Contraste de fase y de interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC)
6 de agosto de 2008
Este protocolo se destacan los principios y las aplicaciones prácticas de la fase y el contraste de interferencia diferencial (DIC) de Microscopía
La microscopía óptica es una de las herramientas, si no la más importante, en el campo de la investigación biomédica. Dependiendo de la aplicación, son deseables diferentes modos de iluminación para la observación de muestras. Este video demostrará dos modos ópticos de iluminación con luz transmitida: contraste de fase y microscopía DIC o de contraste por interferencia diferencial.
Hola, soy Victoria San Frolic del servicio central de Imagen Óptica del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio. Hoy les mostraré cómo observar adecuadamente especímenes utilizando microscopía de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial. Comencemos.
La microscopía de campo brillante estándar no es adecuada para observar especímenes transparentes y incoloros. La microscopía de contraste de fase se utiliza a menudo para generar contraste en especímenes biológicos transparentes que no absorben la luz. La técnica fue descubierta por Zurich en 1942, quien recibió el Premio Nobel por su logro.
El microscopio de contraste de fases es un microscopio óptico de campo claro al que se le han añadido objetivos especiales de contraste de fases, que contienen una placa o anillo de fase, y un anillo condensador en lugar de un diafragma. El anillo suele ubicarse en la torreta del condensador, y su tamaño debe seleccionarse según el objetivo utilizado. Tras configurar la iluminación de Köhler, seleccione el objetivo de fase adecuado y luego gire el anillo de fase correspondiente para colocarlo en posición en el condensador.
Una vez que el anillo de fase del objetivo y el anillo del condensador se han alineado correctamente para ser concéntricos y superpuestos, podemos observar la muestra y ajustar adecuadamente el enfoque. Así que vamos a demostrar cómo se ve el contraste de fases a través del microscopio. Aquí se muestra un corte de hígado de rata.
Bajo contraste de fases. Este método mejora la apariencia del material biológico al cambiar el contraste de diferentes tonos de gris a tonos que van del negro al blanco. Sin embargo, notará que los especímenes están rodeados por un halo, que oscurece la estructura fina.
Este halo es un artefacto de la iluminación mediante el anillo de fase. Ahora notará que cuando cambiamos a campo claro, este espécimen es muy difícil de observar. Al volver al contraste de fase, podemos ver claramente la estructura y la forma de las células en el tejido hepático de rata desde su introducción a finales de la década de 1960.
La microscopía de contraste de interferencia diferencial o DIC ha sido popular en la investigación biomédica porque produce imágenes de alta resolución de estructuras finas al realzar las interfaces con contraste, y la imagen obtenida corresponde a una sección óptica muy delgada. De hecho, la capacidad de DIC para producir secciones ópticas lo ha convertido en un modo útil de iluminación con luz transmitida para la microscopía confocal. El microscopio DIC es un microscopio óptico de campo claro al que se le añaden los siguientes elementos: un polarizador colocado entre la fuente de luz y el condensador.
Un prisma divisor de haz DIC en el condensador, un prisma combinador de haz DIC justo detrás del objetivo y un analizador en el espacio de infinito antes de los dos haces. Para obtener el mejor rendimiento de la óptica DIC, es importante primero alinear el microscopio de luz para iluminación Köhler y luego colocar los elementos DIC en la trayectoria óptica. La luz procedente de la fuente atraviesa un polarizador y luego se divide mediante el primer prisma.
Estos haces emparejados viajan cercanos entre sí. Si ambos haces pasan a través del mismo material en la muestra, entonces, cuando se recombinan mediante el segundo prisma, no interfieren entre sí y, por lo tanto, aparecen grises. Sin embargo, en un borde de una estructura, uno de los haces del par atraviesa un material diferente al de su pareja y se altera.
Cuando estos haces se recombinan mediante el segundo prisma, interferirán ya sea constructivamente produciendo un punto brillante o destructivamente produciendo un punto oscuro. A continuación, observe diatomeas con contraste DIC. Notará que los detalles finos de la estructura de las diatomeas son fácilmente visibles.
Sin embargo, si se eliminan los componentes ópticos de contraste de interferencia diferencial (DIC), estos detalles desaparecen. El contraste a través del espécimen es brillante en un lado y más oscuro en el otro. Esto da la impresión de una topografía, pero de hecho, se trata de una ilusión.
La dirección del efecto de sombra proyectada puede invertirse girando el polarizador a través de un punto de cruce hasta el contraste opuesto. Acabamos de revisar los modos ópticos de contraste de fase y DIC. Solo para recordarle, la eliminación de contraste de fase mejora los especímenes con contraste desde tonos negros hasta blancos y es útil para observar especímenes que son incoloros y transparentes.
DIC también genera contraste en la muestra. Lo hace creando una imagen de alta resolución de una sección óptica delgada. Eso es todo.
Gracias por ver el video y mucha suerte con su microscopía.
Descripción general
Este protocolo destaca los principios y las aplicaciones prácticas de la microscopía de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC). Estas técnicas mejoran la visualización de especímenes biológicos transparentes y incoloros, convirtiéndolas en herramientas esenciales en la investigación biomédica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación biomédica
- Técnicas de microscopía
- Imagen óptica
Antecedentes
- La microscopía óptica es fundamental para observar especímenes biológicos.
- La microscopía de contraste de fase mejora el contraste en especímenes transparentes.
- La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) proporciona imágenes de alta resolución de estructuras finas.
- Ambas técnicas son esenciales para un análisis efectivo de los especímenes.
Objetivo del estudio
- Demostrar el uso de la microscopía de contraste de fase y de contraste de interferencia diferencial (DIC).
- Explicar la configuración y alineación de las técnicas de microscopía.
- Destacar las ventajas de estos métodos para observar materiales biológicos.
Métodos Utilizados
- Configuración de la iluminación de Köhler para una distribución óptima de la luz.
- Uso de objetivos y anillos de contraste de fase.
- Implementación de óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC), incluyendo polarizadores y prismas divisores de haz.
- Comparación de la visibilidad de la muestra bajo diferentes técnicas de microscopía.
Resultados principales
- La microscopía de contraste de fase revela estructuras celulares en especímenes transparentes.
- La microscopía de contraste de interferencia diferencial mejora los detalles finos y proporciona un efecto topográfico.
- Ambas técnicas mejoran significativamente la claridad de los especímenes biológicos.
- Se observan y explican artefactos como los halos en el contraste de fase.
Conclusiones
- El contraste de fase es eficaz para observar especímenes incoloros y transparentes.
- La microscopía de contraste de interferencia diferencial ofrece imágenes de alta resolución de estructuras finas.
- Ambos métodos son valiosos para avanzar en la investigación en ciencias biológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de contraste de fase y la microscopía de contraste interferencial diferencial permiten la visualización de especímenes biológicos transparentes y no absorbentes de luz, apoyando flujos de trabajo de descubrimiento temprano donde se requiere imágenes sin marcado. Estas técnicas reducen los riesgos mecanicistas al revelar detalles estructurales y la morfología funcional en células y tejidos vivos sin fijación ni tinción. Su integración en los flujos de descubrimiento mejora la confianza en la validación de objetivos al permitir la observación directa de respuestas fenotípicas y de la arquitectura celular en condiciones cercanas a las fisiológicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la observación sin marcadores de especímenes transparentes, como células vivas y secciones de tejido, para evaluar cambios morfológicos asociados con la modulación del blanco.
- Valor operativo: Facilita el cribado rápido de fenotipos celulares sin necesidad de etiquetas fluorescentes ni fijación química, reduciendo el tiempo de preparación del ensayo.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en las hipótesis sobre el blanco al permitir la visualización directa de fenotipos estructurales y funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona imágenes sin marcado y de alto contraste adecuadas para el desarrollo de ensayos fenotípicos en los que la transparencia dificulta el detalle en campo claro.
- Valor operativo: Permite la estandarización de las condiciones de imagen mediante la iluminación de Köhler y la alineación precisa de placas de fase o prismas de contraste de interferencia diferencial (DIC), mejorando la reproducibilidad entre experimentos.
- Escalabilidad: Compatible con formatos de placas de múltiples pocillos cuando se integra en sistemas de microscopía automatizados, lo que permite campañas de cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al permitir la obtención de imágenes consistentes de células primarias, explantes y modelos de embriones en diferentes flujos de trabajo.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Revela detalles estructurales finos en las interfaces de los tejidos, ayudando a esclarecer los mecanismos de acción en sistemas biológicos complejos.
- Sistemas Relevantes para Enfermedades: Aplicable a especímenes gruesos, incluyendo secciones de tejido, huevos y embriones, lo que permite la evaluación en modelos fisiológicamente complejos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La microscopía de contraste de fase y la microscopía de contraste interferencial diferencial funcionan como tecnologías habilitadoras en el continuo del descubrimiento, apoyando la comprobación de hipótesis en biología básica, la preparación de ensayos en cribados y el análisis morfológico en la investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la observación directa de las respuestas celulares a perturbaciones en especímenes transparentes y sin tinción.
- Selección: Aporta al desarrollo de ensayos mediante imágenes reproducibles y de alto contraste de especímenes sin marcado, reduciendo la variabilidad en las lecturas fenotípicas.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de intensidad y contraste en las interfaces estructurales, permitiendo comparaciones objetivas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Garantiza continuidad al proporcionar una visualización constante de tejidos primarios y explantes desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de imagen reutilizable entre departamentos, reduciendo la redundancia en la asignación de recursos de microscopía.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al revelar detalles estructurales finos y características topológicas en especímenes vivos y sin tinción.
- Valor operativo: Promueve la estandarización mediante procedimientos definidos de alineación de anillos de fase y óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC), mejorando la reproducibilidad diaria.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al aumentar la confianza en las observaciones fenotípicas, reduciendo así el descarte tardío debido a la complejidad biológica inesperada.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en evidencia fenotípica directa y sin marcadores proveniente de sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica, incluyendo la iluminación de Köhler y el centrado preciso de placas de fase o prismas DIC.
- Depende de hardware especializado: objetivos de contraste de fases con anillos de fase, anillos del condensador, polarizadores, prismas divisores y combinadores de haces, y analizadores.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de iluminación y alineación para garantizar resultados consistentes entre usuarios y sitios.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la coincidencia del índice de refracción y el grosor de la muestra, que afectan la calidad del corte DIC y los artefactos de halo en el contraste de fases.
- Las limitaciones prácticas incluyen los artefactos de halo en el contraste de fases que pueden ocultar estructuras finas, y el efecto de sombra direccional en DIC, que es una ilusión óptica que no representa la verdadera topografía.
