Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

El objetivo general de este procedimiento es realizar una hibridación genómica comparativa en matriz para identificar desequilibrios en el genoma que pueden provocar una amplia variedad de enfermedades genéticas. Esto se logra primero etiquetando el ADN del paciente con un colorante fluorescente. En el segundo paso, el ADN del paciente y un ADN de referencia etiquetado de manera diferente se hibridan en la matriz.

A continuación, se escanea la matriz para medir la cantidad de ADN del paciente y del ADN de referencia unidos a cada sonda. En la etapa final, se procesa la imagen escaneada para identificar las regiones del genoma en las que el ADN del paciente tiene más o menos material que el ADN de referencia. La hibridación genómica comparativa se utiliza para determinar si el paciente presenta una variante en el número de copias que da como resultado un síndrome genético.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que el ensamblaje del portaobjeto con matriz puede ser difícil y es fácil que la hibridación se derrame fuera de la cámara antes de comenzar la reacción de marcado. Descongele la placa de 96 pocillos lista para usar con nucleótidos y cebadores a cuatro grados Celsius y protegida de la luz durante aproximadamente una hora.

Una vez descongelado, equilibrar la placa cubierta durante otros 30 minutos a temperatura ambiente; al mismo tiempo, equilibrar las muestras de ADN durante 15 minutos a 60 grados Celsius. Mientras las muestras se calientan, utilizar un robot de manipulación de líquidos para dispensar suficiente agua libre de nucleasas en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos. Luego, cuando el ADN esté listo, transferir un microgramo de muestra por pocillo a la placa de 96 pocillos con agua.

Ahora transfiera 20 microlitros de los nucleótidos y cebadores en equilibrio a cada pocillo de la placa que contiene las muestras de ADN diluido y selle la placa con tapas en tira, asegurándose de hacer un cierre hermético. A continuación, desnature el ADN a 99 grados Celsius en una máquina de PCR con tapa calefaccionada durante 10 minutos y haga que los cebadores se hibriden mediante enfriamiento rápido de la placa en hielo durante cinco minutos. Luego, utilice el robot de manipulación de líquidos para añadir 10 microlitros de enzima polimerasa exo DNA limpia a cada muestra.

Mezcle las muestras mediante pipeta y luego selle e incube la placa a 37 grados Celsius durante 16 horas. Al día siguiente, detenga la reacción con cinco microlitros de tampón de parada por pocillo. A continuación, elimine los nucleótidos no incorporados. Transfiera el contenido de cada pocillo a tubos individuales de dos mililitros previamente etiquetados.

Cargue las muestras y las columnas de centrifugación para purificación de ADN en un robot procesador de columnas de centrifugación, así como los tampones asociados apropiados. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el robot procesador de columnas de centrifugación unirá el ADN marcado a la membrana de sílice con 250 microlitros de tampón de unión de ADN de alta salinidad por tubo, tras lo cual se eliminarán las impurezas de las membranas mediante dos lavados con 500 microlitros de tampón de lavado cada uno. Luego, el robot añadirá 15 microlitros de tampón de solución de baja salinidad a las membranas para recuperar las muestras de ADN marcado purificado en volúmenes aproximados de 12 microlitros para hibridar las muestras.

A continuación, precaliente un horno de hibridación a 65 grados Celsius y caliente previamente las láminas de soporte y las cámaras de hibridación. Para preparar la mezcla de hibridación, combine 1,1 microlitros de ADN cot 1D, 4,95 microlitros de la mezcla bloqueadora suministrada por el fabricante y 24,75 microlitros de tampón de hibridación. Utilice el robot de manipulación de líquidos para distribuir esta mezcla en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos, humedeciendo previamente cada punta para mejorar la precisión de la transferencia.

A continuación, pipete 9,35 microlitros del ADN marcado con fluoróforo tres, seguido de 9,35 microlitros del ADN marcado con fluoróforo cinco. Selle cada pocillo de la placa, incube las muestras durante un minuto y centrifugue brevemente la placa para recoger el contenido en el fondo de cada uno. Desnaturalice el ADN marcado en un incubador previo a la hibridación.

Primero durante tres minutos a 95 grados Celsius, seguido de 30 minutos a 37 grados Celsius. Luego, trabajar en una plataforma calentada a 42 grados Celsius. Coloque la portaobjetos de respaldo en la cámara de hibridación, asegurándose de que la parte transparente de la junta coincida con la parte con ventana de la cámara de hibridación utilizando puntas previamente humedecidas.

Ahora pipetee lentamente 42 microlitros de la mezcla de hibridación en el centro de la posición adecuada del portaobjetos de soporte de la matriz, teniendo cuidado de que el líquido no toque el límite del anillo de goma. Una vez que todas las posiciones estén llenas, coloque cuidadosamente la laminilla de la matriz sobre el portaobjetos de soporte y ensamble la cámara de hibridación.

Asegurándose de que el lado del matriz con la escritura esté orientado hacia la laminilla de soporte, apriete completamente el tornillo de la cámara de hibridación e inspeccione la cámara de hibridación ensamblada, confirmando que no haya fugas de hibridación fuera de los límites del anillo de goma y que cada burbuja de aire tenga aproximadamente cuatro milímetros de altura. Cuando la cámara de hibridación se coloque verticalmente sobre su extremo, gire la cámara para verificarlo.

Todas las burbujas de aire en cada posición están en movimiento. Si alguna de las burbujas está atrapada, golpee bruscamente la cámara sobre el banco. Luego, coloque las cámaras de hibridación en el horno rotatorio a 65 grados Celsius durante 24 horas.

Al día siguiente, sumerja las cámaras de hibridación en tampón de lavado uno y utilice un par de pinzas de plástico con bordes planos para separar las láminas. Luego deseche las láminas con junta y coloque las láminas de matriz en una rejilla sumergida en tampón fresco uno. Lave las láminas de matriz en aproximadamente 700 mililitros de tampón de lavado durante uno a cinco minutos, agitando vigorosamente con una barra magnética y un imán.

Luego transfiera las laminillas de matriz a aproximadamente 700 mililitros de tampón de lavado, dos veces durante 90 segundos con agitación más vigorosa al final del segundo lavado. Levante suavemente las laminillas de matriz fuera del tampón. Deben emerger secas.

Luego cargue las láminas de matriz en los portaportaobjetos del escáner junto con los protectores de lámina, y escanee las muestras. Según las instrucciones del fabricante de la matriz, cada sonda en una matriz hibridada se visualiza como una mezcla de fluorocromos rojo y verde. Las proporciones de la señal fluorescente roja a verde para cada sonda se cuantifican mediante el escáner y el software asociado, que las representa como logaritmos en base dos según su posición genómica.

Los trazos de la matriz resultante permiten interpretar las regiones identificadas como genómicamente desequilibradas. Por ejemplo, en este trazo de un niño con síndrome de Williams, un síndrome de microdeleción recurrente mediado por repeticiones de baja copia en la región proximal del cromosoma siete, el desequilibrio genómico fue identificado por el software con una línea roja. El logaritmo del cociente fluorescente prop debe agruparse estrechamente alrededor de cero, lo que indica una relación verde a rojo de uno a uno para regiones normales del genoma.

Los rastros en arreglo disperso observados en este escaneo pueden provocar una identificación inexacta de las regiones anormales, o la incapacidad para detectar el desequilibrio genómico, y pueden ser causados por diversos factores, incluyendo la baja calidad del ADN o la presencia de rayos, niveles de ozono en la atmósfera. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar muestras de pacientes para su análisis mediante CGH por matriz y de cómo producir datos de buena calidad para el análisis posterior y la detección de variaciones en el número de copias.