Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

El objetivo general de este protocolo de hibridación genómica comparativa basado en matrices es identificar rápidamente las variaciones en el número de copias en mutantes inducidos por bombardeo rápido de neutrones de la planta leguminosa Medicago truncatula. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biología de las leguminosas. Tales como, facilitar la identificación de empatógenos en sitio bajo involucrados en la regulación del desarrollo de nódulos en leguminosas.

La principal ventaja de esta técnica es que es de la más alta reputación y sensibilidad en la detección de variaciones en el número de copias, como mutaciones de deleción en los mutantes de bombardeo de neutrones de la planta leguminosa Medicago truncatula. Haremos una demostración de este procedimiento yo y Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows del Laboratorio Genético. Congele rápidamente un gramo de tejido de hojas jóvenes recolectado de plantas individuales en nitrógeno líquido.

Luego, use un mortero y muela el tejido de la hoja congelado hasta convertirlo en polvo fino dentro del nitrógeno líquido. Extraiga las muestras de ADN genómico de tipo salvaje y mutante del polvo fino utilizando un kit de aislamiento de ADN. Utilice tubos de centrífuga de 500 microlitros para diluir un microgramo de cada tipo salvaje y ADN genómico mutante con agua destilada doble hasta un volumen final de 20 microlitros.

Luego, agregue cinco microlitros de cebador aleatorio a los tubos de centrífuga. Agite rápidamente los tubos y, después de un giro rápido, colóquelos en un termociclador durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras de ADN a 98 grados centígrados. Después de 10 minutos, retire los tubos del termociclador y colóquelos instantáneamente en agua helada durante cinco minutos.

A continuación, prepare dos mezclas de etiquetado y añada 25 microlitros de mezcla de etiquetado como uno y dos a los tubos de ADN de tipo salvaje y mutante, respectivamente. Pipetea el ADN y la mezcla de etiquetado tres veces, y luego gira brevemente los tubos. Después de girar, incube los tubos en el termociclador a 37 grados centígrados durante dos horas, y luego a 65 grados centígrados durante 20 minutos para inactivar la enzima exo Klenow.

A continuación, añade 430 microlitros de One X TE Buffer y mezcla el contenido de cada tubo. A continuación, gire brevemente los tubos y transfiera la solución en los tubos a las columnas de purificación con dos tubos de recolección de mililitros. Centrifugar las columnas de purificación a 14.000 veces G durante 10 minutos y desechar el flujo.

Agregue 480 microlitros de un tampón X TE a cada columna y nuevamente centrifugue a 14,000 veces G durante 10 minutos. Deseche el flujo a través. Transfiera cada uno de los ADN marcados con el tipo salvaje y el mutante desde la parte inferior de la columna a nuevos tubos de centrífuga.

Después de medir el volumen de cada uno de los ADN marcados con la pipeta, ajuste el volumen final a 80 microlitros con One X TE Buffer, luego mida la concentración de los ADN marcados en un espectrofotómetro. A continuación, mezcle volúmenes equivalentes de ADN mutante y de tipo salvaje para hibridar sondas en un chip de micromatriz para la hibridación comparativa. Lleva el volumen final a 160 microlitros con One X TE Buffer.

A continuación, prepare la solución de hibridación y pipetela tres veces para mezclar bien tres agentes con ADN mezclado. Después de girar brevemente los tubos, incubarlos en un termociclador a 98 grados centígrados durante 10 minutos y a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Recuerde ajustar la temperatura a 67 grados centígrados para precalentar el horno de hibridación cuatro horas antes de la hibridación.

Luego, coloque una corredera de junta en la base de la cámara de hibridación y cargue 490 microlitros de la solución de hibridación sobre ella después de 20 minutos de incubación a 37 grados Celsius en el termociclador. Para formar la cámara de hibridación, cubra la corredera de la junta con el chip de micromatriz del genoma Medicago truncatula, luego cubra la cámara de hibridación y apriétela firmemente con las abrazaderas. Incubar la cámara de hibridación ensamblada en el horno de hibridación a 67 grados centígrados durante 40 a 48 horas.

Mientras tanto, prepare dos platos de lavado deslizantes con 250 mililitros de Washing Buffer One mantenidos a temperatura ambiente. Luego, haga un plato de lavado deslizante con el tampón de lavado dos mantenido a 37 grados centígrados. Luego, prepare un frasco de lavado de portaobjetos con 70 mililitros de acetonitrilo y otro frasco de lavado de portaobjetos con 70 mililitros de solución de estabilización y extracción.

Coloque ambos frascos de lavado deslizantes en una campana extractora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire la cámara de hibridación del horno de hibridación y afloje las abrazaderas de la cámara para abrir la tapa. Luego, retire el chip de micro matriz en la corredera de la junta y colóquelos en el plato de lavado de la corredera con Wash Buffer One.

Aísle el chip de micromatriz de la corredera de la cubierta. A continuación, transfiera el chip de micromatriz al segundo plato de lavado deslizante con Wash Buffer One. Con una barra de agitación, revuelva suavemente la solución en una placa de agitación magnética a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Coloque el chip de micromatriz en el plato de lavado deslizante con tampón de lavado dos precalentado, luego revuelva con la barra de agitación para lavar la solución a 37 grados centígrados durante un minuto. Retire el chip de micromatriz y colóquelo en el frasco de lavado que contiene acetonitrilo en una campana extractora para lavar durante 30 segundos. Transfiera el chip de micro matriz al frasco de lavado de portaobjetos con solución de estabilización y secado y vuelva a lavar durante 30 segundos.

Retire con cuidado la viruta y séquela durante un minuto dentro de la campana extractora. Escanee el chip de micromatriz con un escáner con dos resoluciones micrométricas. Se utilizó un software de mapeo de señales como interfaz para analizar la distribución de las proporciones normalizadas de log dos de señales mutantes frente a las de tipo salvaje en ocho cromosomas.

Para las supresiones putativas, se considera el valor de la relación logarítmica dos igual o menor que menos dos punto cinco, desviación estándar. El análisis de segmentación del software muestra una región de deleción estimada de 22 kilobases en el cromosoma cuatro que se muestra en el gráfico. El análisis de los bordes de deleción flanqueados por las sondas de micro arrays muestra una relación logarítmica dos normalizada reducida.

El gráfico también muestra otros seis genes anotados, incluido el gen hijo, que abarca la región eliminada. El gen Son es el responsable de controlar la nodulación en Metecago truncatula. A continuación, la amplificación de PCR realizada para confirmar los bordes de deleción muestra un producto de un punto cinco kilobases amplificado a partir del mutante FN6191, pero no en el tipo salvaje.

La secuenciación del ADN se realizó para mostrar la unión de deleción en el mutante FN6191 que se muestra en la flecha negra. También se realizó una secuenciación que confirmó la ubicación de los bordes de deleción. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 72 horas si se realiza correctamente.

Para obtener datos de alta calidad, recuerde mantener baja la concentración de ozono en la habitación donde se realiza el procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras medidas, como las reacciones en cadena de la polimerasa de toda la secuenciación del genoma, para responder a preguntas adicionales como el tamaño y las variaciones del número de copias en el genoma. El evento y la validación de esta técnica han allanado el camino para que los investigadores exploren la variación del número de copias que inducen a los mutantes y las variantes naturales en especies de plantas que no son susceptibles a la mutagénesis insercional, como Garden P. No olvide que trabajar con acetonitrilo, estabilización y solución de secado puede ser extremadamente peligroso.

Las precauciones, como el uso de protección ocular, evitar el contacto directo con los agentes y trabajar con cuidado son absolutamente esenciales.