Name: Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a detectar alteraciones de número de copias a escala de megabases en células individuales mediante secuenciación de células únicas. Este protocolo mejora la sensibilidad y especificidad respecto a métodos citológicos tradicionales.

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Agradecemos a Stuart Levine para comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM056800 y el Fondo de Investigación del Cáncer Curt mármol Kathy y Angelika Amon y en parte por el Instituto Koch programa de subsidios para P30-CA14051. Angelika Amon es también un investigador del Instituto Médico Howard Hughes y la Fundación para la Investigación Biomédica Glenn. Kak es apoyado por la Beca de Formación NIGMS T32GM007753.

1. Aislamiento de células individuales <ol><li> Preparar el microaspirator <ol><li> Retire el extremo de plástico transparente del conjunto del tubo aspirador e inserte el extremo más estrecho en un extremo de un tubo de PVC de 1 pie de largo con 3/16 &quot;de diámetro interior. </li><li> Insertar la salida de un filtro de jeringa de 0,2 micras en el otro extremo del tubo de PVC 1 pie de largo con 3/6 &quot;de diámetro interior. </li><li> Inserte la entrada del filtro de jeringa de 0,2 micras en un extremo de un tubo de PVC de 6 pulgadas de largo con 5/16 &quot;de diámetro interior. </li><li> Opcional: Corte el tubo de PVC de 6 pulgadas de largo con 5/16 &quot;de diámetro interno por la mitad e insertar un separador de agua en línea entre las dos mitades. </li><li> Romper una pipeta serológica de 5 ml de plástico en la graduación de 1 ml e inserte el extremo roto en el extremo abierto del tubo de PVC con 5/16 &quot;de diámetro interior. </li><li> Insertar la salida de la pipeta serológica 5 ml de plástico en el extremo flexible de un conjunto de tubo de aspirador (donde el extremo de plástico transparentehabía sido eliminado). </li><li> Para el almacenamiento, cubrir la boquilla rojo del conjunto del tubo aspirador con un tubo de plástico estéril. </li><li> Es necesario realizar un tubo capilar de vidrio de un diámetro interior de 10 a 30 micras por lo que el centro del tubo cerca de una llama del quemador Bunsen y la aplicación de la tensión en cualquiera de los extremos del tubo. Romper el tubo estirado en el medio para crear dos agujas potenciales aspirador. Repita este paso con varios tubos, ya que sólo algunos tubos va a terminar con un diámetro interior que es apropiado para recoger células individuales. </li><li> Para el almacenamiento, colocar dos tiras de plastilina en una placa de Petri de 15 cm y asegurar las agujas del aspirador a través de las tiras. </li></ol></li><li> recoger células <ol><li> Preparar una suspensión de células individuales según sea apropiado para el tipo de célula y el experimento. Por ejemplo, para preparar las células adherentes tales como líneas celulares de fibroblastos humanos, células de la cosecha de células tripsinización y transferir a un tubo cónico que contenía medio de comunicación adecuado. </li><li> Antes, durante, o unaespués de la preparación de la suspensión de células individuales (dependiendo de cuánto tiempo se tarda en preparar la suspensión de una sola célula), la instalación de la campana para la amplificación del genoma completo. <ol><li> Rocíe la superficie de la campana, cajas de puntas de pipeta y puntas de pipeta con un 10% de lejía y limpiar con una toalla de papel. Repita este paso con un 70% de etanol. </li><li> Añadir 8 l de agua desde el kit de amplificación de todo el genoma (WGA) a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos PCR, un pocillo para cada celda a ser secuenciado. Cubrir la placa de 96 pocillos PCR con una tapa de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y el lugar en el hielo. </li></ol></li><li> Añadir 1.000 células a 10 ml de medio o solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de 15 cm Petri y colocar el plato en hielo para evitar que las células se adhieran al plato. </li><li> Llevar las células en la placa de Petri y el pozo 96 de la placa de PCR con la tapa en hielo a un microscopio de luz con objetivo de 10X. </li><li> Aumentar la apertura de la aguja de aspiración golpeando suavemente el extremo sacado de THe aguja de aspiración en una superficie dura tal que la punta se rompe. Inserte el extremo ancho de la aguja de aspiración en el extremo alejado de la microaspirator. </li><li> Coloque la placa de Petri que contiene las células en la platina del microscopio. Coloque la boquilla del aspirador rojo en la boca. Utilice una mano para mover la aguja de aspiración y la otra mano para mover la placa de Petri que contiene las células. Identificar las células individuales a ser secuenciado. </li><li> El uso de succión boca, dibujar una sola célula en la aguja de aspiración junto con ~ 1-2 l de los medios de comunicación o PBS. La transferencia de la célula en los 8 l de agua dentro de un solo pocillo de la placa de 96 pocillos PCR. Evitar la introducción de burbujas cuando se transfiere la célula. </li><li> Repita el paso 1.2.7 hasta que se haya aislado el número deseado de células. Mantener la reacción PCR en hielo y cubierto con la tapa entre las células de la cosecha. Marcar los pozos que han recibido células. <ol><li> Al recoger células individuales, descongelar la única 10X tampón de lisis celular y la fragmentación de todo el gkit de amplificación enome. Después de recoger el número deseado de células, proceder inmediatamente a la amplificación del genoma completo. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Toda la amplificación del genoma <ol><li> Para evitar la contaminación durante la amplificación del genoma completo, añadir todos los reactivos dentro de una campana de cultivo de tejidos, utilizar puntas de pipeta con filtros y cambiar la punta de la pipeta en el medio pozos. </li><li> Preparar una solución de lisis y la fragmentación de memoria temporal de trabajo desde el kit de amplificación de todo el genoma (WGA). Para cada conjunto de hasta 32 células, se combinan 32 l de 10x lisis de células individuales y el tampón de fragmentación y 2 l de solución de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga. Vortex el tubo para mezclar las soluciones. </li><li> Añadir 1 l de tampón de lisis y solución fragmentación de trabajo a cada pocillo y la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar. </li><li> Cubrir la placa y sellar todos los pocillos con una película de plástico. Centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. </li><li> ciclo térmico como follOWS: 50 ° C, 1 h y 99 ° C, 4 min. </li><li> Se enfría la placa sobre hielo y centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. </li><li> Preparar una solución tampón de preparación de biblioteca de trabajo de todo el kit de amplificación del genoma. Para cada celda, se combinan 2 l de tampón de preparación de la biblioteca de células individuales 1x y 1 l de solución de estabilización biblioteca en un tubo de microcentrífuga. Preparar la solución de trabajo por varias células en el mismo tubo de microcentrífuga. </li><li> Retire la película de plástico y añadir 3 l de solución de trabajo de tampón de preparación de la biblioteca a cada pocillo. Pipetear los contenidos del bien arriba y abajo para mezclar. Vuelva a colocar la lámina de plástico. NOTA: La película de plástico puede ser reutilizado durante todo el proceso de amplificación del genoma hasta que los pozos empiezan a perforaciones en la película. Cuando esto ocurre, cambie a una nueva película de plástico. </li><li> Centrifugar brevemente la placa en un mini spinner placa y se incuba a 95 ° C durante 2 min. </li><li> Se enfría la placa sobre hielo y brevementecentrifugar la placa en una mini placa de ruleta. </li><li> Retire la película de plástico, añadir 1 l de enzima preparación biblioteca a cada pocillo, y la pipeta el contenido del bien arriba y abajo para mezclar. Mantenga la enzima preparación biblioteca en hielo o en un bloque frío a través de este paso. Vuelva a colocar la lámina de plástico. </li><li> Centrifugar brevemente la placa en mini spinner placa y el ciclo térmico de la siguiente manera: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, y mantener a 4 ° C. </li><li> Se enfría la placa sobre hielo y centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. </li><li> Preparar una mezcla de amplificación de trabajo de todo el kit de amplificación del genoma. Para cada celda, se combinan 48,5 l de agua, 7,5 l 10x amplificación de mezcla maestra y 5 l de ADN polimerasa WGA en un tubo de microcentrífuga. Preparar la mezcla de trabajo para varias células en el mismo tubo de microcentrífuga. Mantener la mezcla de trabajo en el hielo. </li><li> Retire la película de plástico, añadir 61 l de trabajo mezcla de amplificaciónA cada pocillo, y contenido de la pipeta de bien arriba y abajo para mezclar. Mantener la mezcla de amplificación de trabajo en hielo o en un bloque frío a través de este paso. Vuelva a colocar la lámina de plástico. </li><li> Centrifugar brevemente la placa en un mini spinner placa y el ciclo térmico de la siguiente manera: 95 ° C, 3 min, 25 ciclos de 94 ° C, 30 seg y 65 ° C, 5 min, y mantener a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 60 l de cada muestra a un tubo de microcentrífuga separado y se almacena a - 20 ° C para su uso en el paso 3. </li><li> Añadir colorante de carga de ADN para el volumen restante de cada muestra (es decir, 3 l de ADN 6x carga de colorante a 15 l de muestra) y ejecute 5 l de cada reacción en un gel de agarosa al 1%. NOTA: Las células que amplifican con éxito aparecerá como una mancha de 250 a 1000 pares de bases. Las muestras que no muestran una mancha, o sólo muestran una débil citología es poco probable que produzca datos de secuenciación útiles. </li></ol> 3. Secuenciación <ol><li> Purificar las muestras con perlas paramagnéticas. <ol><li> ThaLas muestras de ADN w en hielo. perlas paramagnéticas Vortex hasta que la solución es homogénea e incubar las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. </li><li> Transferir 20 l de cada muestra de ADN en un tubo de microcentrífuga limpio. El resto de la muestra se puede almacenar a -20 ° C. </li><li> Añadir 30 l (1,5x) de perlas paramagnéticas a cada muestra de ADN y agitar para mezclar. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Deje la solución madre de perlas a temperatura ambiente para su uso en el paso 3.4. </li><li> Colocar los tubos en una tira tubo magnético durante 2 minutos, o hasta que los granos forman un sedimento y el sobrenadante es claro. </li><li> Con una pipeta P200, eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible sin molestar a los granos. </li><li> Añadir 180 l de etanol al 80% a la mezcla de DNA-perla. Girar los tubos varias veces en relación con el imán para &quot;aclarado&quot; las perlas a través de la solución de etanol. </li><li> Con una pipeta P200, eliminar la mayor cantidad de etanol como el lavado posible sin perturbar las perlas. </li><li> Repita 3.1.6 y 3.1.7. </li><li> Secar las cuentas por aproximadamente 10 minutos o hasta que ya no es visible etanol. Proceder al siguiente paso, cuando los granos aparecen grietas o caerse de la pared del tubo. </li><li> Retire las muestras de la banda magnética. Añadir 40 l de 10 mM Tris pH 8.0 para eluir el ADN de las perlas y agitar las muestras para resuspender las perlas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar brevemente las muestras para recoger el líquido en la parte inferior del tubo y se colocan los tubos en una tira magnética tubo durante al menos dos minutos. Transferir el eluyente en tubos de microcentrífuga limpios y sin molestar a los granos. </li></ol></li><li> la normalización de la muestra <ol><li> Cuantificar la concentración de cada muestra usando un espectrofotómetro. Las concentraciones deben variar de 10 a 30 ng / mL. </li><li> Diluir cada muestra a 0,2 ng / l usando 10 mM Tris pH 8,0. Los siguientes pasos requerirán un mínimo de iNput de 5 l de esta dilución. </li></ol></li><li> la preparación de la biblioteca <ol><li> Preparar las bibliotecas de secuenciación siguiendo las instrucciones del kit de preparación de la biblioteca 13. </li></ol></li><li> la limpieza final <ol><li> Limpiar las muestras de acuerdo con la etapa 3.1. Para longitudes de lectura de 50 pb, 75 pb o 150 pb, utilizar una proporción de grano para degustar volumen de 1.5x, 1x, o 0,6x, respectivamente. Eluir con 15 l de 10 mM Tris pH 8,0. </li><li> Ejecutar las muestras en un analizador de fragmentos para comprobar la distribución del tamaño de la biblioteca 14. La distribución del tamaño debe extenderse uniformemente desde 150 a la 900 pb. </li></ol></li><li> Cuantificar las muestras mediante qPCR <ol><li> El uso de un kit de cuantificación de la biblioteca, configure una reacción de PCR cuantitativa de acuerdo a las instrucciones del juego 15. Dejar un espacio en blanco la columna añadir las normas positivas (patrones de ADN del kit) y las normas negativo (agua u otra solución en blanco). </li><li> ciclo térmico como folmínimos: 95 ° C, 5 min (velocidad de rampa de 4,8 ° C / s) y 35 ciclos de 95 ° C, 30 seg (velocidad de rampa de 4,8 ° C / s) y 60 ° C, 45 seg (velocidad de rampa de 2,5 ° C / seg). </li></ol></li><li> pooling <ol><li> Determinar cómo se necesitan muchos carriles en la celda de flujo y se dividen las muestras en grupos, con un grupo por cada carril. </li><li> Para cada grupo de muestras, elegir la muestra con la concentración más baja sobre la base de los datos de qPCR de la etapa 3.5.2 y normalizar todas las muestras en ese grupo a que la concentración de uso de 10 mM Tris pH 8,0. </li><li> Reunir las muestras en cada grupo. </li></ol></li><li> secuenciación <ol><li> Piscinas de carga en la máquina de secuenciación de próxima generación siguientes procedimientos estándar 16. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Datos NOTA: Se requiere un entorno basado en Unix para ejecutar los programas y scripts en esta sección. Instalar el software que se menciona en el protocolo después de su en<html> guías de instala-. Todos los guiones se pueden encontrar en https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. <ol><li> Recortar las lecturas de 40-nt usando fastx_trimmer partir de la versión 0.0.13 FASTX-Toolkit 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l -o 40 example.trim.fastq </li><li> Alinear las lecturas con el genoma apropiado de referencia (mm.9 para el ratón, hg19 para el ser humano) usando BWA versión 0.6.1 con las opciones predeterminadas 18. BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq&gt; example.sai BWA Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq&gt; example.sam </li><li> Retire las alineaciones de chrm y los cromosomas al azar, a continuación, ordenar e indexar el archivo resultante utilizando BAM SAMTools versión 0.1.19 19. grep -v -w chrm example.sam | grep -v al azar&gt; example.filtered.sam samtools ver example.filtered.sam -uSh | samtools tipo - example.filtered samtools índice example.filtered.bam </li><li> HMMcopy funcionar para detectar CNV= &quot;Xref&quot;&gt; 20 <ol><li> Utilice gcCounter en HMMcopy para generar un archivo de referencia GC porcentaje del genoma. Utilice la opción &quot;-w 500000&quot; para especificar el tamaño de la ventana. Utilizar la misma versión del archivo de referencia fasta utilizado en el paso 4.2, pero asegúrese de chrm y los cromosomas al azar se eliminan del archivo FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa&gt; mm9_gc.wig </li><li> Utilice generateMap.pl en HMMcopy para generar un archivo de maniobra para mapeabilidad. Utilice la opción &quot;-w 40&quot; para especificar leer longitud. Utilizar el mismo archivo de referencia fasta utilizado en el paso 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i -o mm9.fa mm9.fa mm9.bigwig </li><li> Utilice mapCounter en HMMcopy para generar un archivo de referencia mapeabilidad para el genoma. Utilice la opción &quot;-w 500000&quot; para especificar el tamaño de la ventana. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig&gt; mm9_map.wig </li><li> Utilice readCounter en HMMcopy para generar un archivo de maniobra para cada archivo de BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam&gt; input.wig </li&gt; <li> Modificar las rutas de acceso a los archivos de referencia en los guiones (R run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), utilizar los archivos generados anteriormente en el apartado 4.4.1 (por ejemplo, mm9_gc.wig) y 4.4.3 (por ejemplo, mm9_map. peluca) para el GFile las variables y MFILE, que se refieren al archivo de archivo de referencia GC porcentaje y referencia mapeabilidad, respectivamente. A continuación, ejecute la secuencia de comandos proporcionada R &quot;run_hmmcopy.mm9.r&quot; o &quot;run_hmmcopy.hg19.r&quot;. R CMD run_hmmcopy.mm9.r LOTE o R CMD run_hmmcopy.hg19.r LOTE </li><li> Para el procesamiento por lotes de un conjunto de archivos BAM, BAM poner los archivos en una sola carpeta y ejecutar el guión previsto &quot;HMMpipe.pl&quot; en el paquete para llamar segmentos y calcular las puntuaciones de variabilidad (VS). Siga el formato: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm.9 </li></ol></li><li> DNAcopy funcionar para detectar CNV 21. <ol><li> Utilice SAMtools versión 0.1.19 para extraer asignada de forma única lee de cada archivo de BAM. samtools ver -h 0 -Fexample.filtered.bam x0004 | egrep -i &quot;@ ^ | XT: A: T&quot; | samtools ver -shū -&gt; example.mapped.bam </li><li> Utilice MarkDuplicates en Picard versión 1.94 para marcar los duplicados de PCR en el archivo de BAM 22. java-jar MarkDuplicates.jar ENTRADA SALIDA = example.mapped.bam = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true </li><li> Utilice coveragebed en bedtools versión 2.17.0 para contar mapeado lee en cada una de las ventanas dinámica 500kb mapeables predefinidos en el archivo de cama siempre &quot;mm9.500k.dynamic.win.bed&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.bed&quot; 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed Conteos | Ordenar -k1,1 -k2,2n&gt; example.nondup.counts </li><li> Utilizar el script Perl proporcionado &quot;normalizeGC.pl&quot; para normalizar los recuentos de lectura basado en el archivo de referencia proporcionado contenido de GC &quot;mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt &quot;. Perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts&gt; example.bam.norm.counts </li><li> Utilice la secuencia de comandos R &quot;dnacopy.r&quot; proporcionado para llamar a los segmentos. R CMD dnacopy.r LOTE </li></ol></li><li> identificar las VNC <ol><li> Excluir las células para las que el VS calculada en 4.4.6 es superior a 0,26. </li><li> Filtrar los segmentos llamados por HMMcopy en 4.4.6 para incluir sólo aquellos para los que la ratio de la mediana de registro 2 es mayor que 0,4 (ganancia putativo) o menos de -0.35 (pérdida putativo). </li><li> Filtrar los segmentos llamados por DNAcopy en 4.5.5 para incluir sólo aquellos para los que significa el segmento es mayor que 1,32 o menos de 0,6. </li><li> La superposición de los segmentos de 4.6.2 y 4.6.3, llamando CNV sólo en las regiones donde tanto HMMcopy y DNAcopy identifican una ganancia o pérdida putativo putativo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tradicionalmente, la identificación de las VNC y aneuploidía en el nivel de células individuales necesarios métodos citológicos como el pescado y el cielo. Ahora, la secuenciación de una sola célula se ha convertido en un enfoque alternativo para tales preguntas. secuenciación de una sola célula tiene ventajas sobre el pescado y SKY, ya que es a la vez el genoma de ancho y de alta resolución. Por otra parte, cuando se aplican métodos de control de calidad apropiados, secuenciación sola célula puede proporcionar una evaluación más fiable de la CNV y aneuploidía, ya que no es susceptible a la hibridación y la difusión de artefactos inherentes a la pesca y el cielo. Sin embargo, muchas de las recientes aplicaciones de secuenciación de células individuales no han sido documentados por evaluación exhaustiva de la sensibilidad y especificidad de los métodos y análisis. De hecho, algunos de los métodos analíticos utilizados por otros estudios están asociados con altas frecuencias (&gt; 50%) de los falsos positivos CNV llama 12. El enfoque que describimos ha sido probado rigurosamente el uso de células de knCNV propia carga con el fin de determinar las tasas de descubrimiento de verdaderos y falsos y optimizar la sensibilidad y especificidad de la detección CNV 12. Usando el control de calidad y enfoques analíticos descritos en este protocolo, aproximadamente el 20% de las ganancias de 5 Mb, el 75% de las pérdidas de 5 Mb, y todas las VNC superior a 10 Mb puede ser detectado. A pesar de la determinación de la tasa de falso descubrimiento de la secuenciación de una sola célula es difícil, hemos estimado que sea inferior al 25%. Este protocolo se puede aplicar a las células de una variedad de fuentes, los guiones se pueden modificar para ajustar la resolución de la detección de CNV, y el protocolo se pueden adaptar para identificar otros tipos de alteraciones genómicas. Hay una variedad de medios de disociar tejidos frescos en células individuales, y muchas publicaciones describen procedimientos optimizados para tejidos específicos, tales como la piel 24 y el cerebro 25. Preferimos para aislar células individuales por microaspiración ya que permite fo<html> r evaluación visual de cada celda a ser secuenciado. Sin embargo, también es posible aislar las células individuales por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 26 y los dispositivos de microfluidos 27. Si el aislamiento de células individuales y la amplificación del genoma completo se realiza de forma manual, es razonable para aislar y amplificar hasta cuarenta celdas en una sola sesión. Con el fin de obtener datos de secuenciación sola célula de alta calidad, es crucial que la amplificación de los genomas de células individuales es uniforme y completa. Encontramos que la calidad de las células individuales aisladas, así como la eficiencia de la lisis y la amplificación tiene un impacto significativo en la calidad de los datos de secuenciación. Como tal, las células se deben cosechar de su entorno nativo justo antes del aislamiento y la amplificación de todo el genoma debe comenzar inmediatamente después de que se aislaron células. Además, la etapa de lisis y la fragmentación se debe seguir exactamente como se describe en el 2.3 a 2.6 pasos. &quot;&gt; Los algoritmos se pueden ajustar para cambiar la resolución de la detección de CNV, con efectos sobre la sensibilidad y especificidad 12 opuestas. También es posible ajustar los umbrales para detectar aneuploidía de todo el cromosoma en el contexto de tetraploidía 11. Sin embargo, nos encontramos con que nuestro enfoque se limita a la detección de las VNC superior a 5 Mb, como el ruido introducido durante la amplificación del genoma completo complica la detección de variantes más pequeñas 12. las futuras mejoras en los métodos de amplificación de todo el genoma en última instancia, deben mejorar la resolución de la detección de la CNV mediante la secuenciación de una sola célula. Secuenciación de células individuales permite la investigación no sólo de alteraciones de número de copias, sino también variaciones de nucleótidos individuales 28, 29 y la variación estructural 30. El protocolo para el aislamiento de células individuales se puede aplicar para responder a estos otros Questions. Sin embargo, la elección del método de amplificación de todo el genoma depende de la aplicación específica. El método descrito en este protocolo, que se basa en la reacción en cadena de la polimerasa, es el más adecuado para la detección de alteraciones de número de copias ya que está asociada con niveles más bajos de sesgo de amplificación 32. Para la investigación de otros tipos de alteraciones genómicas, tales como polimorfismos de nucleótido único, se cree que otros métodos de amplificación de todo el genoma a ser más adecuado 31, 32.

Las alteraciones en el número de copias de ADN pueden variar en tamaño desde varios pares de bases (variantes de número de copia) (CNV) a la totalidad de los cromosomas (aneuploidía). Alteraciones del número de copias que afectan a grandes regiones del genoma puede tener consecuencias significativas fenotípicos mediante la alteración de la expresión de hasta miles de genes 1, 2. CNVs que están presentes en todas las células de una población se puede detectar por secuenciación granel o métodos de 3 a base de microarrays, 4. Sin embargo, las poblaciones también pueden ser genéticamente heterogénea, con CNVs existentes en un subconjunto de la población o incluso células individuales. La heterogeneidad genética es común en el cáncer, conduciendo la evolución del tumor, y también presente en los tejidos normales, con consecuencia desconocido 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Tradicionalmente, la heterogeneidad genética se evaluó ya sea por métodos citológicos o secuenciación granel. Citológicas enfoques, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH), extensiones de cromosomas y cariotipo espectral (SKY), tienen la ventaja de identificar las alteraciones presentes en las células individuales, pero tienen altas tasas de error debido a los artefactos de la hibridación y la difusión 11. Estos enfoques también están limitados en su número de copias de la resolución de sólo revela los cambios que abarcan varias megabases. La secuenciación de ADN o microarrays de mayor, aunque superior en precisión y resolución, es menos sensible. Con el fin de detectar la heterogeneidad genética por los enfoques basados ​​en la población, las variantes deben estar presentes en una fracción sustancial de las células en la población. La aparición de métodos para amplificar el ADN genómico a partir de células individuales ha permitido secuenciar el genoma de las células individuales. Seque una sola célulancing tiene las ventajas de alta resolución, alta sensibilidad, y, cuando se aplican los métodos de control de calidad apropiados, de alta precisión 12. A continuación, describimos un método para detectar alteraciones del número de copias megabase escala en células individuales. Aislamos células individuales por microaspiraciones, amplificar el ADN genómico utilizando enlazador-adaptador de PCR, se preparan bibliotecas de secuenciación de próxima generación, y detectar las variantes de número de copias por tanto modelo oculto de Markov y segmentación binaria circular.

<table><tbody><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas</td> Tubo de PVC <td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>(ID 3/16", OD 5/16", ~1 pie)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PVC (ID 5/16", OD 7/16", ~6 pulgadas)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Acrodisc con membrana HT Tuffryn (diámetro 25 mm, tamaño de poro 0,2 y micro; m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Cualquier pipeta de plástico de 5 mL debería ser suficiente</td></tr><tr><td>Trampa de agua en línea para uso de oxígeno</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de punto de fusión capilar (diámetro interior 0,8-1,1 mm, 100 mm de longitud)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Arcilla para modelar</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (150 mm de diámetro)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>La superficie debe ser inadherente para facilitar la aspiración de células individuales</td></tr><tr><td>Hard-Shell&nbsp; Semifaldón de altura completa de 96 pocillos PCR&nbsp; Placas</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Cualquier placa de PCR de 96 pocillos debería ser suficiente</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Cualquier placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos debería ser suficiente</td></tr><tr><td>GenomePlex Kit de amplificación de genoma completo de célula</td> única <td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Película Microseal 'A'</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini spinner de placas</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp;</td><td>Cualquier termociclador debería ser suficiente, siempre y cuando pueda acomodar una placa de PCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Imán</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Cualquier tira de tubo magnético similar debería ser suficiente</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de preparación de la biblioteca de ADN</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo (optimizado para Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&nbsp;</td><td>Este kit está optimizado para la máquina de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480. Si utiliza una máquina diferente, sustitúyala por un kit optimizado para su máquina.</td></tr></tbody></table>

detección del número de copias alteraciones uso de secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

La detección de los cambios genómicos en la resolución de una sola célula es importante para caracterizar la heterogeneidad genética y la evolución en los tejidos normales, el cáncer y las poblaciones microbianas. Los métodos tradicionales para evaluar la heterogeneidad genética se han visto limitados por la baja resolución, baja sensibilidad y / o especificidad baja. secuenciación de una sola célula se ha convertido en una herramienta poderosa para detectar la heterogeneidad genética con cuando se analiza adecuadamente alta resolución, alta sensibilidad y, de alta especificidad. Aquí proporcionamos un protocolo para el aislamiento, la amplificación del genoma completo, secuenciación y análisis de células individuales. Nuestro enfoque permite la identificación fiable de las variantes de número de copias megabase escala en células individuales. Sin embargo, los aspectos de este protocolo también se pueden aplicar para investigar otros tipos de alteraciones genéticas en las células individuales.

El aspirador montado debería ser similar a la de la Figura 1A. La aguja debe establecerse de tal manera que es suficientemente ancha para acomodar una sola célula, pero no tan ancho que un gran volumen se redacta con la célula individual. De aspiración de las células individuales es más fácil cuando hay entre uno y cinco células en un campo de 10 veces (Figura 1B). Si la amplificación del genoma entero tiene éxito, la muestra aparece como una mancha en un gel de agarosa (Figura 2, carriles 1, 2, 4, 5, 6, y 7). Un frotis débil o ausente indica una reacción de amplificación fallado y la muestra no debe ser secuenciado (Figura 2, carriles 3 y 8). Después de la preparación de la biblioteca, la distribución de tamaño de los fragmentos de las muestras debe ser evaluada por electroforesis capilar en un analizador de fragmentos.Con éxito bibliotecas preparadas tendrán una distribución bastante uniforme de tamaños de los fragmentos 150 a 900 pb (Figura 3, A, B). Preparación biblioteca Error dará lugar a una distribución de tamaño de fragmento asimétricos y tales bibliotecas no debe ser secuenciado (Figura 3C). El procesamiento de los datos de secuenciación a través del modelo oculto de Markov (HMMcopy) y la segmentación binaria circular (DNAcopy) analizará el genoma de cada célula en segmentos de número de copias estimado. Estos segmentos pueden ser filtrados para identificar aquellos con un número de copias estimado consistente con la ganancia o pérdida en una sola célula (Tabla 1). Estos segmentos filtrados desde HMMcopy y DNAcopy entonces se debe solapar para identificar alta confianza CNV. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Figura 1. Aislamiento de células individuales. (<html> A) Un ensamblado microaspirator. (B) Un campo 10X muestra disociada células (flechas) y la aguja microaspirator (esquina inferior derecha). De aspiración de las células individuales es más fácil cuando hay entre uno y cinco células en un campo de 10X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Figura 2. amplificación del genoma entero. electroforesis en gel de agarosa de 5 l de los productos de amplificación de todo el genoma. Las muestras que amplifican con éxito aparecerá frotis tan brillante de 100 pb a 1 kb (carriles 1, 2, 4, 5, 6 y 7) y puede ser secuenciado. Las muestras que no se amplifican con éxito producirá manchas débiles o sin citología (carriles 3 y 8) y no debe ser secuenciado.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Figura 3. Preparación de la biblioteca. Los resultados representativos de un analizador de fragmentos. Los gráficos muestran el tamaño del fragmento (en pb) en el eje X y unidades de fluorescencia relativa (RFU) en el eje Y. A la derecha de cada gráfica es un carril de gel simulado. (A) Resultados para una muestra ideal, con una distribución uniforme entre 150 y 900 pb y sin picos afilados o sesgo hacia un lado. Esta muestra es aceptable para la secuenciación. (B) Los resultados de una muestra bien, con una distribución de tamaño sesgados hacia tamaños de los fragmentos inferiores. Si bien esto no es óptima, la muestra todavía puede ser secuenciado. (C) Resultados de una muestra fracasado, en los que predominan los pequeños tamaños de los fragmentos. Esto es probablemente causado por la incubación prolongada durante el paso de tagmentationde la preparación de la biblioteca. Esta muestra no debe ser secuenciado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Muestra </td><td> Segmento </td><td> Chr </td><td> comienzo </td><td> Fin </td><td> Estado </td><td> Mediana </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> CHR8 </td><td> 144500001 </td><td> 146500000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67000001 </td><td> 134500000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> dohr19 </td><td> 1 </td><td> 20.000.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chry </td><td> 1 </td><td> 59500000 </td><td> 2 </td><td> -1.506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Muestra </td><td> Chrom </td><td> Inicio bin </td><td> fin bin </td><td> comienzo </td><td> Fin </td><td> Seg media </td><td> med seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62612945 </td><td> 129971511 </td><td> 1.4688 </td><td> 0,157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28416392 </td><td> 1.4141 </td><td> 0.1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> CHRX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51659160 </td><td> 95343369 </td><td> 1.3548 </td><td> 0.1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chry </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23805358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0.3591 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Análisis de los datos. segmentos filtrados generados por HMMcopy y DNAcopy de una sola célula. La superposición de estos dos resultados revela una ganancia en el cromosoma 10 de 67 a 130 Mb, así como una ganancia en el cromosoma 19 de 0 a 20 Mb. Hemos encontrado que las ganancias en la parte proximal del cromosoma 19 son un artefacto de secuenciación sola célula 12.

secuenciación de una sola célula es una herramienta cada vez más popular y accesible para hacer frente a los cambios genómicos en alta resolución. Proporcionamos un protocolo que utiliza la secuenciación de una sola célula para identificar alteraciones en el número de copias en las células individuales.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar alteraciones en el número de copias de ADN a escala de megabases en células individuales. Para categorizar la heterogeneidad genómica en poblaciones celulares, es necesario identificar cambios genómicos con resolución a nivel de célula individual. Tradicionalmente, esto se lograba mediante enfoques citológicos; sin embargo, estos métodos tenían limitaciones en cuanto a sensibilidad y especificidad.La secuenciación de una sola célula puede detectar una variedad de cambios genómicos, con mayor sensibilidad y especificidad que los métodos anteriores, pero únicamente cuando se realiza cuidadosamente. A continuación, describimos cómo utilizar la secuenciación de una sola célula para detectar de forma confiable alteraciones en el número de copias a escala de megabases en células individuales. Para armar el microaspirador, comience por retirar el extremo de plástico transparente del conjunto del tubo del aspirador e inserte el extremo estrecho en uno de los extremos de un tubo de PVC de un pie de largo con un diámetro interno de 3/16 de pulgada.Inserte la salida de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en el otro extremo de un tubo de PVC de un pie de longitud con un diámetro interno de 3/16 de pulgada. Luego, inserte la entrada del filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un extremo de un tubo de PVC de seis pulgadas de longitud con un diámetro interno de 5/16 de pulgada. Rompa una pipeta serológica plástica de cinco mililitros en la graduación de un mililitro e inserte el extremo roto en el extremo libre del tubo de PVC con un diámetro interno de 5/16 de pulgada.A continuación, inserte la salida de la pipeta serológica plástica de cinco mililitros en el extremo flexible de un conjunto de tubo aspirador, y luego use un tubo plástico estéril para cubrir la boquilla roja del conjunto de tubos durante el almacenamiento. Estire un tubo de capilaridad de vidrio hasta un diámetro interno de 10-30 micrómetros colocando el centro del tubo cerca de una llama y aplicando tensión en ambos extremos del tubo. Rompa el tubo estirado en dos mitades para crear dos agujas aspiradoras potenciales.Repita este paso con varios tubos para asegurar que se preparen suficientes agujas con un diámetro interno adecuado para seleccionar células individuales. Para preparar células adherentes, como líneas celulares de fibroblastos humanos, recolecte las células mediante tripsinización y transfiera las células a un tubo cónico que contenga el medio adecuado. Prepare una cabina de seguridad para la amplificación del genoma completo utilizando lejía al 10 % para rociar la superficie de la cabina, las cajas de puntas para pipeta y las puntas de pipeta.Luego, utilice una toalla de papel para limpiarlos completamente antes de repetir el lavado con etanol al 70 %. Añada ocho microlitros de agua del kit de amplificación del genoma completo, o WGA, a los pocillos individuales de una placa PCR de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa PCR de 96 pocillos con la tapa de una placa de cultivo celular de 96 pocillos y coloque la placa sobre hielo.A continuación, agregue 1.000 células a 10 mililitros de medio o PBS en una placa de Petri de 15 centímetros y coloque la placa sobre hielo para evitar que las células se adhieran. Luego, mientras aún esté sobre hielo, transfiera las células de la placa de Petri y la placa de PCR de 96 pocillos a un microscopio óptico con un objetivo de 10X. Aumente la abertura de la aguja aspiradora golpeando suavemente el extremo estirado de la aguja contra una superficie dura para que la punta se rompa.Luego, inserte el extremo ancho de la aguja en el extremo transparente del microaspirador. A continuación, coloque la placa de Petri que contiene las células sobre la platina del microscopio. Introduzca la boquilla roja del aspirador en la boca.Luego, utilizando una mano para mover la aguja del aspirador y la otra para mover la placa de Petri, identifique células individuales para ser secuenciadas. Mediante succión bucal, aspire una célula individual hacia la aguja del aspirador junto con aproximadamente uno a dos microlitros de medio o PBS. Transfiera la célula al interior de los ocho microlitros de agua en un único pocillo de una placa PCR de 96 pocillos.La calidad y utilidad de los datos de secuenciación de una sola célula depende del estado de cada célula y de su genoma; por lo tanto, tenga cuidado durante la preparación celular y la microaspiración para aislar células viables y no apoptóticas. Después de aspirar cada célula y transferirla a un pocillo de la placa de PCR, marque el pocillo que ha recibido una célula. Repita esto para el número deseado de células.Mientras tanto, descongele el tampón de lisis y fragmentación 10X para célula única del kit de amplificación del genoma completo. Para prevenir la contaminación durante la amplificación del genoma completo, agregue todos los reactivos dentro de una cabina de flujo laminar. Utilice puntas de pipeta con filtros y cambie la punta de pipeta entre cada pozo.Para cada conjunto de hasta 32 células, combine 32 microlitros de tampón de lisis y fragmentación al 10X para células individuales y dos microlitros de solución de proteinasa K en un tubo de microcentrifugado, luego vortexee el tubo para mezclar el contenido. Añada un microlitro de la solución a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Cubra la placa y use una película plástica para sellar todos los pocillos.Luego, centrifugue brevemente la placa en un mini centrífugo para placas. A continuación, pase la placa por el termociclador utilizando el siguiente programa. Después, enfríe la placa en hielo y centrifúguela brevemente.Para preparar una solución de tampón de preparación de biblioteca de trabajo a partir del kit de amplificación del genoma completo, combine dos microlitros de tampón de preparación de biblioteca 1X para una sola célula y un microlitro de solución de estabilización de biblioteca por cada célula. Una lisis celular adecuada y una fragmentación completa del genoma son fundamentales para minimizar el sesgo durante la amplificación del genoma completo y garantizar la preparación de bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Por lo tanto, tenga cuidado de realizar estos pasos exactamente como se indican.Retire la película de plástico del pocillo y agregue tres microlitros de la solución a cada pocillo. Pipetee el contenido del pocillo hacia arriba y hacia abajo para mezclar, luego reemplace la película de plástico. Después de centrifugar brevemente la placa, incube las células a 95 grados Celsius durante dos minutos, enfríe la placa en hielo y centrifugue brevemente la placa nuevamente.Ahora, retire la película de plástico, agregue un microlitro de enzima de preparación de biblioteca a cada pocillo y aspire y expulse el contenido del pocillo varias veces para mezclar; luego, reemplace la película de plástico. Después de centrifugar brevemente la placa, colóquela en el termociclador y ejecute el siguiente programa. Tras enfriar la placa y darle una breve centrifugación, prepare una mezcla de amplificación de trabajo a partir del kit de amplificación del genoma completo combinando 48,5 microlitros de agua, 7,5 microlitros de mezcla maestra de amplificación 10X y 5 microlitros de polimerasa WGA, por cada célula.Mantenga la mezcla de trabajo en hielo. Retire la película de plástico de la placa. Añada 61 microlitros de la mezcla de amplificación de trabajo a cada pocillo y aspire y expulse el contenido de cada pocillo varias veces para mezclar; luego, reemplace la película de plástico.Centrifugar brevemente la placa y termociclar de la siguiente manera. Secuenciar las muestras y realizar el análisis de datos según el protocolo descrito. Como se muestra en esta figura, si la amplificación del genoma completo es exitosa, la muestra aparecerá como una mancha difusa en un gel de agarosa.Una banda débil o ausente indica una reacción de amplificación fallida y la muestra no debe ser secuenciada. Como se muestra aquí, el análisis de los tamaños de los fragmentos se realizó mediante electroforesis capilar en un analizador de fragmentos. Las bibliotecas preparadas con éxito tendrán una distribución bastante uniforme de tamaños de fragmentos desde 150 hasta 900 pares de bases.La preparación fallida de la biblioteca dará como resultado una distribución sesgada del tamaño de los fragmentos, y dichas bibliotecas no deben ser secuenciadas. Mediante el uso del modelo oculto de Markov y la segmentación binaria circular, el genoma de cada célula se dividió en segmentos de número de copia estimado. Esta tabla muestra los resultados solapados de una sola célula y revela una ganancia en el cromosoma 10 desde 67 hasta 130 megabases, y una ganancia en el cromosoma 19 desde 0 hasta 20 megabases.El aislamiento y la amplificación del genoma completo de células individuales pueden y deben realizarse en un solo día. La preparación de bibliotecas de secuenciación, la secuenciación del genoma completo y el análisis de datos pueden realizarse luego según un horario flexible. Cuando el aislamiento celular y la amplificación del genoma completo se realizan adecuadamente, y el análisis de datos se lleva a cabo rigurosamente como se describe, se pueden detectar alteraciones en el número de copias superiores a cinco megabases con alta sensibilidad y especificidad.Aunque nuestro protocolo describe específicamente el uso de la secuenciación de célula individual para la detección de alteraciones en el número de copias, aspectos de este protocolo, como el aislamiento de células individuales y la preparación de bibliotecas, pueden aplicarse para detectar otros cambios genómicos.

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja...

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

CGH array para la detección de variantes de número de copias genómicas ha reemplazado análisis de cariotipo de bandas-G. Este artículo describe la tecnología y su aplicación en un laboratorio de servicio de diagnóstico.

Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

Este manuscrito describe una técnica para la detección de mutaciones de baja frecuencia en ctDNA, ER-SS. Este método se distingue por su uso único de corrección de errores de bidireccional, un filtro de fondo especial y eficiente adquisición molecular.

Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

Este manuscrito describe el análisis de variación número de la copia realizado en la DNA del suero o plasma utilizando el método PCR en tiempo real. Este método es adecuado para la predicción de resistencia a medicamentos en pacientes con cáncer de próstata resistente a castración, pero podría ser informativa también para otras enfermedades.

Suero y Plasma copia número detección mediante PCR en tiempo real

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.

Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Este protocolo describe un flujo de trabajo de secuenciación de próxima generación automatizado y acreditado por ISO15189 para detectar alteraciones genómicas dirigidas en tejidos incluidos en parafina fijados en formol de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Detección de alteraciones dirigidas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante secuenciación de próxima generación

Aprende a detectar alteraciones de número de copias a escala de megabases en células individuales mediante secuenciación de células únicas. Este protocolo mejora la sensibilidad y especificidad respecto a métodos citológicos tradicionales.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

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