Páncreas murino aislamiento Islet
22 de agosto de 2007
Hola, soy Greg Zott. Estoy en el Centro de Diabetes de la UCSF en el Laboratorio Bluestone, y hoy les voy a mostrar el proceso para aislar los ojales de los ratones. El procedimiento consiste en la inyección de una solución de colagenasa en el páncreas de un ratón donante C3 H, donde luego extraeremos ese páncreas, lo digeriremos, purificaremos los ojales en un gradiente fial y luego los seleccionaremos a mano para su trasplante final en la cápsula de riñón de un ratón NOD diabético, que será nuestro receptor.
Antes de comenzar este procedimiento, diluimos nuestra solución de ATE en un tampón Hanks modificado y hemos ajustado la concentración específica para la cepa de ratón que estamos usando el C3 H. Encontramos que se digiere mejor con una solución de colagenasa de 0,8 mg por mil, y la usaremos para inyectar en el conducto biliar común para distender el páncreas. Realizar. El procedimiento de hoy será Pavo codre del centro de diabetes. Inyectará, abrirá el ratón, expondrá los intestinos y luego inyectará en el conducto biliar común.
Rociaremos el ratón con etanol para mantener el pelo suelto, y luego también verificaremos que el ratón se ha sacrificado correctamente con un pellizco en el dedo del pie. Pavo ahora abrirá el ratón y expondrá el intestino y el páncreas con una incisión en la línea media. También se cortará el diafragma para verificar que se sacrificará el ratón.
Antes de comenzar, me gustaría señalar algunas de las estructuras importantes. El estómago está acostado aquí con el páncreas conectado por debajo en el duodeno y por encima. Este es el hígado donde encontraremos la vesícula biliar y el conducto biliar común, que puedes ver aquí.
Entonces, lo que Pavo hará a continuación es aislar el intestino delgado, encontrar dónde entra el conducto biliar común al intestino delgado. Una vez que el intestino está expuesto, pinzamos a ambos lados del conducto biliar común con pinzas para mosquitos. Descubrimos que esto permite que más colágenos ingresen al páncreas, mientras que otros grupos intentan dirigir la pinza sobre el conducto biliar común.
Encontramos que esta es una mejor técnica para permitir que la enzima ingrese al páncreas. Este es un procedimiento suave. No querrás desgarrar el intestino.
Debes dejar que las pinzas se coloquen suavemente a ambos lados del conducto biliar común. Ahora encontraremos una vesícula biliar, y una vez que la vesícula biliar esté expuesta, la usaremos como guía para inyectar la colagenasa en el conducto biliar común. Powell utiliza una aguja de calibre 30 con una jeringa de cinco cc que contiene tres molinos de solución de colagenasa.
A medida que ingresa al conducto biliar común, distiende ese conducto con una solución de colagenasa y luego viaja por el conducto biliar común hasta que llega cerca del intestino. Y a medida que va cayendo, las soluciones enzimáticas que se bombean al páncreas. Ahora que el páncreas está inflado con una solución de colagenasa, Powell va a quitar los hemostáticos y luego va a quitar el páncreas del ratón arrancándolo cuidadosamente del intestino.
Lo saca del estómago. Bien, y luego, usando el bazo como mango, levanta el páncreas y luego lo corta lentamente en el conducto biliar común, y eso es todo. Se coloca el páncreas y luego se extirpa el bazo, y allí se extrae el tejido meso entérico, y luego el páncreas se coloca en una solución de colagenasa de dos molinos y un frasco de vidrio esterilizado y se vuelve a colocar en hielo.
El páncreas aislado que colocamos en los viales de vidrio ahora se colocará en un baño de agua a 37 grados durante aproximadamente 17 minutos. Los colocamos en una rejilla cónica de 50 milésimas de pulgada para que no floten. Una vez durante el baño, se pone en marcha el temporizador y comienza la digestión.
Una vez que se completa el tiempo de digestión, se retiran los viales y luego se agitan y se interrumpen suavemente. Y una vez que el tejido comienza a desmoronarse, el vial se coloca en hielo. Se coloca una criba estéril sobre un vaso de precipitados de 400 milésimas de pulgada que contiene tampón de lavado.
A continuación, el digestivo del páncreas se vierte cuidadosamente sobre la pantalla en el tampón de lavado. Para fines de demostración, se ha apagado el capó y se ha levantado el vidrio del capó para que podamos ver lo que estamos haciendo. Una vez que se vierte la digestión del páncreas en el vaso de precipitados, los viales se enjuagan con el mismo tampón de lavado y se coloca el tampón de lavado sobre la pantalla.
Tenemos una jeringa llena de tampón de lavado. Lo usaremos para lavar a la fuerza el pañuelo a través de la pantalla. La idea es liberar los ojales sueltos que no estén adheridos a la matriz, pero dejando las membranas y el tejido sin digerir en la pantalla.
Y cuando termine de lavar un pañuelo, esto es lo que generalmente ve al final del procedimiento. El tejido del páncreas que está en el fondo del tubo ahora se transferirá a dos cónicos de 50 milésimas de pulgada, y el tejido se lavará, el tejido se mezclará uniformemente y luego se distribuirá uniformemente para que tengamos un volumen de gránulos igual en cada tubo. El vaso de precipitados ahora se enjuaga con más tampón de lavado.
Los lados se enjuagan para que vuelva a entrar todo el tejido que se introduce en el vaso de precipitados. Luego se distribuye equitativamente entre cada dos, ambos de 50 mil. A continuación, se rematan con tampón de lavado.
El tejido se invierte varias veces y luego se coloca en una centrífuga. Este es un giro rápido. Se permite que la centrífuga alcance mil RPM y luego se apaga.
El tejido en este momento es muy S, los ojales son muy sensibles y no se deben compactar demasiado. Se retiran los tubos y haremos este paso de lavado tres veces más. Este es el final del tercer lavado.
Los componentes del tubo cónico de 50 milésimas de pulgada se transfieren al tubo cónico de 15 pulgadas y se centrífugan durante mil RP M y luego se detienen. Se eliminará el supernat y se iniciará la primera parte de la FI Call. Estamos en el paso donde tenemos nuestra digestión de páncreas granulado.
Volveremos a suspender ese tejido para que quede bien y suelto a los gránulos. Agregaremos el primer gradiente de densidad, que es 1 1 0 8. Agregaremos cinco milésimas de pulgada a cada tubo.
A continuación, el pellet se mezcla bien en cada uno de los gradientes. Es importante que consigas una buena distribución del tejido en el gradiente más pronunciado. Ahora superpondremos dos milésimas de pulgada de densidad 1 0 9 6.
Luego, encima de eso, superpondremos dos milésimas de pulgada de densidad 1 0 6 9, y luego encima de eso 1 0 3 7 densidad. Es importante mientras superpones las densidades que no mezclas. A continuación, se han añadido todas las capas al tubo.
Y puedes ver que esta es la parte superior de 1 1 0 8, la parte superior de 9 1 0 9 6, la parte superior de 1 0 6 9 y la parte superior de 1 0 3 7. Y se puede ver que el tejido ya está empezando a moverse a su densidad adecuada, incluso sin centrifusión. Los gradientes de fial se aceleran a 1800 RPM durante 15 minutos, y recuerde mantener el freno apagado después de que se retiren los tubos de la centrífuga.
Se puede ver entre la capa 0 0 9 6 y 0 0 7, hay una bonita banda de tejido ocular de Pablo. Ahora se retira la capa 0 3 7 para eliminar cualquier residuo de tejido y ADN que pueda haberse liberado durante el procesamiento. Usando una pipeta de plástico estéril para pastos, ahora eliminará la capa de islotes y los transferirá a un cónico de 50 milésimas de pulgada que contiene 25 milésimas de pulgada de tampón de lavado.
Debes hacer este paso rápidamente porque el fol es tóxico para los ojales. De hecho, eliminamos toda la capa 0, 6, 9 y 0 9 6. Pavo corta la parte superior de la pipeta de plástico para pastos y la enjuaga con tampón de lavado.
A continuación, los ojales se centrifugan como centrífugamos anteriormente. La centrífuga se lleva a mil RPM y luego la detenemos y aspiramos. Los ojales sobrenadantes se lavarán tres veces con medios de lavado.
Así que acabamos de completar el proceso de aislamiento de párpados que llevamos desde el digestión hasta el gradiente de fol y los ojales purificados después de nuestro tercer lavado con tampón de lavado, resuspendimos los ojales en nuestro medio RPMI y lo reproducimos en una placa de cultivo de tejidos. Estos ojales ahora están listos para ensayos in vitro o preparaciones in vivo como el trasplante de ojales.
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Descripción general
Este video demuestra el proceso de aislamiento de islotes de ratón a partir del páncreas de un ratón donante C3H. El procedimiento incluye la inyección de colagenasa, la extirpación del páncreas y la purificación de islotes para trasplante en un ratón NOD diabético.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Endocrinología
- Biología del trasplante
Antecedentes
- El trasplante de islotes es un tratamiento potencial para la diabetes.
- El aislamiento de islotes requiere una digestión enzimática específica.
- La colagenasa se utiliza comúnmente para el aislamiento de islotes.
- Los modelos de ratón se emplean frecuentemente en la investigación de la diabetes.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para aislar islotes de ratón.
- Preparar islotes para trasplante en receptores diabéticos.
- Mejorar la comprensión de la función y viabilidad de los islotes tras el aislamiento.
Métodos Utilizados
- Inyección de solución de colagenasa en el páncreas.
- Extracción y digestión del páncreas.
- Purificación de islotes mediante un gradiente de Ficoll.
- Selección manual de islotes para trasplante.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de islotes del páncreas.
- Los islotes preparados para trasplante mostraron viabilidad.
- El método demostró efectividad para estudios futuros.
- Potencial para mejorar el tratamiento de la diabetes mediante trasplante.
Conclusiones
- El método descrito es eficiente para aislar islotes de ratón.
- El trasplante de islotes puede ser una opción viable para modelos diabéticos.
- Investigaciones futuras pueden basarse en esta técnica de aislamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de islotes pancreáticos funcionales a partir de modelos murinos permite la evaluación preclínica de terapéuticas para la diabetes y estrategias regenerativas. Esta técnica facilita la validación de dianas en enfermedades metabólicas al proporcionar un sistema relevante para evaluar la secreción de insulina, la viabilidad del injerto y las intervenciones inmunomoduladoras. Un rendimiento confiable de islotes mejora la certeza predictiva en la identificación de compuestos prometedores y la reducción de riesgos preclínicos en enfoques basados en trasplantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en la homeostasis de la glucosa y la función de las células beta utilizando islotes murinos primarios.
- Valor operativo: Proporciona una fuente estandarizada de tejido primario para estudios de interacción con dianas y modulación de vías metabólicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona islotes purificados adecuados para ensayos funcionales que miden la secreción de insulina y la viabilidad celular.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante la preparación consistente de tejidos y la purificación por gradiente de densidad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la evaluación de la eficacia del trasplante de islotes en modelos de ratón NOD diabético.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde los estudios de aislamiento hasta los de enxerto, apoyando la validación del modelo preclínico.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento al proporcionar tejido primario validado para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y estudios preclínicos de trasplante en la investigación de la diabetes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función, supervivencia de islotes y su respuesta a inmunomoduladores o compuestos regenerativos.
- Tamizaje: Permite la preparación reproducible de islotes para obtener lecturas funcionales de alta fidelidad en cascadas de tamizaje de compuestos.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos, como la liberación de insulina y métricas de viabilidad, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta el aislamiento con la validación preclínica mediante el trasplante en receptores diabéticos, evaluando la función del injerto y la tolerancia inmune.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para generar islotes relevantes para enfermedades en múltiples programas terapéuticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos mediante tejido primario relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y la estandarización en el aislamiento de islotes mediante digestión con colagenasa y purificación por gradiente de Ficoll.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la incertidumbre biológica en modelos preclínicos de diabetes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de estrategias de trasplante y regeneración basadas en la función de islotes validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía murina y manejo de tejidos para el aislamiento y digestión del páncreas.
- Depende de la preparación de la solución de colagenasa y de la optimización de su concentración para cepas específicas de ratón.
- Necesita acceso a equipos de centrifugación para la separación mediante gradiente de densidad y los pasos de lavado.
- Implica consideraciones de adaptación frente a las variaciones específicas de la cepa en el tamaño del páncreas y la eficiencia de digestión.
- Está limitado por la sensibilidad del tejido durante el procesamiento, lo que requiere un manejo suave para preservar la viabilidad y función de los islotes.
