Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

El objetivo general de este procedimiento es organizar la hibridación genómica comparativa para identificar desequilibrios en el genoma que pueden conducir a una amplia variedad de enfermedades genéticas. Esto se logra marcando primero el ADN del paciente con un tinte fluorescente. En el segundo paso, el paciente, el ADN y un ADN de referencia etiquetado de manera diferente, se hibridan con la matriz.

A continuación, se escanea la matriz para medir la cantidad de pacientes y DN de referencia abundante para cada sonda. En el paso final, la imagen escaneada se procesa para identificar las regiones del genoma donde el ADN del paciente tiene más o menos material que el ADN de referencia en última instancia. La hibridación genómica comparativa se utiliza para determinar si el paciente es portador de una variante del número de copias que da lugar a un síndrome genético.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que el montaje de la corredera de la matriz puede ser difícil y es fácil para la hibridación. Mezcle el derrame fuera de la cámara antes de comenzar la reacción de etiquetado. Descongele la placa de 96 pocillos de nucleótidos y cebadores lista para usar a cuatro grados centígrados y protéjala de la luz durante aproximadamente una hora.

Una vez descongelada, equilibre la placa cubierta durante otros 30 minutos a temperatura ambiente, equilibre las muestras de ADN durante 15 minutos a 60 grados centígrados en este momento también. Mientras las muestras se calientan, use un robot de manejo de líquidos para dispensar suficiente agua libre de nucleasa en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos. Luego, cuando el ADN esté listo, transfiera un microgramo de muestra por pocillo a la placa de agua de 96 pocillos.

Ahora transfiera 20 microlitros de los nucleótidos de equilibrio y cebadores a cada una de las placas que contienen las muestras de ADN diluidas y selle la placa con tapas de tiras teniendo cuidado de hacer un sello hermético. A continuación, desnaturalice el ADN a 99 grados centígrados en una máquina de PCR con una tapa calentada después de 10 minutos y frote los cebadores enfriando la placa en hielo durante cinco minutos. A continuación, utilice el robot de manipulación de líquidos para añadir 10 microlitros de enzima exo ADN polimerasa limpia a cada muestra.

Mezclar las muestras con pipeta y luego sellar e incubar la placa a 37 grados centígrados durante 16 horas. Al día siguiente, termine la reacción con cinco microlitros de tampón de parada por pocillo, luego elimine los nucleótidos no incorporados. Transfiera el contenido de cada pocillo a tubos individuales de dos mililitros preetiquetados.

Cargue las muestras y las columnas de centrifugación de purificación de ADN en un robot de procesamiento de columnas de centrifugación, así como los tampones asociados adecuados. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el robot de procesamiento de columna de centrifugación unirá el ADN marcado a la membrana de sílice con 250 microlitros de tampón de unión de ADN con alto contenido de sal por tubo, después de lo cual las impurezas se eliminarán de las membranas con dos lavados de 500 microlitros de tampón de lavado cada uno. A continuación, el robot añadirá 15 microlitros de tampón de solución baja en sal a las membranas para recuperar las muestras de ADN marcadas purificadas en volúmenes aproximados de 12 microlitros para hibridar las muestras.

A continuación, precaliente un horno de hibridación a 65 grados centígrados y precaliente las correderas de respaldo y las cámaras de hibridación. Para preparar la mezcla de hibridación, combine 1,1 microlitros de cuna 1D NA, 4,95 microlitros de la mezcla de bloqueo suministrada por el fabricante y 24,75 microlitros de tampón de hibridación. Utilice el robot de manejo de líquidos para asignar esta mezcla en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos, prehumedeciendo cada punta para mejorar la precisión de la transferencia.

A continuación, pipetea 9,35 microlitros del signo adecuado, tres de ADN marcado, seguidos de 9,35 microlitros del signo adecuado, cinco de ADN marcado. Para sellar la placa de cada pozo, cuatro muestras durante un minuto y girar rápidamente la placa para recoger el contenido en el fondo de cada una. Bien desnaturalizar el ADN marcado en una incubadora de prehibridación.

Primero durante tres minutos a 95 grados centígrados, seguido de 30 minutos a 37 grados centígrados. Luego se trabaja en una plataforma climatizada a 42 grados centígrados. Coloque la corredera de respaldo en la cámara de hibridación, asegurándose de que la parte transparente de la junta se alinee con la parte con ventana de la cámara de hibridación Usando puntas prehumedecidas.

Ahora pipetee lentamente 42 microlitros de la mezcla de hibridación en el centro de la posición apropiada del portaobjetos de soporte de la matriz. Teniendo cuidado de que el líquido no toque el límite del anillo de goma. Una vez que todas las posiciones estén llenas, baje con cuidado la corredera de la matriz sobre la corredera de respaldo y ensamble la cámara de hibridación.

Teniendo cuidado de que el lado de la matriz con escritura esté orientado hacia la corredera de respaldo, apriete completamente el tornillo de la cámara de hibridación e inspeccione la cámara de hibridación ensamblada, confirmando que no haya fugas de hibridación. Mezcle fuera de los límites del anillo de goma y que cada burbuja de aire tenga aproximadamente cuatro milímetros de altura. Cuando la cámara de hibridación esté apoyada en su extremo verticalmente, gire la cámara de hibridación para comprobarlo.

Todas las burbujas de aire en cada posición se mueven. Si alguna de las burbujas está atascada, dale un golpecito fuerte a la cámara en el banco. Luego coloque las cámaras de hibridación en el horno giratorio a 65 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, sumerja las cámaras de hibridación en el tampón de lavado uno y use un par de pinzas de plástico de borde plano para separar los portaobjetos. A continuación, deseche las correderas de la junta y colóquelas en una rejilla y sumérjalas en un tampón nuevo. Lave los portaobjetos de la matriz en aproximadamente 700 mililitros de tampón de lavado durante uno a cinco minutos, revolviendo vigorosamente con una pulga y una estrella magnética.

A continuación, transfiera los portaobjetos de la matriz a unos 700 mililitros de tampón de lavado, dos durante 90 segundos con una agitación más enérgica al final del segundo lavado. Levante suavemente las correderas de la matriz fuera del búfer. Deben emerger secos.

A continuación, cargue los portaobjetos de la matriz en los soportes de portaobjetos del escáner junto con los protectores de portaobjetos y, a continuación, escanee las muestras. De acuerdo con las instrucciones del fabricante de la matriz, cada sonda en una matriz hibridada se visualiza como una mezcla de fluorocromos rojos y verdes. Las proporciones de señal fluorescente roja a verde para cada sonda son cuantificadas por el escáner y el software asociado las clasifica como proporciones logarítmicas de dos de acuerdo con su posición genómica.

Los rastros de matrices resultantes permiten la interpretación de regiones identificadas como genómicamente desequilibradas. Por ejemplo, en este rastro de un niño con síndrome de Williams, un síndrome de microdeleción recurrente mediado por repeticiones de copias bajas en la región proximal del cromosoma siete, el desequilibrio genómico fue identificado por el software con una línea roja. La proporción de logaritmos fluorescentes debe agruparse estrechamente alrededor de cero, lo que indica una proporción de verde a rojo de uno a uno para las regiones normales del genoma.

Los rastros dispersos de la matriz, como se observa en este escaneo, pueden dar lugar a una llamada inexacta de las regiones anormales o a una imposibilidad de identificar el desequilibrio genómico y pueden deberse a una serie de factores, como la mala calidad del ADN, la presencia de rayos y los niveles de ozono en la esfera atmosférica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo procesar muestras de pacientes para pruebas con A CGH y producir datos de buena calidad para el análisis posterior y la detección de la variación del número de copias.