Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

El objetivo general de este procedimiento es identificar los socios de interacción de proteínas para una proteína dada de interés. Esto se logra cultivando primero las células en medios de cultivo celular que contienen arginina y lisina marcadas con diferentes isótopos estables de carbono y nitrógeno. El segundo paso es transfectar plásmidos y recubrir una proteína de interés o un plásmido de control en las células marcadas.

A continuación, las células se lisan y las muestras se inmunoprecipitan a partir de los lisados. A continuación, se combinan volúmenes iguales de precipitados inmunológicos de control y de muestra y se envían para el análisis de lc MS MS. El paso final es analizar los datos de espectrometría de masas para identificar las proteínas que interactúan con la proteína de interés.

En última instancia, el marcaje de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular o precipitaciones de aminoácidos de síliac es capaz de identificar un gran número de interacciones directas e indirectas con una proteína de interés de células de cultivo de tejidos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el etiquetado de tomas, es que elimina la necesidad de que el investigador envíe bandas individuales de la espectrometría de masas. Esto elimina una importante fuente de sesgo al tiempo que aumenta la sensibilidad.

Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre las proteínas celulares, las interacciones de las proteínas también se pueden aplicar a otros sistemas, como el estudio de las interacciones entre el patógeno y el huésped. Para comenzar, raspe las células T marcadas con SLAC 2 2 93, que expresan la proteína marcada con GFP de interés o el control de GFP de la placa de cultivo celular en PBS helado, luego centrifugar la suspensión celular a 220 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, lavar las células tres veces más en 10 mililitros de PBS helado, resuspender la pastilla celular en 200 microlitros de tampón de lisis celular que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa recién agregado tres a una concentración X y añadir cinco microlitros de cóctel de ARN por mililitro de tampón de lisis, incubar en hielo durante cinco minutos. A continuación, centrifugar el lisado celular a 13.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y conservar el sobrenadante como lisado celular soluble.

Mida la concentración de proteínas del lisado celular mediante un ensayo de BCA. A continuación, normalice la concentración de proteínas en cada lisado de muestra en un volumen final de 500 microlitros utilizando el tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa. Agregue 500 microlitros de tampón de dilución que contenga un cóctel de inhibidores de proteasa tres a cada uno de los lisados celulares normalizados para ajustar el volumen total a un mililitro.

Mantenga los lisados en hielo mientras prepara las perlas anti GFP y conserve una alícuota de 50 microlitros de cada muestra que se utilizará para la entrada de la muestra. Agite la lechada de cuentas para volver a suspender las cuentas. A continuación, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con el corte final para transferir 25 microlitros de perlas por muestra a un tubo nuevo.

Por cada 25 microlitros de suspensión de perlas, agregue 20 volúmenes de tampón de dilución para lavar, centrifugue las perlas a 2, 700 veces G durante cinco minutos. Lave las perlas varias veces más con 20 volúmenes de tampón de dilución. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de dilución por cada 25 microlitros de lechada de perlas.

A continuación, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con el corte final para transferir 85 microlitros de la suspensión de perlas resuspendida a cada uno de los lisados de muestra marcados con SLAC. Incubar las muestras con perlas en un rotador a cuatro grados centígrados durante dos horas después de que las muestras se hayan incubado con las perlas, centrifugar las muestras a 2.700 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Conserve 50 microlitros del sobrenadante como muestra no unida y deseche el resto del sobrenadante.

Vuelva a suspender las perlas de cada tubo en un mililitro de tampón de dilución y luego centrifugue a 2.700 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Repita este paso de lavado dos veces para eluir la proteína de las perlas. Agregue 50 microlitros de dos tampones de carga XSDS a cada muestra y caliente a 95 grados centígrados durante 10 minutos.

Una vez finalizado el calentamiento, centrifugar cada muestra a 2.700 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a tubos prelubricados y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para enviar para el análisis de MS. A continuación, mezcle volúmenes iguales de precipitados de aminoácidos de control y de muestra y envíe la muestra combinada a una instalación de espectrometría de masas para el análisis de MS lc ms.

Antes de analizar los datos de espectrometría de masas, copie los datos sin procesar en una nueva hoja de cálculo. A continuación, en esta hoja de cálculo, elimine todas las columnas excepto las columnas que contienen el número de accesión, el número de proporciones de péptidos únicos, las muestras de comparación, la variabilidad de la proporción y la descripción de la proteína. Utilice la función de ordenación de Excel para ordenar los datos por el número de péptidos y eliminar las entradas de las proteínas a las que les falta más de un péptido.

A continuación, clasifique por proporción y elimine las proteínas que carecen de proporciones SLAC. A continuación, convierta las proporciones slac para registrar dos valores. El uso de la fórmula es igual a paréntesis logarítmicos, relación SLAC dos y paréntesis donde la relación SLAC se sustituye por el identificador de celda.

A continuación, cree una nueva columna en el archivo de Excel y calcule el registro de dos proporciones SLAC para todas las columnas de simulacro de muestra para la conversión de una relación de muestra simulada en una relación de simulacro de muestra. Usa la fórmula igual a uno dividido por la proporción. Abra el prisma GraphPad.

Seleccione la nueva tabla de datos y el gráfico Seleccione la columna de la lista en el lado izquierdo de la ventana y seleccione la opción ingresar los datos de importación. Introduzca los valores de réplica apilados en las opciones de columnas. Presione crear.

A continuación, seleccione y copie una columna de relación SLAC simulada de dos registros de la hoja de cálculo de Excel en el nuevo archivo de prisma. A continuación, haga clic en el menú desplegable de inserción y seleccione nuevo análisis. En Análisis de columnas, seleccione distribución de frecuencias.

Mantenga las opciones predeterminadas y haga clic en Aceptar. En la carpeta de resultados, se habrá generado una nueva sección de histograma. Seleccione la sección de distribución de frecuencias, luego haga clic en el menú desplegable de inserción y seleccione nuevo ajuste de curva de regresión no lineal XY de análisis.

Haga clic en Distribución gaussiana y haga clic en Aceptar. En la ventana de resultados que aparece se dan la media y la desviación estándar. Genere un umbral agregando 1,96 desviaciones estándar al rendimiento medio en el archivo de Excel.

Cree una nueva pestaña llamada columna de etiqueta combinada A y copie todos los números de accesión de cada uno de los experimentos individuales en esta única columna. A continuación, seleccione la pestaña de datos y luego la opción eliminar duplicados. A continuación, cree columnas para las proporciones SLAC y la variabilidad de las proporciones de cada experimento, así como para la columna de descripción del nombre de la proteína.

En la pestaña de descripción, utilice la fórmula BUSCARV para recopilar la descripción de cada número de accesión. Arrastre la fórmula hacia abajo en la columna para rellenar la descripción de la proteína y, a continuación, utilice esta fórmula para obtener los datos de proporción y variabilidad de los experimentos individuales. Para resaltar las proteínas que interactúan en el conjunto de datos combinado, anote el valor umbral de un experimento en particular.

Seleccione la columna de proporción y haga clic en la pestaña de inicio. Seguido del formato condicional, resalte las celdas de reglas más reglas, luego seleccione el formato clásico de estilo solo vende que contengan un valor de venta mayor o igual a. En el cuadro, escriba el valor de desviación estándar de 1,96 y haga clic en Aceptar.

Evalúe la variabilidad de la relación para cada interacción positiva. Si se resta el porcentaje de variabilidad, se obtendría un resultado por debajo del valor de umbral. Esto debe tratarse con precaución.

Repita esto para cada una de las columnas de resultados y compare entre experimentos las proteínas resaltadas identificadas en dos o más experimentos que representan una interacción de alta confianza. El análisis de Western blot confirmó la purificación de la proteína marcada con GFP de interés. La ausencia de una banda DH de brecha en las muestras unidas indica que las proteínas que no interactúan se agotaron de las muestras en la etapa de inmunoprecipitación, mientras que la presencia de una banda EIF 4G en estas muestras indica que se conservaron los socios de unión que interactúan conocidos.

Varias de las proteínas de unión a EIF cuatro A identificadas se conservaron entre las dos isoformas. Las proteínas que interactúan con EIF cuatro A se identifican por la alta proporción de LAC, mientras que las proteínas no específicamente unidas en este experimento tienen proporciones inferiores a 0,96. En este diagrama del complejo de factores de iniciación, las cuatro proteínas de unión a EIF A que se identificaron en el experimento de precipitación de aminoácidos SLAC están sombreadas de rojo a blanco.

De acuerdo con la relación logarítmica dos SLAC, la alta cobertura de los socios de unión directos e indirectos de los complejos EIF cuatro A uno y dos ilustra la eficacia de este enfoque para identificar las interacciones de las proteínas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, si bien se puede compensar cierta variación en los niveles de proteínas en la etapa de análisis de datos, Lo mejor es que esto se pueda evitar asegurando una normalización precisa de los niveles de entrada de proteínas y evitando la pérdida de perlas de AROS durante los pasos de lavado.