Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

El objetivo general de este procedimiento es aislar el ARN con alta integridad del páncreas de ratón de la cresta de la ribonucleasa. Esto se logra mediante la extracción rápida del páncreas de la carcasa de un ratón sacrificado. A continuación, el páncreas se sumerge en el reactivo de lisis y el tejido se homogeneiza.

Después de la centrifugación, el ARN se aísla del sobrenadante utilizando protocolos estándar y se agrega una solución inhibidora de ARN a la solución final de ARN. El paso final es limpiar cuidadosamente las cuchillas del homogeneizador eliminando los trozos de tejido atrapados en las cuchillas y luego realizar una serie de lavados con etanol y agua. En última instancia, este procedimiento permite el aislamiento de ARN para el páncreas de ratón con un número de integridad de ARN superior a siete para su uso en el análisis rutinario de la expresión génica.

Mi nombre es Tom Schmid y he estado trabajando con ARN durante más de 20 años, y en todo este tiempo, no he experimentado nada tan difícil como aislar ARN con alta integridad para el páncreas de ratón. La técnica que vamos a mostrar ha sido desarrollada para el páncreas de ratón, pero realmente no hay ninguna razón por la que no se pueda usar para una variedad de otros tejidos, incluidos los tejidos de células humanas, líneas celulares u otros tejidos de ratón, incluidos los tejidos ricos en nucleasas de las costillas, como el bazo. El uso de las sugerencias de este protocolo le permitirá aislar el ARN con alta integridad del páncreas de ratón.

Eso podría usarse para muchas aplicaciones posteriores, como QPCR, matrices de expresión génica o RNA-Seq. Ola Elgamal. Un estudiante de posgrado de último año en mi laboratorio demostrará esta técnica después de sacrificar al ratón como se describe en el protocolo de texto.

Asegure el cadáver perforando cada una de las cuatro patas del animal en una superficie plana con agujas hipodérmicas de calibre 25 con instrumentos quirúrgicos estériles. Corta la sección media del ratón y retira rápidamente el páncreas del ratón. Use las pinzas para sostener el páncreas y córtelo del bazo y el intestino delgado con unas tijeras de resorte.

Tenga cuidado de no estirar el páncreas durante la extracción del ratón. La alteración del tejido podría liberar ribonucleasa. Coloque todo el páncreas en un tubo de 50 centímetros cúbicos que contenga ocho mililitros de reactivo de lisis helado.

Tape el tubo y agite brevemente para sumergir el tejido en el reactivo e inmediatamente proceda al siguiente paso sin demora. A continuación, homogeneice el páncreas durante cinco segundos. Es importante presionar las cuchillas del homogeneizador contra la parte inferior del tubo de centrífuga para permitir que el tejido se introduzca en las cuchillas para una homogeneización eficiente.

Para eliminar el tejido no digerido, transfiera dos mililitros de reactivo de lisis que contiene el páncreas lisado a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Recoja dos tubos de microcentrífuga de homogeneizado por centrífuga de aislamiento a cuatro grados Celsius, 12, 000 veces G durante cinco minutos para granular el tejido no digerido. Este es un paso crítico, ya que el arrastre de tejido no digerido a soluciones posteriores de ARN probablemente contaminará la muestra con ribonucleasa.

Limpie las cuchillas del homogeneizador colocándolas en 10 mililitros de etanol al 70%. Active el homogeneizador durante unos 20 segundos para eliminar cualquier trozo de tejido que pueda quedar atrapado en las cuchillas. A continuación, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para eliminar las piezas que queden en las cuchillas del homogeneizador.

Limpie de nuevo las cuchillas del homogeneizador con agua, ARN general, activador syn y etanol al 70%. Por último, seque el eje del homogeneizador con una toallita limpia Kim. Transfiera un mililitro del SNA a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Coloque todos los tubos que contienen homogeneizado sobre hielo húmedo mientras continúa con el siguiente paso. Proceda con el aislamiento del ARN inmediatamente y almacene el tubo replicado a menos 80 grados Celsius para su uso futuro. Deseche el reactivo de lisis restante en un recipiente de residuos químicos apropiado.

En la siguiente sección se utiliza un kit de purificación de ARN. La ventaja del kit de purificación es que aislará el ARN total, incluidos los ARN pequeños. Comience el aislamiento añadiendo 200 microlitros de cloroformo a la solución homogeneizada.

Tape el tubo y agite vigorosamente con la mano durante 15 segundos. A continuación, deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante dos o tres minutos después de la centrifugación durante 15 minutos a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga.

Agregue 1,5 volúmenes de isopropanol y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera hasta 700 microlitros de la muestra a una columna de centrifugación que se coloca en un tubo de recolección de dos mililitros. Cierre la tapa y centrifugue a 8.000 veces G durante 15 segundos a temperatura ambiente y luego deseche el flujo.

A continuación, añada 700 microlitros de tampón RWT a la columna de centrifugación y a la centrífuga. Al igual que antes, deseche el flujo a través de la pipeta de 500 microlitros de RPE tampón en la columna de centrifugación y vuelva a centrifugar para lavar la columna. Después de descartar el flujo, agregue otros 500 microlitros de RPE tampón a la centrífuga de columna de centrifugación durante dos minutos a 8, 000 veces G.To seque la columna, transfiera la columna de centrifugación a una pipeta de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros 100 microlitros de agua libre de núcleo de costilla directamente sobre la centrífuga de membrana de columna de espín durante un minuto a las 8, 000 veces G para eluir, el ARN.

A continuación, añada un microlitro de inhibidor de ARN a la solución de ARN y proceda a determinar la integridad del ARN mediante el análisis de electroforesis capilar como se describe en el protocolo de texto, la comparación del número de integridad del ARN o RIN del ARN aislado del páncreas de ratón revela una correlación directa entre el volumen del reactivo de lisis utilizado en la homogeneización y la integridad del ARN. Los resultados indican que se deben utilizar ocho mililitros de reactivo de lisis. En este protocolo, se añadió un inhibidor de la ribonucleasa a la solución acuosa de ARN y se comparó la integridad del ARN tras la congelación. El RIN para la solución de ARN con inhibidor fue de 7,3 más o menos 0,15 en comparación con 2,9 más o menos 0,65 para la solución que no contenía inhibidor para examinar la posibilidad de que la congelación repetida desnaturalice el inhibidor de la ribonucleasa haciéndolo ineficaz.

Se probó una solución de ARN que contenía un inhibidor de la ribonucleasa. Las soluciones de ARN que se congelaron y descongelaron hasta cinco veces aún produjeron un RIN de siete o más. Mientras que las soluciones que se congelaron y descongelaron seis veces o más produjeron un RIN por debajo de siete primos aleatorios, el CDNA se sintetizó a partir del ARN y la expresión de tres genes de mantenimiento se midió mediante QPCR.

Utilizando técnicas estándar, los datos validan el uso exitoso del ARN pancreático de ratón en una técnica estándar de biología molecular. Una vez debidamente entrenados, los estudiantes de posgrado y postdoctorados deberían ser capaces de completar esta técnica en unos 30 minutos. Y solo quiero contarles un poco sobre cómo lo estamos usando.

Estamos estudiando modelos de ratones transgénicos de cáncer de páncreas y estamos utilizando esta técnica para aislar el ARN. Y luego, cuando obtengamos el ARN, estudiaremos la expresión génica del micro ARN en estos animales.