Antes de analizar los datos de espectrometría de masas, copie los datos brutos en una nueva hoja de cálculo. Luego, en esta hoja de cálculo, elimine todas las columnas excepto las que contienen el número de acceso, el número de relaciones de péptidos únicos, las muestras comparadas, la variabilidad de la relación y la descripción de la proteína. Utilice la función de ordenación de Excel para organizar los datos por el número de péptidos y elimine las entradas correspondientes a proteínas que carezcan de más de un péptido.Luego, ordene por razón y elimine las proteínas que no tengan razones SLAC. A continuación, convierta las razones SLAC a valores logarítmicos en base dos. Utilice la fórmula igual a log paréntesis, razón SLAC dos y paréntesis, donde la razón SLAC se sustituye por el identificador de la celda.Luego, cree una nueva columna en el archivo de Excel y calcule los logaritmos en base dos de las relaciones SLAC para todas las columnas de muestras simuladas, con el fin de convertir una relación de muestra simulada en una relación de muestra real. Utilice la fórmula igual a uno dividido por la relación. Abra GraphPad Prism.Seleccione la tabla de datos nueva y el gráfico. Seleccione una columna de la lista en el lado izquierdo de la ventana y seleccione ingresar datos de importación. Ingrese los valores de las réplicas apilados en columnas. Presione crear.Luego, seleccione y copie una columna determinada de la relación simulada de dos muestras logarítmica SLAC desde la hoja de cálculo de Excel al nuevo archivo de Prism. A continuación, haga clic en el menú desplegable Insertar y seleccione Nuevo análisis. En el análisis de columnas, elija Distribución de frecuencias.Mantenga las opciones predeterminadas y haga clic en aceptar. En la carpeta de resultados, se habrá generado una nueva sección de histograma. Seleccione la sección de distribución de frecuencias, luego haga clic en el menú desplegable insertar y seleccione análisis nuevo XY ajuste de curva de regresión no lineal.Haga clic en distribución gaussiana y haga clic en aceptar. En la ventana de resultados que aparece, se proporcionan la media y la desviación estándar. Genere un umbral sumando 1,96 desviaciones estándar a la media y regrese al archivo de Excel.Cree una nueva pestaña llamada columna combinada de etiquetas A y copie todos los números de acceso de cada uno de los experimentos individuales en esta única columna. A continuación, seleccione la pestaña de datos y luego la opción de eliminar duplicados. Luego, cree columnas para las proporciones SLAC y la variabilidad de las proporciones de cada experimento, así como para la columna de descripción del nombre de la proteína.En la pestaña de descripción, utilice la fórmula VLOOKUP para recopilar la descripción de cada número de acceso. Arrastre la fórmula hacia abajo en la columna para completar la descripción de las proteínas, y luego use esta fórmula para obtener los datos de relación y variabilidad de los experimentos individuales. Para resaltar las proteínas que interactúan en el conjunto de datos combinado, anote el valor umbral para un experimento determinado.Seleccione la columna de proporción y haga clic en la pestaña de inicio. A continuación, vaya a formato condicional, reglas para resaltar celdas, más reglas, luego seleccione el estilo clásico para dar formato únicamente a las celdas que contengan un valor de celda mayor o igual que. En el cuadro, escriba el valor de desviación estándar de 1,96 y haga clic en aceptar.Evalúe la variabilidad de la relación para cada interacción positiva. Si restar el porcentaje de variabilidad hace que un resultado positivo quede por debajo del valor umbral, esto debe considerarse con precaución.Repita esto para cada una de las columnas de resultados y compare entre experimentos; las proteínas resaltadas identificadas en dos o más experimentos representan una interacción de alta confianza. El análisis por inmunotransferencia confirmó la purificación de la proteína de interés marcada con GFP. La ausencia de una banda de DH vacía en las muestras ligadas indica que las proteínas no interactivas fueron agotadas de las muestras mediante el paso de inmunoprecipitación, mientras que la presencia de una banda de EIF 4G en estas muestras indica que se retuvieron socios de unión interactivos conocidos.Varios de los proteínas de unión a EIF cuatro A identificados se conservaron entre los dos isoformos. Las proteínas que interactúan con EIF cuatro A se identifican por la alta relación LAC, mientras que las proteínas unidas de forma no específica en este experimento presentan relaciones inferiores a 0,96. En este diagrama del complejo del factor de iniciación, las proteínas de unión a EIF cuatro A que se identificaron en el experimento de precipitación aminoácida SLAC se sombrean de rojo a blanco.Seg&uacute;n la relaci&oacute;n log dos SLAC, la alta cobertura tanto de socios de uni&oacute;n directos como indirectos de los complejos EIF4A1 y EIF4A2 ilustra la eficacia de este enfoque para identificar interacciones proteicas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, aunque algunas variaciones en los niveles de prote&iacute;na pueden compensarse en la etapa de an&aacute;lisis de datos, es preferible evitarlas asegurando una normalizaci&oacute;n precisa de los niveles de prote&iacute;na de entrada y evitando la p&eacute;rdida de perlas aros durante los pasos de lavado.

identification-protein-interaction-partners-mammalian-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa...

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

A continuación, describimos un método de proteómica cuantitativa mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para analizar los efectos de la infección por VIH-1 en proteomas exosomal anfitrión. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a las células bajo diferentes condiciones de estrés o infección.

SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas

Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.

Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.

Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas

Este protocolo se centra en la identificación de proteínas que se unen a fosfatos de inositol o fosfoinosítidos. Utiliza cromatografía de afinidad con fosfatos de inositol biotinylados o fosfoinositidos que se inmovilizan a través de estreptavidina a agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas de unión de fosfato de inositol o fosfoinositida se identifican por la hincha occidental o espectrometría de masas.

Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Descrito es un flujo de trabajo proteómico para identificar socios de interacción de proteínas a partir de una fracción subcelular nuclear utilizando el enriquecimiento de inmunoafinidad de una proteína dada de interés y espectrometría de masas sin etiquetas. El flujo de trabajo incluye fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación, preparación de muestras asistidas por filtro, limpieza fuera de línea, espectrometría de masas y una canalización bioinformática aguas abajo.

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.

Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

Aprende a identificar proteínas compañeras de interacción en células de mamífero utilizando SILAC e inmunoprecipitación cuantitativa. Este método potente distingue interacciones verdaderas de contaminantes con alta sensibilidad.

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica (Video) | JoVE Journal

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

Explorar más videos