Name: Páncreas murino aislamiento Islet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratón mediante inyección de colagenasa, digestión enzimática y gradiente de Ficoll. Este método permite obtener islotes viables para trasplante en modelos diabéticos NOD.

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Preparación colagenasa <ol><li> Pesar de la colagenasa en un búfer de 50 ml y agregar aislamiento cónico para que la concentración final, como se indica en la tabla de abajo. Disolver la colagenasa por agitación. (12 + 2 ratones ratones extra = 14 ratones x 5 ml / ratón = 70 ml de solución de colagenasa total) (70 ml x 0,5 mg / ml o 0,3 mg / ml = 35 mg o 21 mg de colagenasa total P) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tensión </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Edad </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Colagenasa P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tiempo (min) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NI, NO </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NI, NO </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Prescindir de 2 ml de solución de colagenasa en cada frasco de vidrio y el lugar en el hielo. Cargar cada jeringa de 5 ml con 3 ml de colagenasa añadir aguja 30G y el lugar en el hielo (preparación de campana). </li></ol> Distensión <ol><li> Justo antes de la disección, el sacrificio de animales por dislocación cervical. Rocíe todo el cuerpo con el 70% de EtOH, por lo que es completamente mojado. Hacer una V-Insision a partir de la zona genital. Gire el ratón por lo que la cola está de espaldas a usted. </li><li> Retira el intestino hacia el lado izquierdo del ratón abierto. Esto expondrá el páncreas y el conducto biliar común. </li><li> Coloque una pinza hemostática a ambos lados del intestino delgado, donde el conducto biliar desagües, dejando un pequeño espacio para la solución de colagenasa para entrar en el intestino. </li><li> Inflar el páncreas a través de la vía biliar con una aguja 30G y una jeringa de 5 ml que contiene 3 ml de solución de colagenasa frío, a partir de la vesícula biliar. </li><li> Extirpar el páncreas del cuerpo y colocarla en un frasco de silicona que contiene 2 ml de solución de colagenasa. Este paso se debe hacer más rápida y limpiamente como sea posible, reduciendo al mínimo la acumulación de tejido graso y conectivo. </li><li> Coloque el vial en el hielo y repita el paso 3 con el ratón al lado. </li></ol> Digestión <ol><li> Sellar cada vial y colóquelo en un 37 ° C en baño María. Incubar durante 13-17 minutos (el tiempo varía con la cepa y la edad del animal). </li><li> Después del tiempo transcurrido, agite el frasco vigorosamente. El páncreas debe deshacerse. </li><li> Vierta cada digestión a través de un tamiz estéril fregadero grande en un vaso de precipitados estéril 1000 y con fuerza la pipeta de la pantalla con tampón de lavado. Prescindir de los resúmenes, en tubos de 50 ml conicals (3 pancreata/50 tubo ml: si n = 12, el uso suficiente tampón de lavado para que el volumen final de 200 ml y dispensar a los tubos de 4x50 ml). La dilución debe hacerse con rapidez y en hielo para evitar la digestión islote no deseados. </li><li> Decantar: Inicio de la centrífuga. Cuando se llega a 1300 rpm, lo apaga. </li><li> Aspirar el sobrenadante, dejando ~ 5 ml. Tenga mucho cuidado de no aspirar el pellet. </li><li> Resuspender pellet golpeando con fuerza con la mano, a continuación, agregar 50 ml de tampón de lavado. </li><li> Decantar: Inicio de la centrífuga. Cuando se llega a 1300 rpm, lo apaga. </li><li> Resuspender el precipitado y lavar con 5 ml de tampón de lavado. </li><li> La transferencia de los 5 ml a 15 ml cónicos y girar hacia abajo, como arriba. </li><li> Aspirar el sobrenadante forma más completa posible. (Buffer restante puede hacer que el cambio de la densidad de la Ficoll.) </li></ol> Ficoll Realizar de forma rápida. La exposición prolongada Ficoll es tóxico para los islotes. <ol><li> Asegúrese de pellet es completamente roto antes de añadir Ficoll (tejido intacto es difícil volver a suspender en Ficoll). </li><li> Resuspender el precipitado en 7 ml de Ficoll, la densidad de 1,108, por agitación vigorosa. </li><li> Capa en la parte superior de cada densidad de Ficoll 2 ml de cada una de las densidades que quedan en este orden: 1,096, 1,069, 1,037 continuación. </li><li> Girar durante 15 minutos a 1800 rpm a 4 grados, con una pausa de descuento! </li><li> Elige islotes de la segunda capa con spoid (estéril plastic cuentagotas). La transferencia de todas las colecciones a un cónico de 50 ml contiene aproximadamente 25 ml de tampón frío. </li><li> Lavado, como el anterior, 3 veces con tampón de lavado (repitiendo el paso 12-15). </li><li> Islotes Resuspender en 20 ml de RPMI-1640 (que contienen 10% de FCS y la penicilina y la estreptomicina, HEPES, MEM-AANE) y mezclar suavemente. Eliminar el 100 ul de la muestra para el recuento. </li><li> Transferencia de 100 ul a 35 mm rejilla de la placa que contiene 1 ml de los medios de comunicación y un ditizona ml. </li><li> Incubar islotes que quedan en RPMI 1640, en un 37 ° C, el 7% incubadora de CO 2, en 160 mm platos con un total de 30 ml de los medios de comunicación / placa. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="220" height="194" /></li></ol>

páncreas murino aislamiento islet

Murine Pancreatic Islet Isolation

Páncreas murino aislamiento Islet

Hola, soy Greg Zott. Trabajo en el Centro de Diabetes de la UCSF, en el Laboratorio Bluestone, y hoy les mostraré el proceso para aislar islotes pancreáticos de ratón. El procedimiento consiste en la inyección de una solución de colagenasa en el páncreas de un ratón donante C3H, luego extraeremos ese páncreas, lo digeriremos, purificaremos los islotes mediante un gradiente de Ficoll, y finalmente los seleccionaremos manualmente para su trasplante definitivo en la cápsula renal de un ratón NOD diabético, que será nuestro receptor.Antes de comenzar este procedimiento, diluimos nuestra solución de ATE en un tampón Hanks modificado y ajustamos la concentración específica para la cepa de ratón que estamos utilizando, la C3H. Encontramos una mejor digestión con una solución de colagenasa de 0,8 mg por ml, y utilizaremos esta solución para inyectar en el conducto biliar común con el fin de distender el páncreas. Realizando el procedimiento hoy estará Pavo Codre del centro de diabetes. Él realizará la inyección, abrirá al ratón, expondrá los intestinos y luego inyectará en el conducto biliar común.Vamos a rociar al ratón con etanol para mantener el pelo aplanado, y luego también verificare

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratón mediante inyección de colagenasa, digestión enzimática y gradiente de Ficoll. Este método permite obtener islotes viables para trasplante en modelos diabéticos NOD.

Páncreas murino aislamiento Islet

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