Demostración de técnicas de hibridación del genoma entero matriz Genómica Comparativa
5 de agosto de 2008
Este video es una demostración técnica del protocolo de hibridación para todo el genoma amplia baldosas CGH camino, que escanea todo el genoma humano utilizando sólo 25 a 100 ng de ADN que se puede aislar de una variedad de fuentes, incluyendo archivos de material fijado en formol.
La siguiente breve presentación es un video que muestra el protocolo de hibridación para el arreglo de sub megabase de 27 K. Este array o smart array está compuesto por 26.946 clones posteriores secuenciados individualmente impresos en una sola diapositiva. Se ven por duplicado para un total de 54.000 elementos por diapositiva impresa en un área de 18 por 54 milímetros.
Los datos resultantes son comparables a los arrays de oligonucleótidos de alta densidad sin necesidad de interpretación de datos por bioinformática. Una de las principales ventajas de utilizar una matriz de inserciones grande, como los clones posteriores, es que permite el uso de tan solo 100 nanogramos de ADN de muestra sin amplificación. Esto permite el análisis de una variedad de muestras, como ADN de sangre congelada, tejido, células clasificadas y material FFPE.
Se ha demostrado que la matriz inteligente es útil en el entorno clínico. En la Agencia del Cáncer de Columbia Británica, el análisis de muestras de múltiples pacientes se adapta fácilmente a una semana laboral promedio. Para citogenética.
La mayoría de los pasos utilizados en la matriz CGH son similares a los CGH convencionales o fish. Permitiendo una rápida introducción del protocolo en los laboratorios establecidos. La calidad del ADN es la mayor influencia en los resultados de las matrices.
La hibridación de CGH, la mala calidad o el ADN contaminado afectarán negativamente a la incorporación de PSI en el producto, lo que dará lugar a imágenes tenues o ruido en los datos. El espectrofotómetro NanoDrop es una excelente herramienta para evaluar la calidad del ADN antes de la hibridación. Para cuantificar el conjunto de ADN, el NanoDrop para medir el ácido nucleico y el modo para medir el ADN 50 en blanco, el NanoDrop con 1,5 microlitros de la misma solución que su muestra resuspendida.
En este caso, se trata de agua Tris. Se ha demostrado que el EDTA tiene efectos negativos potenciales en la incorporación de PS D. Retire la toallita en blanco con una toallita Kim y agregue 1,5 microlitros de su medida de muestra y registre la concentración de su muestra.
La lectura de dos 60 sobre dos 80 en el NanoDrop es un buen indicador de la calidad del ADN, donde una proporción de 1,8 es óptima. El método de doble relación dos 60 sobre dos 80 y dos 60 sobre dos 30 proporciona una manera aún mejor de determinar la pureza de sus muestras. El NanoDrop muestra una curva que representa la absorbancia en relación con la longitud de onda.
Una curva suave sin picos es indicativa de una buena calidad para el ADN y limpie el NanoDrop con agua y una toallita Kim, o si la muestra es limitante, pipetee la muestra del pedestal. Este protocolo está optimizado para entre 100 y 400 nanogramos de muestra. 200 nanogramos es la cantidad objetivo para un ADN de buena calidad Para etiquetar la muestra, se requieren los siguientes reactivos y equipos.
Tampón: SCI, tres SCI, cinco ER aleatorios, 10 veces DNTP, referencia de mezcla, ADN, agua estéril de 0,2 microlitros, tubos de PCR estériles, bloque de calor de hielo a 100 grados Celsius, incubadora a 45 grados Celsius. Configure un tubo de reacción para el ADN de referencia y un tubo de reacción. En el caso de las muestras de ADN, se marcarán con ciencia ficción y SCI tres respectivamente.
En un entorno de investigación, preferimos usar CY tres para nuestra muestra de ADN, ya que es más resistente a la degradación del ozono. Combine el agua de ADN y el tampón del canal en la muestra y repita para el ADN de referencia. En nuestro laboratorio, combinamos el búfer de 10 veces con el Optimus aleatorio.
Para crear una solución de cinco veces, agregue agua estéril hasta un volumen total de 17 microlitros. Transfiera los tubos a un bloque de calor, desnaturalice durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Transfiera inmediatamente a hielo.
Agregue cuatro microlitros de 10 veces la mezcla DNTP. Añade los ojos laterales. Agregue dos microlitros de SCI tres DCTP marcados a la muestra de ADN.
Agregue dos microlitros de DCTP marcado con ciencia ficción para hacer referencia al ADN. Añadimos 2,5 microlitros de canal y mezclamos. La solución puede ser mezclada a mano o en vórtice.
Haga girar brevemente la solución hasta el fondo del tubo con un pulso rápido en una centrífuga de sobremesa. Transfiera a un horno e incube a 37 grados durante la noche. El tiempo de hibridación durante la noche se puede ajustar entre 14 y 24 horas sin afectar negativamente el proceso de etiquetado.
Para adaptarse a un programa de laboratorio utilizando una columna MicroCon YM 30, agregue 100 microlitros de NA 1D capturados a la columna. Tenga cuidado de no tocar la membrana con la punta de una pipeta atrapada. Se sabe que la variación de lote a lote de ADN ocurre incluso cuando se compra a los principales distribuidores.
Se recomienda que se compren y prueben lotes grandes antes de su uso. Ahora habrá dos tubos para cada hibridación de muestra, uno de color azul y otro de color rojo. Combine los tubos para cada muestra y mezcle mediante pipeteo.
A continuación, transfiera toda la solución a la membrana MicroCon. Coloque la columna en el tubo MicroCon suministrado y gírela a 13.000 g durante 10 minutos. La columna MicroCon es una columna de exclusión de tamaño y atrapará el ADN con los tintes laterales incorporados y permitirá que los tintes no incorporados atraviesen la membrana.
Para lavar cualquier nucleótido residual no incorporado o lateral, agregue 200 microlitros de agua destilada estéril a la membrana. Girar de nuevo a 13.000 g durante 10 minutos. Deseche el tubo y agregue 45 microlitros de solución de hibridación en la parte superior de la columna del concentrador MicroCon.
La solución de hibridación que utilizamos es Dig Easy de Roche Scientific, también se pueden agregar a la solución cinco microlitros de esperma de arenque compartido. Tradicionalmente, esto se utilizaba para bloquear la unión no competitiva a la superficie de la corredera. El advenimiento de nuevas sustancias aglutinantes ha permitido la eliminación de este paso.
Sin embargo, a veces se agrega para aumentar la viscosidad de la solución de hibridación. Invierta la columna MicroCon y colóquela en un nuevo tubo etiquetado. Girar el tubo a 3000 G durante tres minutos.
La solución se acumulará en el fondo del nuevo tubo, y se utilizarán 1,5 microlitros de la solución para la cuantificación de la incorporación de SD. Establezca el análisis de microarrays NanoDrop A, en blanco.
El NanoDrop con 1,5 microlitros de excavación. Tampón de fácil hibridación. Mida la pieza en bruto con el NanoDrop.
La lectura debe ser cero. Retire la toallita en blanco con una toallita kim y agregue 1,5 microlitros de su medida de muestra y registre la incorporación de su muestra. El NanoDrop le dará un mol PICA por concentración de microlitro de las muestras de incorporación de S3 y colorantes de ciencia ficción con las incorporaciones a continuación.
Sedebe considerar que tres ole por microlitro tienen muy pocos cuatro flúor Para continuar, el NanoDrop mostrará un gráfico de la absorbancia frente a la longitud de onda. Deben ser visibles dos picos, uno para cada uno de los ojos laterales y limpiar el NanoDrop con agua y una toallita kim. Coloque la cubierta deslizante en un calentador deslizante o bloque de calor precalentado a 45 grados centígrados para mantener la temperatura de hibridación.
Coloque 42 microlitros de solución de sonda en el cubreobjetos de 22 milímetros por 60 milímetros. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución. Un truco rápido para eliminar una burbuja rebelde es tomar un cubrebocas nuevo y reventar la burbuja con una esquina afilada.
Alinee el portaobjetos sobre el cubreobjetos y la solución de la sonda. Baje un borde del portaobjetos, permitiendo el contacto con la solución de hibridación. Continúe bajando un borde hasta que el cubreobjetos se adhiera a la corredera con tensión superficial.
Invierta la diapositiva. Coloque el portaobjetos en un casete de hibridación, precaliente a 45 grados centígrados y agregue 10 microlitros de agua en la ranura inferior para controlar la humedad. Este paso debe practicarse ya que la excavación fácil cristaliza a temperaturas más bajas y dejará fondo en el portaobjetos.
Esto es especialmente importante cuando la solución está en el portaobjetos, ya que es una capa muy delgada de líquido. En este punto, selle el casete e incube durante 36 a 40 horas a 45 grados centígrados. La extracción de la corredera del casete de hibridación es fundamental.
Cavar, cristaliza fácilmente a temperatura ambiente. El portaobjetos debe sumergirse inmediatamente y el cubreobjetos debe retirarse en la solución de lavado. Todas las soluciones de lavado deben estar prefabricadas y tener un pH de siete pH no neutro que puede degradar los ojos laterales.
Precaliente la solución de lavado a 45 grados centígrados. Agregue aproximadamente 60 mililitros de la solución de lavado a un frasco Copeland antes de abrir la cámara de hibridación. Abra la cámara.
Retire el portaobjetos con unas pinzas y agréguelo a la solución de lavado. Con el cubreobjetos aún colocado, espere de 10 a 20 segundos y recoja el cubreobjetos con unas pinzas. Debería haberse caído del tobogán.
Este es un paso importante, ya que impide que el tampón fácil de excavación cristalice y reduce cualquier posible rayado de la corredera mediante la eliminación mecánica del cubreobjetos. Lave el portaobjetos tres veces en solución de lavado. Un minuto cada uno con agitación.
Enjuague el portaobjetos tres veces. No debe haber burbujas residuales de la FDS en la solución de lavado visibles después del último lavado. Deje el portaobjetos en la solución de lavado hasta que esté listo para centrifugar.
Centrífuga En un tubo Falcon de 50 mililitros a 700 G durante un minuto. Asegúrese de que el tubo Falcon esté seco antes de usarlo. Escanee inmediatamente la diapositiva, ya que las intensidades de la señal disminuirán con el tiempo.
Dependiendo de los niveles de ozono ambiental, cada escáner es diferente, pero hay algunas pautas comunes a seguir. Para imágenes de diapositivas. Los niveles de ozono ambiental son críticos durante el proceso de escaneo.
El troquel de ciencia ficción es sensible al ozono y se degradará rápidamente durante un largo tiempo de escaneo. Se ha demostrado que cinco partes por mil millones de ozono afectan a S cinco. Esto equivale a la contaminación ligera del tráfico en un día despejado.
Se recomiendan medidores de ozono para registrar los niveles de ozono ambiental. Se crea una imagen separada para cada canal S3 y SCI cinco. Los canales se pueden equilibrar alterando la exposición, el tiempo, la excitación, la entrada o la sensibilidad de captura del escáner.
Estas imágenes ya están listas para el análisis.
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Visión general
Este video demuestra el protocolo de hibridación para una matriz de ruta de baldosas de todo el genoma CGH, permitiendo el escaneo de todo el genoma humano con una entrada de ADN mínima. El método permite el análisis de varios tipos de muestras, incluyendo materiales de archivo.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Análisis de ADN
- Técnicas de hibridación
Antecedentes
- La matriz consta de 26,946 clones de respaldo secuenciados individualmente.
- Cada diapositiva contiene un total de 54,000 elementos.
- Los datos obtenidos son comparables a los de las matrices de oligos de alta densidad.
- La interpretación bioinformática no es necesaria para el análisis de datos.
Propósito del estudio
- Demostrar un protocolo de hibridación para el escaneo del genoma.
- Utilizar muestras de ADN mínimas para un análisis genómico integral.
- Facilitar el uso de diversos tipos de muestras en estudios genómicos.
Métodos utilizados
- Protocolo de hibridación para matriz de ruta de baldosas de todo el genoma CGH.
- Uso de 25-100 ng de ADN de varias fuentes.
- Aplicación de clones de respaldo aplicados en duplicado en diapositivas.
- Análisis de muestras sin amplificación.
Principales resultados
- Escaneo exitoso del genoma humano con baja entrada de ADN.
- Capacidad para analizar ADN de sangre, tejido congelado y material FFPE.
- Calidad de datos comparable a matrices de mayor densidad.
- Análisis facilitado sin requisitos extensos de bioinformática.
Conclusiones
- El protocolo de hibridación es efectivo para el análisis de todo el genoma.
- Requisitos mínimos de ADN amplían el alcance de los tipos de muestras.
- Este método mejora la accesibilidad para la investigación genómica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
