Name: Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a identificar variaciones en el número de copias mediante hibridación genómica comparativa basada en arreglos en mutantes de Medicago truncatula. Este método permite estudiar la regulación genética del desarrollo de nódulos en leguminosas.

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Financiación de este trabajo se proporciona en parte por una subvención de NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

Nota: la figura 1 muestra los cinco pasos de la matriz, el protocolo CGH. Son: 1) preparación de materiales de planta; 2) aislamiento de muestras de ADN de alta calidad; Etiquetado 3) y purificación de muestras de ADN; 4) hibridación, lavado y barrido de arreglos de discos de todo el genoma; y 5) análisis de datos CGH. Arreglos de discos alicatado todo el genoma de M. truncatula contienen un total de 971.041 sondas de oligo único dirigido a más de 50.000 genes o modelos de gene en el genoma (véase tabla de materiales). Las únicas sondas están espaciadas aproximadamente cada 150 pares de bases (PB) en las regiones exonic y 261 bp en regiones intronic del genoma de M. truncatula.
 1. preparación de materiales de planta <ol><li>Scarify tipo salvaje (WT; Cv de M. truncatula Jemalong A17) y semillas mutantes FN6191 con ácido sulfúrico concentrado durante 8 min (véase Tabla de materiales). Retire y deseche el ácido sulfúrico a un recipiente de desechos líquidos.</li>
	<li>Enjuagar las semillas con agua desionizada autoclave tres veces.</li>
	<li>Superficie de esterilizar las semillas con solución de cloro de 20% durante 10 minutos</li>
	<li>Enjuagar las semillas con agua desionizada autoclave tres veces.</li>
	<li>Semillas de almacén a 4 ° C por 3 días. Tras la vernalización, transferencia y germinar las semillas en el suelo para una semana en una cámara de crecimiento con 16 h/8 h luz/oscuridad y 150 µE/m 2/s la intensidad de la luz.</li>
	<li>Trasplante de las plántulas a macetas de 1 galón y crecer en un invernadero con ciclo de luz/oscuridad de 16 h a 8 h, 150 µE/m 2 /s intensidad de luz para tres a cuatro semanas. Recoger las muestras de hojas jóvenes de las plantas para la extracción de ADN.</li>
</ol> 2. Aislamiento de muestras de ADN de alta calidad <ol><li>1 g de tejido foliar joven de una sola planta y congelar en nitrógeno líquido inmediatamente.</li>
	<li>Moler tejidos hojas congeladas en nitrógeno líquido con un mortero y mortero a polvo fino.</li>
	<li>Aislar ADN genómico con un aislamiento de DNA kit (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Resuspenda cuidadosamente purificada muestras de ADN en 50 μl de autoclave doble desionizada H 2 O (ddH 2 O) o 1 x buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0).</li>
	<li>Las concentraciones de DNA medida con un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Evaluar 260 nm/280 nm y 260 nm/230 nm proporciones de muestras de ADN. 
	Nota: Las muestras de ADN de alta calidad deben tener una proporción de 260 nm/280 nm &#8805; 1.8 y un cociente de 260 nm/230 nm &#8805; 2.0.</li>
	<li>Más evaluar muestras de ADN mediante la ejecución de ellos en el 1% geles de agarosa. 
	Nota: Las muestras de ADN de alta calidad deben tener alto peso molecular y no deben ser contaminadas por el ARN. Idealmente, la concentración final de ADN debería ser ~ 150 ng/μl.</li>
</ol> 3. Etiquetado ADN y purificación <ol><li>diluir 1 μg de DNA genómico de muestras con ddH 2 O hasta un volumen final de 20 μl en un tubo de centrífuga 500 μl.</li>
	<li>Añadir 5 μl de una cartilla al azar (véase Tabla de materiales) al tubo de.</li>
	<li>Vortex brevemente el tubo y colocarlo en un termociclador para incubar y desnaturalizar la DNA a 98 ° C durante 10 minutos</li>
	<li>Tomar el tubo en el termociclador y ponerla inmediatamente en agua con hielo para enfriar durante 5 minutos</li>
	<li>Etiquetado de preparar dos mezclas como se muestra en la tabla 1.</li>
	<li>Tubos de añadir 25 μl de etiquetado de mezclas 1 y 2 para referencia ADN y ADN de la muestra, respectivamente.</li>
	<li>Mezclar el etiquetado mezcla ADN mediante pipeteo tres veces y girar los tubos brevemente.</li>
	<li>Poner los tubos en un termociclador a incubar a 37 ° C por 2 h y luego a 65 ° C por 20 min inactivar la enzima exo-Klenow (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>430 añadir μl de 1 x de buffer TE a cada tubo.</li>
	<li>El contenido de la mezcla y girar los tubos brevemente.</li>
	<li>Transferencia de la solución en el tubo en una columna de purificación con una colección de 2 mL del tubo (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Centrifugar la columna de purificación a 14.000 x g durante 10 minutos</li>
	<li>Descartar el paso a través de la solución.</li>
	<li>Añadir 480 μL 1 x buffer TE a cada columna.</li>
	<li>Centrifugar la columna en 14.000 x g durante 10 minutos</li>
	<li>Eliminar la solución paso.</li>
	<li>Transferencia de la etiqueta muestra de ADN que queda en la parte inferior de la columna a un tubo de centrífuga nueva.</li>
	<li>Medir el volumen de la muestra de ADN marcada con una pipeta y llevar el volumen final a 80 μl con 1 x buffer TE.</li>
	<li>Medir la concentración de la muestra marcada de ADN utilizando un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Mezclar una cantidad igual de etiquetado de la muestra de ADN y ADN de referencia y el volumen final 160 μl con 1 x buffer TE.</li>
	<li>256 añadir μl de 2 x de tampón de hibridación, 50 μl de ADN Cot-1 humano y 50 μl del agente bloqueador de la aCGH × 10 (véase Tabla de materiales) y mezclar bien mediante pipeteo para tres veces.</li>
	<li>Girar los tubos brevemente y ponerlos en un termociclador a incubar a 98 ° C por 10 min.</li>
	<li>Incubar los tubos a 37 ° C por 20 min.</li>
</ol> 4. Hibridación, lavado y análisis de las matrices de genoma <ol><li>caliente previamente el horno de hibridación a 67 ° C por lo menos 4 h antes del comienzo del hibridación.</li>
	<li>Colocar una diapositiva de la Junta sobre la base de una cámara de hibridación.</li>
	<li>Carga 490 μl de solución de hibridación de paso 3.23 en la diapositiva de la Junta de.</li>
	<li>Cubrir el portaobjetos de la junta con un chip de microarray de genoma de Medicago truncatula para formar una cámara de hibridación.</li>
	<li>Poner en las tapas de cámara de hibridación y apriete la cámara firmemente con las abrazaderas de.</li>
	<li>Poner la cámara de hibridación montado en el horno de hibridación e incubar a 67 ° C por 40-48 h.</li>
	<li>Prepare tres diapositivas lavar platos: dos con 250 mL de tampón de lavado guardar a temperatura ambiente, y uno con lavado Tampón II mantuvo a 37 ° C.</li>
	<li>Diapositiva de preparar dos frascos de lavado: uno con 70 mL acetonitrilo y una solución de secado y estabilización de 70 mL, guardar en una campana de humos a temperatura ambiente (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Sacar la cámara de hibridación del horno y quite las abrazaderas de cámara y cubierta.</li>
	<li>Mover el chip de microarray y el empaque deslizar a un plato de lavado de portaobjetos con tampón de lavado I y separan la viruta de la diapositiva de cubierta.</li>
	<li>Mover el microarray de la viruta para el segundo lavado diapositiva plato de tampón de lavado y circular suavemente la solución con una barra de agitación en una placa de agitación magnética a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Transferencia del microarray de la viruta a la tercera diapositiva lavado plato con tampón de lavado precalentado II y lávelo suavemente con una barra de agitación en una placa de agitación magnética a 37 ° C durante 1 minuto</li>
	<li>El chip de microarray de transferencia a una diapositiva lavado frasco con acetonitrilo en una campana de humos y lavar por 30 s.</li>
	<li>El chip de microarray de transferencia a una diapositiva lavado frasco con estabilización y secado solución y lavar por 30 s.</li>
	<li>Saque el chip poco a poco y secar durante 1 minuto</li>
	<li>Escanear el chip de microarray utilizando un escáner (véase Tabla de materiales) menores de 2 μm de resolución. Establecer los parámetros para guardar varias imágenes y deslice todo análisis. Establece canales 1 y 2 ganancias al 100% y cancelar el auto aumento.</li>
</ol> 5. Análisis de datos de CGH <ol><li>Extracto de la fluorescencia Cy3 y Cy5 intensidades para cada sondeo en la matriz utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Análisis de segmentación de uso del software para detectar variaciones de número de copia (CNVs) entre la muestra de ADN y ADN de referencia. Usar un umbral de segmento medio Registro 2 referencia muestra relación ± 2.5 desviaciones del estándar para la determinación de CNVs.</li>
	<li>Inspeccionar la distribución de los ratios de referencia muestra 2 registro a través de todo el genoma, mediante un software de mapeo de señal (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>

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<li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li>
<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Hemos desarrollado una plataforma CGH en arreglos de discos para la detección y caracterización de bombardeo del neutrón rápido (FNB)-inducida por mutantes de M. truncatula CV Jemalong A17. Para demostrar el uso de la matriz método CGH en la detección de mutaciones en el gen, se realizó análisis de aCGH del mutante FN6191, que exhibieron un fenotipo hiper-nodulación en contraste con las plantas de tipo silvestre, cuando se inoculó con S. meliloti Sm1021. Para el análisis de segmentación, un segmento se ...

Leguminosas (Fabaceae) son la tercera familia de plantas con flores, con muchas especies económicamente importantes como la soja (Glycine max) y alfalfa (Medicago sativa). Las plantas leguminosas pueden interactuar con bacterias del suelo fijadoras de nitrógeno, generalmente llamado Rhizobium para desarrollar nódulos de la raíz en que dinitrogen atmosférico es reducido a amoníaco para uso por la planta huésped. Como tal, cultivos de leguminosas requiere pocas aportaciones de fertilizantes nitrogenados y así contribuyen a la agricultura sostenible. Cultivos de leguminosas producen hojas y las semillas con alto contenido de proteína, que sirve como excelente forraje y cereales. Sin embargo, especies de leguminosas cultivadas generalmente tienen estructuras de genoma complejo, haciendo estudios funcionales de genes que desempeñan un papel clave en procesos específicos de leguminosas engorrosos. Medicago truncatula ha sido adoptado ampliamente como una especie de modelo para estudios de leguminosas principalmente porque (1) tiene un genoma diploide con un tamaño de genoma haploide relativamente pequeña (~ 550 Mbp); (2) las plantas pueden transformar estable para estudios funcionales del gene; y (3) se está estrechamente relacionado con alfalfa (M. sativa), la reina de las forrajeras y muchos otros cultivos económicamente importantes para los estudios traslacionales. Recientemente, la secuenciación del genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 ha sido lanzado1,2. Anotación del genoma muestra que hay más de 50.000 genes predichos o modelos de gene en el genoma. Para determinar la función de la mayoría de los genes en M. truncatula genoma es una tarea difícil. Para facilitar los estudios funcionales de genes, se ha generado una amplia colección de mutantes en la gama de más de 150.000 líneas de1 M utilizando mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrón rápido, un mutágeno de ionización de alta energía, se ha utilizado en la generación de mutantes en muchas especies de plantas como Arabidopsis5,6,7de arroz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, cebada (Hordeum vulgare) y Lotus japonicus10. Una gran parte de las mutaciones derivadas de mutagénesis FNB son debido a supresiones de ADN varían en tamaño desde unos pocos pares de bases a mega pares9,11. Muchos genes fenotipo asociado han sido correctamente identificados y caracterizados de4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, reproducción molecular de los genes subyacentes de mutantes FNB dependía de un enfoque basado en el mapa, que es lento y limita el número de mutantes caracterizados a nivel molecular. Recientemente, varios enfoques gratuito incluyendo métodos basados en la transcripción, genoma alicatados hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos para la detección de variación número de copia de ADN y la secuenciación del genoma entero, ha sido empleado para facilitar la caracterización de mutantes de deleción en diversos organismos, incluyendo animales y plantas20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Para facilitar la caracterización de mutantes de la FNB en M. truncatula, un genoma completo basado en el arreglo hibridación genomic comparativo (CGH) plataforma ha sido desarrollada y validado. Como se informó en los sistemas animales, el array-CGH plataforma permite la detección de variaciones de número de copia (CNVs) en el nivel de todo el genoma en mutantes de M. truncatula FNB. Además, las lesiones se pueden confirmar por PCR y fronteras de eliminación pueden ser identificadas por la secuencia. En general, la plataforma CGH array es una herramienta eficiente y eficaz en la identificación de lesiones en mutantes de M. truncatula FNB. Aquí, se ilustran el procedimiento CGH array y PCR caracterización de las fronteras de la canceladura en un mutante de M. truncatula FNB.
El siguiente protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma de número de copia variaciones en las plantas. Por ejemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante se utilizó para identificar regiones de eliminación y genes candidatos asociados con fenotipos mutantes. Mutante de M. truncatula FN6191, aislado originalmente de un neutrón rápido supresión inducida por el bombardeo mutante colección32 (véase Tabla de materiales), exhibió un fenotipo hiper-nodulación después de la inoculación con el suelo bacteria, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , en contraste con las plantas de tipo silvestre.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula matriz genómica, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutante)</td><td>Internamente</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (referencia)</td><td>Planta interna</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag Kit de etiquetado de ADN</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación aleatoria</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Solución de estabilización y secado</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit de hibridación</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de junta de cámara de hibridación</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Tampón de lavado 1 y 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hibridación, inoxidable</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de purificación</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Escáner láser</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Mapa de señales de Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>1.9</td> Mapa de señales <td>de Roche Nimblegen1.9</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de medicago truncatula

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutantes son recursos genéticos inestimable para estudios de la función génica. Para generar colecciones mutantes, pueden utilizarse tres tipos de mutágenos, incluyendo biológicos como el T-ADN o transposon, químicas como Metanosulfonato de etilo (EMS) o físicos como la radiación de ionización. El tipo de mutación observada varía dependiendo el mutágeno utilizado. Para mutantes inducidos por la radiación de ionización, mutaciones incluyen la deleción, duplicación o cambio. Mientras que el T-DNA o la mutagénesis de transposon se limita a especies que son susceptibles de transformación, mutagénesis química o física puede aplicarse a una amplia gama de especies. Sin embargo, la caracterización de las mutaciones derivadas de mutagénesis química o física tradicionalmente se basa en un enfoque clonación basada en mapas, que es el trabajo intensivo y consume mucho tiempo. Aquí, mostramos que una plataforma de Hibridación Genómica Comparativa (aCGH, en inglés) en arreglos de discos de alta densidad del genoma puede ser aplicada para eficientemente detectar y caracterizar variaciones número de copia (CNVs) en mutantes derivados de mutagénesis de bombardeo (FNB) neutrón rápido en Medicago truncatula, una especie de leguminosa. Análisis de la secuencia de genoma muestra que hay más de 50.000 genes o genes modelos en M. truncatula. En el presente, inducida por la FNB mutantes de M. truncatula se derivan más de 150.000 líneas de M1, que representan recursos genéticos inestimable para estudios funcionales de los genes en el genoma. La plataforma de la aCGH, en inglés que se describe aquí es una eficaz herramienta para la caracterización de mutantes de FNB-inducida en M. truncatula.

La figura 2 muestra la distribución de los ratios de2 registro normalizado de mutante versus peso señales a través de todo el genoma. Análisis de datos CGH reveló un aproximado 22 kb canceladura en el cromosoma 4 que abarca el entero SUNN gen33 y varios otros anotados genes en mutante FN6191 (figura 2, figura 3). La región suprimida del candidato fue cubier...

Este protocolo proporciona información acerca de reactivos, equipos y herramientas de análisis y medidas experimentales para los investigadores que están interesados en llevar a cabo análisis de hibridación genomic comparativo (CGH) en arreglos de discos de todo el genoma variaciones número de copia de plantas.

Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

El objetivo general de este protocolo de hibridación genómica comparativa basado en matrices es identificar rápidamente las variaciones en el número de copias en mutantes inducidos por bombardeo rápido de neutrones de la planta leguminosa Medicago truncatula. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biología de las leguminosas. Tales como, facilitar la identificación de empatógenos en sitio bajo involucrados en la regulación del desarrollo de nódulos en leguminosas.La principal ventaja de esta técnica es que es de la más alta reputación y sensibilidad en la detección de variaciones en el número de copias, como mutaciones de deleción en los mutantes de bombardeo de neutrones de la planta leguminosa Medicago truncatula. Haremos una demostración de este procedimiento yo y Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows del Laboratorio Genético. Congele rápidamente un gramo de tejido de hojas jóvenes recolectado de plantas individuales en nitrógeno líquido.Luego, use un mortero y muela el tejido de la hoja congelado hasta convertirlo en polvo fino dentro del nitrógeno líquido. Extraiga las muestras de ADN genómico de tipo salvaje y mutante del polvo fino utilizando un kit de aislamiento de ADN. Utilice tubos de centrífuga de 500 microlitros para diluir un microgramo de cada tipo salvaje y ADN genómico mutante con agua destilada doble hasta un volumen final de 20 microlitros.Luego, agregue cinco microlitros de cebador aleatorio a los tubos de centrífuga. Agite rápidamente los tubos y, después de un giro rápido, colóquelos en un termociclador durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras de ADN a 98 grados centígrados. Después de 10 minutos, retire los tubos del termociclador y colóquelos instantáneamente en agua helada durante cinco minutos.A continuación, prepare dos mezclas de etiquetado y añada 25 microlitros de mezcla de etiquetado como uno y dos a los tubos de ADN de tipo salvaje y mutante, respectivamente. Pipetea el ADN y la mezcla de etiquetado tres veces, y luego gira brevemente los tubos. Después de girar, incube los tubos en el termociclador a 37 grados centígrados durante dos horas, y luego a 65 grados centígrados durante 20 minutos para inactivar la enzima exo Klenow.A continuación, añade 430 microlitros de One X TE Buffer y mezcla el contenido de cada tubo. A continuación, gire brevemente los tubos y transfiera la solución en los tubos a las columnas de purificación con dos tubos de recolección de mililitros. Centrifugar las columnas de purificación a 14.000 veces G durante 10 minutos y desechar el flujo.Agregue 480 microlitros de un tampón X TE a cada columna y nuevamente centrifugue a 14,000 veces G durante 10 minutos. Deseche el flujo a través. Transfiera cada uno de los ADN marcados con el tipo salvaje y el mutante desde la parte inferior de la columna a nuevos tubos de centrífuga.Después de medir el volumen de cada uno de los ADN marcados con la pipeta, ajuste el volumen final a 80 microlitros con One X TE Buffer, luego mida la concentración de los ADN marcados en un espectrofotómetro. A continuación, mezcle volúmenes equivalentes de ADN mutante y de tipo salvaje para hibridar sondas en un chip de micromatriz para la hibridación comparativa. Lleva el volumen final a 160 microlitros con One X TE Buffer.A continuación, prepare la solución de hibridación y pipetela tres veces para mezclar bien tres agentes con ADN mezclado. Después de girar brevemente los tubos, incubarlos en un termociclador a 98 grados centígrados durante 10 minutos y a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Recuerde ajustar la temperatura a 67 grados centígrados para precalentar el horno de hibridación cuatro horas antes de la hibridación.Luego, coloque una corredera de junta en la base de la cámara de hibridación y cargue 490 microlitros de la solución de hibridación sobre ella después de 20 minutos de incubación a 37 grados Celsius en el termociclador. Para formar la cámara de hibridación, cubra la corredera de la junta con el chip de micromatriz del genoma Medicago truncatula, luego cubra la cámara de hibridación y apriétela firmemente con las abrazaderas. Incubar la cámara de hibridación ensamblada en el horno de hibridación a 67 grados centígrados durante 40 a 48 horas.Mientras tanto, prepare dos platos de lavado deslizantes con 250 mililitros de Washing Buffer One mantenidos a temperatura ambiente. Luego, haga un plato de lavado deslizante con el tampón de lavado dos mantenido a 37 grados centígrados. Luego, prepare un frasco de lavado de portaobjetos con 70 mililitros de acetonitrilo y otro frasco de lavado de portaobjetos con 70 mililitros de solución de estabilización y extracción.Coloque ambos frascos de lavado deslizantes en una campana extractora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire la cámara de hibridación del horno de hibridación y afloje las abrazaderas de la cámara para abrir la tapa. Luego, retire el chip de micro matriz en la corredera de la junta y colóquelos en el plato de lavado de la corredera con Wash Buffer One.Aísle el chip de micromatriz de la corredera de la cubierta. A continuación, transfiera el chip de micromatriz al segundo plato de lavado deslizante con Wash Buffer One. Con una barra de agitación, revuelva suavemente la solución en una placa de agitación magnética a temperatura ambiente durante cinco minutos.Coloque el chip de micromatriz en el plato de lavado deslizante con tampón de lavado dos precalentado, luego revuelva con la barra de agitación para lavar la solución a 37 grados centígrados durante un minuto. Retire el chip de micromatriz y colóquelo en el frasco de lavado que contiene acetonitrilo en una campana extractora para lavar durante 30 segundos. Transfiera el chip de micro matriz al frasco de lavado de portaobjetos con solución de estabilización y secado y vuelva a lavar durante 30 segundos.Retire con cuidado la viruta y séquela durante un minuto dentro de la campana extractora. Escanee el chip de micromatriz con un escáner con dos resoluciones micrométricas. Se utilizó un software de mapeo de señales como interfaz para analizar la distribución de las proporciones normalizadas de log dos de señales mutantes frente a las de tipo salvaje en ocho cromosomas.Para las supresiones putativas, se considera el valor de la relación logarítmica dos igual o menor que menos dos punto cinco, desviación estándar. El análisis de segmentación del software muestra una región de deleción estimada de 22 kilobases en el cromosoma cuatro que se muestra en el gráfico. El análisis de los bordes de deleción flanqueados por las sondas de micro arrays muestra una relación logarítmica dos normalizada reducida.El gráfico también muestra otros seis genes anotados, incluido el gen hijo, que abarca la región eliminada. El gen Son es el responsable de controlar la nodulación en Metecago truncatula. A continuación, la amplificación de PCR realizada para confirmar los bordes de deleción muestra un producto de un punto cinco kilobases amplificado a partir del mutante FN6191, pero no en el tipo salvaje.La secuenciación del ADN se realizó para mostrar la unión de deleción en el mutante FN6191 que se muestra en la flecha negra. También se realizó una secuenciación que confirmó la ubicación de los bordes de deleción. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 72 horas si se realiza correctamente.Para obtener datos de alta calidad, recuerde mantener baja la concentración de ozono en la habitación donde se realiza el procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras medidas, como las reacciones en cadena de la polimerasa de toda la secuenciación del genoma, para responder a preguntas adicionales como el tamaño y las variaciones del número de copias en el genoma. El evento y la validación de esta técnica han allanado el camino para que los investigadores exploren la variación del número de copias que inducen a los mutantes y las variantes naturales en especies de plantas que no son susceptibles a la mutagénesis insercional, como Garden P. No olvide que trabajar con acetonitrilo, estabilización y solución de secado puede ser extremadamente peligroso.Las precauciones, como el uso de protección ocular, evitar el contacto directo con los agentes y trabajar con cuidado son absolutamente esenciales.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal

Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

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