Páncreas murino aislamiento Islet

Hola, soy Greg Zott. Estoy en el Centro de Diabetes de la UCSF en el Laboratorio Bluestone, y hoy les voy a mostrar el proceso para aislar los ojales de los ratones. El procedimiento consiste en la inyección de una solución de colagenasa en el páncreas de un ratón donante C3 H, donde luego extraeremos ese páncreas, lo digeriremos, purificaremos los ojales en un gradiente fial y luego los seleccionaremos a mano para su trasplante final en la cápsula de riñón de un ratón NOD diabético, que será nuestro receptor.

Antes de comenzar este procedimiento, diluimos nuestra solución de ATE en un tampón Hanks modificado y hemos ajustado la concentración específica para la cepa de ratón que estamos usando el C3 H. Encontramos que se digiere mejor con una solución de colagenasa de 0,8 mg por mil, y la usaremos para inyectar en el conducto biliar común para distender el páncreas. Realizar. El procedimiento de hoy será Pavo codre del centro de diabetes. Inyectará, abrirá el ratón, expondrá los intestinos y luego inyectará en el conducto biliar común.

Rociaremos el ratón con etanol para mantener el pelo suelto, y luego también verificaremos que el ratón se ha sacrificado correctamente con un pellizco en el dedo del pie. Pavo ahora abrirá el ratón y expondrá el intestino y el páncreas con una incisión en la línea media. También se cortará el diafragma para verificar que se sacrificará el ratón.

Antes de comenzar, me gustaría señalar algunas de las estructuras importantes. El estómago está acostado aquí con el páncreas conectado por debajo en el duodeno y por encima. Este es el hígado donde encontraremos la vesícula biliar y el conducto biliar común, que puedes ver aquí.

Entonces, lo que Pavo hará a continuación es aislar el intestino delgado, encontrar dónde entra el conducto biliar común al intestino delgado. Una vez que el intestino está expuesto, pinzamos a ambos lados del conducto biliar común con pinzas para mosquitos. Descubrimos que esto permite que más colágenos ingresen al páncreas, mientras que otros grupos intentan dirigir la pinza sobre el conducto biliar común.

Encontramos que esta es una mejor técnica para permitir que la enzima ingrese al páncreas. Este es un procedimiento suave. No querrás desgarrar el intestino.

Debes dejar que las pinzas se coloquen suavemente a ambos lados del conducto biliar común. Ahora encontraremos una vesícula biliar, y una vez que la vesícula biliar esté expuesta, la usaremos como guía para inyectar la colagenasa en el conducto biliar común. Powell utiliza una aguja de calibre 30 con una jeringa de cinco cc que contiene tres molinos de solución de colagenasa.

A medida que ingresa al conducto biliar común, distiende ese conducto con una solución de colagenasa y luego viaja por el conducto biliar común hasta que llega cerca del intestino. Y a medida que va cayendo, las soluciones enzimáticas que se bombean al páncreas. Ahora que el páncreas está inflado con una solución de colagenasa, Powell va a quitar los hemostáticos y luego va a quitar el páncreas del ratón arrancándolo cuidadosamente del intestino.

Lo saca del estómago. Bien, y luego, usando el bazo como mango, levanta el páncreas y luego lo corta lentamente en el conducto biliar común, y eso es todo. Se coloca el páncreas y luego se extirpa el bazo, y allí se extrae el tejido meso entérico, y luego el páncreas se coloca en una solución de colagenasa de dos molinos y un frasco de vidrio esterilizado y se vuelve a colocar en hielo.

El páncreas aislado que colocamos en los viales de vidrio ahora se colocará en un baño de agua a 37 grados durante aproximadamente 17 minutos. Los colocamos en una rejilla cónica de 50 milésimas de pulgada para que no floten. Una vez durante el baño, se pone en marcha el temporizador y comienza la digestión.

Una vez que se completa el tiempo de digestión, se retiran los viales y luego se agitan y se interrumpen suavemente. Y una vez que el tejido comienza a desmoronarse, el vial se coloca en hielo. Se coloca una criba estéril sobre un vaso de precipitados de 400 milésimas de pulgada que contiene tampón de lavado.

A continuación, el digestivo del páncreas se vierte cuidadosamente sobre la pantalla en el tampón de lavado. Para fines de demostración, se ha apagado el capó y se ha levantado el vidrio del capó para que podamos ver lo que estamos haciendo. Una vez que se vierte la digestión del páncreas en el vaso de precipitados, los viales se enjuagan con el mismo tampón de lavado y se coloca el tampón de lavado sobre la pantalla.

Tenemos una jeringa llena de tampón de lavado. Lo usaremos para lavar a la fuerza el pañuelo a través de la pantalla. La idea es liberar los ojales sueltos que no estén adheridos a la matriz, pero dejando las membranas y el tejido sin digerir en la pantalla.

Y cuando termine de lavar un pañuelo, esto es lo que generalmente ve al final del procedimiento. El tejido del páncreas que está en el fondo del tubo ahora se transferirá a dos cónicos de 50 milésimas de pulgada, y el tejido se lavará, el tejido se mezclará uniformemente y luego se distribuirá uniformemente para que tengamos un volumen de gránulos igual en cada tubo. El vaso de precipitados ahora se enjuaga con más tampón de lavado.

Los lados se enjuagan para que vuelva a entrar todo el tejido que se introduce en el vaso de precipitados. Luego se distribuye equitativamente entre cada dos, ambos de 50 mil. A continuación, se rematan con tampón de lavado.

El tejido se invierte varias veces y luego se coloca en una centrífuga. Este es un giro rápido. Se permite que la centrífuga alcance mil RPM y luego se apaga.

El tejido en este momento es muy S, los ojales son muy sensibles y no se deben compactar demasiado. Se retiran los tubos y haremos este paso de lavado tres veces más. Este es el final del tercer lavado.

Los componentes del tubo cónico de 50 milésimas de pulgada se transfieren al tubo cónico de 15 pulgadas y se centrífugan durante mil RP M y luego se detienen. Se eliminará el supernat y se iniciará la primera parte de la FI Call. Estamos en el paso donde tenemos nuestra digestión de páncreas granulado.

Volveremos a suspender ese tejido para que quede bien y suelto a los gránulos. Agregaremos el primer gradiente de densidad, que es 1 1 0 8. Agregaremos cinco milésimas de pulgada a cada tubo.

A continuación, el pellet se mezcla bien en cada uno de los gradientes. Es importante que consigas una buena distribución del tejido en el gradiente más pronunciado. Ahora superpondremos dos milésimas de pulgada de densidad 1 0 9 6.

Luego, encima de eso, superpondremos dos milésimas de pulgada de densidad 1 0 6 9, y luego encima de eso 1 0 3 7 densidad. Es importante mientras superpones las densidades que no mezclas. A continuación, se han añadido todas las capas al tubo.

Y puedes ver que esta es la parte superior de 1 1 0 8, la parte superior de 9 1 0 9 6, la parte superior de 1 0 6 9 y la parte superior de 1 0 3 7. Y se puede ver que el tejido ya está empezando a moverse a su densidad adecuada, incluso sin centrifusión. Los gradientes de fial se aceleran a 1800 RPM durante 15 minutos, y recuerde mantener el freno apagado después de que se retiren los tubos de la centrífuga.

Se puede ver entre la capa 0 0 9 6 y 0 0 7, hay una bonita banda de tejido ocular de Pablo. Ahora se retira la capa 0 3 7 para eliminar cualquier residuo de tejido y ADN que pueda haberse liberado durante el procesamiento. Usando una pipeta de plástico estéril para pastos, ahora eliminará la capa de islotes y los transferirá a un cónico de 50 milésimas de pulgada que contiene 25 milésimas de pulgada de tampón de lavado.

Debes hacer este paso rápidamente porque el fol es tóxico para los ojales. De hecho, eliminamos toda la capa 0, 6, 9 y 0 9 6. Pavo corta la parte superior de la pipeta de plástico para pastos y la enjuaga con tampón de lavado.

A continuación, los ojales se centrifugan como centrífugamos anteriormente. La centrífuga se lleva a mil RPM y luego la detenemos y aspiramos. Los ojales sobrenadantes se lavarán tres veces con medios de lavado.

Así que acabamos de completar el proceso de aislamiento de párpados que llevamos desde el digestión hasta el gradiente de fol y los ojales purificados después de nuestro tercer lavado con tampón de lavado, resuspendimos los ojales en nuestro medio RPMI y lo reproducimos en una placa de cultivo de tejidos. Estos ojales ahora están listos para ensayos in vitro o preparaciones in vivo como el trasplante de ojales.