Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

El objetivo general de este procedimiento es identificar las alteraciones en el número de copias de ADN a escala de megabases en células individuales. Con el fin de categorizar la heterogeneidad genómica en las poblaciones celulares, es necesario identificar los cambios genómicos a la resolución de una sola célula. Tradicionalmente, esto se lograba mediante abordajes citológicos, sin embargo, estos métodos eran limitados en su sensibilidad y especificidad.

La secuenciación de una sola célula puede detectar una variedad de cambios genómicos, con una mayor sensibilidad y especificidad que los enfoques anteriores, pero solo cuando se ejecuta con cuidado. Aquí, describimos cómo usar la secuenciación de una sola célula para detectar de manera confiable alteraciones en el número de copias a escala de megabases en células individuales. Para ensamblar el microaspirador, comience quitando el extremo de plástico transparente del conjunto del tubo del aspirador e inserte el extremo estrecho en un extremo de un tubo de PVC de un pie de largo con un diámetro interior de 3/16 de pulgada.

Inserte la salida de un filtro de jeringa de 0.2 micrómetros en el otro extremo del tubo de PVC de un pie de largo con un diámetro interior de 3/16 de pulgada. A continuación, inserte la entrada del filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un extremo de un tubo de PVC de seis pulgadas de largo con un diámetro interior de 5/16 de pulgada. Rompa una pipeta serológica de plástico de cinco mililitros en la graduación de un mililitro e inserte el extremo roto en el extremo abierto del tubo de PVC con un diámetro interior de 5/16 de pulgada.

A continuación, inserte la salida de la pipeta serológica de plástico de cinco mililitros en el extremo flexible de un conjunto de tubo aspirador, luego use un tubo de plástico estéril para cubrir la boquilla roja del conjunto de tubo para su almacenamiento. Extraiga un tubo capilar de vidrio a un diámetro interior de 10 a 30 micrómetros colocando el centro del tubo cerca de una llama y aplicando tensión en cada extremo del tubo. Rompa el tubo estirado en dos mitades para crear dos posibles agujas aspiradoras.

Repita este paso con varios tubos para asegurarse de que se preparan suficientes agujas con un diámetro interior adecuado para recoger células individuales. Para preparar las células de adherencia, como las líneas celulares de fibroblastos humanos, se recolectan células por tripsinización y se transfieren las células a un tubo cónico que contiene el medio adecuado. Configure una campana para la amplificación del genoma completo utilizando un 10 % de lejía para rociar la superficie de la campana, las cajas de puntas de pipeta y las puntas de pipeta.

A continuación, utilice una toalla de papel para limpiarlos todos antes de repetir el lavado con etanol al 70%. Agregue ocho microlitros de agua del kit de amplificación del genoma completo, o WGA, a pocillos individuales a una placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa de PCR de 96 pocillos con una tapa de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y coloque la placa en hielo.

A continuación, agregue 1,000 celdas a 10 mililitros de medio o PBS en una placa de Petri de 15 centímetros y coloque la placa sobre hielo para evitar que las células se adhieran a la placa. Luego, mientras aún está en hielo, transfiera las células en la placa de Petri y la placa de PCR de 96 pocillos a un microscopio óptico con un objetivo 10X. Aumente la apertura de la aguja del aspirador golpeando suavemente el extremo estirado de la aguja sobre una superficie dura para que la punta se rompa.

A continuación, inserte el extremo ancho de la aguja en el extremo transparente del microaspirador. A continuación, coloque la placa de Petri que contiene células en la platina del microscopio. Inserte la boquilla roja del aspirador en la boca.

A continuación, mientras se utilizaba uno había que mover la aguja del aspirador, y con la otra mano mover la placa de Petri, se identificaban las células individuales que se iban a secuenciar. Usando la succión bucal, extraiga una sola celda en la aguja del aspirador junto con aproximadamente uno o dos microlitros de medio o PBS. Transfiera la celda a los ocho microlitros de agua en un solo pocillo de la placa de PCR de 96 pocillos.

La calidad y utilidad de los datos de secuenciación de células individuales depende del estado de cada célula y de su genoma, por lo tanto, hay que tener cuidado durante la preparación celular y la microaspiración para aislar las células viables y no apoptóticas. Después de aspirar cada célula y transferirla a un pocillo de la placa de PCR, marque el pocillo que ha recibido una célula. Repita esto para el número deseado de celdas.

Mientras tanto, descongele el tampón de fragmentación de lisis de una sola célula 10X del kit de amplificación del genoma completo. Para evitar la contaminación durante la amplificación del genoma completo, agregue todos los reactivos dentro de una campana de cultivo de tejidos. Utilice puntas de pipeta con filtros y cambie la punta de pipeta entre pocillos.

Para cada conjunto de hasta 32 células, combine 32 microlitros de tampón de lisis y fragmentación de una sola célula 10X y dos microlitros de solución de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga, luego haga un vórtice del tubo para mezclar el contenido. Agregue un microlitro de la solución a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Cubra la placa y use una película de plástico para sellar todos los pocillos.

A continuación, centrifuga brevemente la placa en un mini girador de placas. A continuación, pase la placa por el termociclador utilizando el siguiente programa. A continuación, enfríe la placa con hielo y centrifugala brevemente.

Para preparar una solución tampón de preparación de bibliotecas de trabajo del kit de amplificación del genoma completo, para cada célula, combine dos microlitros de tampón de preparación de bibliotecas de células individuales 1X y un microlitro de solución de estabilización de bibliotecas. La lisis celular adecuada y la fragmentación completa del genoma son fundamentales para minimizar el sesgo durante la amplificación del genoma completo y garantizar la preparación de bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Como tal, tenga cuidado de realizar estos pasos exactamente como están escritos.

Retire la película de plástico del plato y agregue tres microlitros de la solución a cada pocillo. Pipetea el contenido del pocillo hacia arriba y hacia abajo para mezclar, luego reemplace la película de plástico. Después de girar brevemente la placa, incube las células a 95 grados centígrados durante dos minutos, luego enfríe la placa en hielo y vuelva a centrifugar brevemente la placa.

Ahora, retire la película de plástico, agregue un microlitro de Enzima de Preparación de Biblioteca a cada pocillo y pipetee el contenido del pocillo hacia arriba y hacia abajo para mezclar, luego reemplace la película de plástico. Después de girar brevemente la placa, colóquela en el termociclador y ejecute el siguiente programa. Después de enfriar la placa y darle un breve giro, prepare una mezcla de amplificación de trabajo del kit de amplificación del genoma completo combinando 48,5 microlitros de agua, 7,5 microlitros de mezcla maestra de amplificación 10X y 5 microlitros de ADN polimerasa WGA, para cada celda.

Mantenga la mezcla de trabajo en hielo. Retire la película de plástico de la placa. Agregue 61 microlitros de la mezcla de amplificación de trabajo a cada pocillo y pipetee el contenido de cada pocillo hacia arriba y hacia abajo para mezclar, luego reemplace la película de plástico.

Centrifugar brevemente la placa y termociclo de la siguiente manera. Secuenciar las muestras y realizar el análisis de datos según el protocolo de texto. Como se demuestra en esta figura, si la amplificación del genoma completo tiene éxito, la muestra aparecerá como un frotis en un gel de agarosa.

Un frotis tenue o ausente indica una reacción de amplificación fallida y la muestra no debe secuenciarse. Como se muestra aquí, el análisis de los tamaños de los fragmentos se llevó a cabo mediante electroforesis capilar en un analizador de fragmentos. Las bibliotecas preparadas con éxito tendrán una distribución bastante uniforme de tamaños de fragmentos de 150 a 900 pares de bases.

Si se produce un error en la preparación de la biblioteca, se producirá una distribución sesgada del tamaño de los fragmentos, por lo que no se deben secuenciar dichas bibliotecas. Utilizando el modelo oculto de Markov y la segmentación binaria circular, el genoma de cada célula se analizó en segmentos de número estimado de copias. Esta tabla muestra los resultados superpuestos de una sola célula y revela una ganancia en el cromosoma 10 de 67 a 130 megabases, y una ganancia en el cromosoma 19 de 0 a 20 megabases.

El aislamiento y la amplificación del genoma completo de células individuales pueden y deben realizarse en un solo día. La preparación de las bibliotecas de secuenciación, la secuenciación del genoma completo y el análisis de datos se pueden realizar en un horario flexible. Cuando el aislamiento celular y la amplificación del genoma completo se realizan correctamente, y el análisis de datos se realiza rigurosamente como se describe, las alteraciones en el número de copias que superan las cinco megabases se pueden detectar con alta sensibilidad y especificidad.

Si bien nuestro protocolo describe específicamente el uso de la secuenciación de células individuales para la detección de alteraciones en el número de copias, aspectos de este protocolo, como el aislamiento de células individuales y la preparación de bibliotecas, se pueden aplicar para detectar otros cambios genómicos.