Name: Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a detectar empalmes alternativos del pre-ARNm en secciones de cerebro de ratón mediante hibridación in situ con sondas de unión a unión de exones y amplificación de señal. Este método permite analizar patrones de empalme en múltiples subtipos celulares simultáneamente.

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Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association [subvenciones 0365274B a H.L.], Instituto Nacional del cáncer [esporas GI P50CA150964 a Z.W.], institutos nacionales de salud [Oficina de investigación infraestructura compartida instrumentación Grant S10RR031845 a la microscopia ligera imagen instalación en Case Western Reserve University] y China Scholarship Council [a X.G.]. Los autores agradecen a Richard Lee en la base de imágenes de microscopia de luz por su ayuda con la exploración de la diapositiva.

Todos los experimentos descritos aquí que involucran ratones han sido aprobados por la Comisión de uso y de caso Western Reserve University institucional Animal Care. El título del protocolo 2016-0068 (PI: Hua Lou) es "Papel de splicing alternativo del pre-mRNA en el desarrollo de vertebrados".
Nota: Se incluye información de todos los equipos, reactivos y suministros utilizados en el presente Protocolo en la Mesa de materiales.
1. preparar formalina parafina fijo encajado (FFPE) secciones
<ol><li>
Eutanasia 1 ratón CD1 y 1 ratón C57BL/6J por dislocación cervical. Cuidadosamente corte el cráneo con tijeras quirúrgicas y pinzas. Quitar el cerebro con una cuchara. Nota: ratones machos de 5 meses CD1 y ratones machos de 3 meses C57BL/6J se utiliza y mostraron resultados similares.<ol>
<li>Lavar el cerebro con PBS. Fijar todo el cerebro con una solución que contiene 10% de formalina a temperatura ambiente (RT) de 30 h poniendo todo el cerebro en 50 mL de la solución de formalina.</li>
		<li>Cambiar la solución fijadora a PBS e incubar el cerebro en PBS durante la noche a 4 ° C. Deshidratar e incrustar el cerebro con xileno y parafina usando procedimientos estándar de18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizar un micrótomo para cortar tejidos embebidos en 5 secciones de μm. Poner la cinta de la parafina en baño de agua RT primero y después en un baño de agua de 45 ° C para difundir la cinta.
	<ol>
<li>Cuando desaparecen las arrugas y pliegues en la cinta, inmediatamente montar secciones en portaobjetos de vidrio. Aire seco diapositivas durante la noche en diapositivas RT. Cueza al horno por 1 h a 60 ° C antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretratamiento de la muestra
<ol><li>
Desparafinizar cortes de tejido. Llevar a cabo estos pasos en una campana de humos.
	<ol>
<li>Llene dos lavando platos (figura 1A) con 250 mL de xileno fresco y dos con 250 mL de etanol al 100%. Insertar diapositivas de tejidos en un estante de lavado (figura 1A) y el lavado del estante en lavar los platos después de la orden e incubación el tiempo indicado en la tabla 1.</li>
		<li>Durante cada incubación, levante la rejilla de lavado hacia arriba y hacia abajo más de 3 veces en el plato de lavado. Después de cada incubación, mover rápidamente la canasta de lavado en el siguiente plato lavarse para evitar que las secciones de tejido se seque.</li>
		<li>Después de completar los pasos de la incubación, saque la rejilla de lavado con diapositivas del plato de lavado. Coloque la rejilla en una incubadora de 60 ° C por 5 minutos o hasta que las diapositivas estén completamente secas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dibujar una 0,75 '' x 0,75 '' barrera alrededor de la sección del tejido con un bolígrafo de la barrera hidrofóbica. Secar la barrera por 3 min a TA.</li>
	<li>
Prepare las rebanadas
	<ol>
<li>Preparar reactivos y equipos<ol>
<li>Encender el horno de hibridación (figura 1B) y la temperatura a 40 ° C 30 min antes de su uso.</li>
			<li>Moje el papel de humidificación (Figura 1E) con agua destilada completamente y poner en bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda). Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación.</li>
			<li>Preparar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos mediante la adición de 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x objetivo recuperación de reactivos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicar peróxido de hidrógeno.<ol>
<li>Poner los portaobjetos deparaffinized en el Banco. Agregar 5 – 8 gotas de peróxido de hidrógeno a una sección para cubrir completamente el tejido. Incubar por 10 min a TA.</li>
			<li>Toque en las diapositivas en una hoja de papel absorbente para retirar la solución de peróxido de hidrógeno, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado inmediatamente y mueve el estante a un plato de lavado con dH2O.</li>
			<li>Lavar los portaobjetos moviendo la rejilla hacia arriba y hacia abajo en agua destilada durante 3 a 5 veces. Hacia la canasta de lavado un plato de lavado llenado con agua destilada y diapositivas de lavado una vez más.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar recuperación de destino<ol>
<li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 1000 mL en una placa caliente. Agregar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos en el vaso y cubrir con papel de aluminio. Inserte un termómetro en el vaso a través de la cubierta de aluminio (figura 1). Encender la placa y en alto durante 10 – 15 minutos.</li>
			<li>Cuando la temperatura de los reactivos de recuperación alcanza los 98 ° C, pasar el control de la temperatura de la placa de alto a bajo para mantener un hervor suave. No hervir más de 15 minutos.</li>
			<li>Mientras tanto, cuidadosamente abra la hoja y colocar la rejilla de lavado con rebanadas dentro el regente de la recuperación. Cubrir el vaso otra vez e incubar durante 15 minutos.</li>
			<li>Uso de fórceps para extraer la rejilla el vaso a un plato de lavado llenan con 200 mL de dH2O y enjuague por 15 s.</li>
			<li>Mueve el estante a un plato de lavado que contiene etanol fresco 100% y dejar reposar por 3 minutos eliminar diapositivas y seca en una incubadora de 60 ° C durante 10 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proteasa III se aplican<ol>
<li>Coloque el portaobjetos sobre la parrilla de tinción (figura 1, derecha). Añadir 5 gotas de proteasa III para cubrir el tejido. Con cuidado ponga la rejilla en la bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda) e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación de 40 ° C. Incubar durante 30 minutos.</li>
			<li>Retire la parrilla y coloque la bandeja en el horno. Toque el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado y lugar la parrilla en un plato de lavado lleno de dH2O. mover el estante hacia arriba y hacia abajo para lavar los portaobjetos para 3 - 5 veces.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH ensayo
<ol><li>
Preparar materiales
	<ol>
<li>Pre-calentar 50 x de tampón de lavado en una incubadora de 40 ° C durante 20 min mezcla 2.94 L dH2O y 60 mL de 50 x de tampón de lavado para hacer 1 x de tampón de lavado.</li>
		<li>Preparar solución tinción hematoxilina al 50% mediante la adición de 100 mL de hematoxilina de Gill I a 100 mL de dH2O. Prepare agua de amoníaco 0,02% (p/v) añadiendo 1,43 mL de hidróxido de amonio N 1 a 250 mL de dH2O. mezcla bien en un recipiente.</li>
		<li>Poner las puntas de prueba y AMP 0 – 6 reactivos a RT 30 min antes de su uso. Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación de 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento ISH Nota: Para examinar la expresión de la Nf1 isoformas de empalme y calcular el porcentaje empalmado en valor (PSI) para el exón 23a, tres diferentes sondas ISH que exón 23a-incluido isoforma, exón excluidos 23a isoforma o ambas isoformas son usadas (figura 2 ). Las sondas se utilizan en las secciones de tejido adyacente corte. Para asegurar la exactitud del cálculo, es crítico que las secciones de tres tejido tratan exactamente el mismo en los pasos de detección de hibridación y amplificación de señal.<ol>
<li>Sonda de hibridación.<ol>
<li>Quite las diapositivas de la canasta de lavado y aprovechar el exceso de líquido de las diapositivas. Coloque el portaobjetos en el canal de la mancha.</li>
			<li>Utilice un lápiz para rotular los portaobjetos con el nombre del sondeo. Poner las diapositivas de tejido cerebral adyacente corte tres que se hibridó con tres sondas diferentes de Nf1 (figura 2) juntos. Llevar a cabo los pasos siguientes en el mismo orden de diapositivas.</li>
			<li>Añadir 4 gotas de la sonda para cubrir el tejido. Do esta una diapositiva a la vez para evitar que las secciones se seque. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducirlo en el horno de 40 ° C por 2 h.</li>
			<li>Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado. Para cada lavado, llenar la cubeta de tinción con 200 mL de 1 x de tampón de lavado y ponga una rejilla de lavado en el mismo. Aprovechar el exceso de líquido sobre un un portaobjetos papel toalla en un momento y rápidamente lo introduzca en la canasta de lavado. Mueva la parrilla hacia arriba y hacia abajo en el plato para 3 a 5 veces por 2 min a TA.</li>
			<li>Para el segundo lavado Utilice el tampón de lavado fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificación de la señal.<ol>
<li>Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y los coloque en el canal de la mancha. Añadir 4 gotas de AMP 0 para cubrir el tejido. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducir en el horno durante 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado como se describió anteriormente.</li>
			<li>Repita este paso con AMP 1 al 6 siguiendo el orden y la condición del cuadro 2. Lave los portaobjetos dos veces después de cada paso de hibridación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detección de señal<ol>
<li>Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y colóquelas en mancha rack. Añadir 2 μl de rápido rojo B a 120 μl de Fast Red (relación de 1: 60) en un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien y añadir para cubrir completamente la sección del tejido. Nota: El volumen total de la Red A mezcla B se basa en el número y tamaño de las secciones de tejido. Para un área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 μl es suficiente para una sección. Utilizar la mezcla dentro de 5 minutos y evitar la exposición de la mezcla a la luz solar directa o luz ultravioleta.</li>
			<li>Cerrar la bandeja e incubar 10 min a RT. Retire la solución a un contenedor de basura inmediatamente Inserte las diapositivas en un rack de lavado y coloque la parrilla en un plato de lavado con agua del grifo. Enjuague nuevamente con agua fresca del grifo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contratinción de las diapositivas
	<ol>
<li>Retire la rejilla de lavado del agua de golpecito y rápidamente Pulse sobre papel absorbente para eliminar el agua extra. Poner la rejilla en una 50% la hematoxilina solución de tinción e inmediatamente mueve el estante arriba y abajo varias veces. Incubar durante 2 min a TA.</li>
		<li>Transferencia de la parrilla corrediza en el plato de agua del grifo. Lavar 3 – 5 veces mover el estante hacia arriba y hacia abajo y cambiando el agua fresca del grifo hasta que las diapositivas se convierten en claras, mientras que los tejidos cerebrales siendo púrpura.</li>
		<li>Mueve el estante a un plato que contiene agua de amoníaco 0,02%. Mover el estante hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que los tejidos se vuelven azules. Lave los portaobjetos 3 a 5 veces con agua de grifo en una cubeta de tinción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje de las muestras
	<ol>
<li>Mover la parrilla de la cubeta de tinción a una incubadora de 60 ° C e incube durante al menos 15 minutos hasta que las diapositivas estén completamente secas.</li>
		<li>40 μl de medio de montaje sobre el portaobjetos y coloque cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en la sección del tejido. Aire seco diapositivas por 30 min a TA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis y recopilación de datos
Nota: Utilizar un escáner de diapositivas para escanear las imágenes con 40 aumentos.
<ol><li>
Controles positivos y negativos
	<ol>
<li>Para cada experimento, incluir controles positivos y negativos (figura 3). Como un buen control positivo, señal debe ser visible como punteadas puntos con aumentos de 20-40.</li>
		<li>Uso del ratón (Mm) 1ZZ - PPIB - como control positivo. Este sondeo apunta a un gen común de limpieza PPIB. Para el control negativo, un punto a cada 20 células Mostrar fondo tinción por campo de microscopio de 20 X es aceptable.</li>
		<li>Usar la sonda DapB-1ZZ como control negativo. Este sondeo apunta la dapB gen bacteriano. Estas puntas de prueba de control se han utilizado en muchos ensayos ISH19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de señales y análisis de patrones de expresión de Nf1 exón 23a
	<ol>
<li>Como las señales de hibridación se indican como puntos punteadas, contar los puntos manualmente. El número de puntos se correlaciona con el nivel de las transcripciones que es detectado por un sensor específico. Tenga en cuenta que el número de puntos también puede ser analizado por el software ImageJ o SpotStudio.</li>
		<li>Utilice tres sondas para hibridar a exón que contiene 23a, exón 23a falta isoformas o transcripciones de Nf1 total (figura 2). Como las tres puntas de prueba no pueden utilizarse al mismo tiempo, utilizar tres secciones de tejido cerebral adyacente para hibridar a cada sonda.<ol>
<li>Para calcular el porcentaje empalmado en (PSI) para el exón 23a, contar el número de puntos en varias regiones del cerebro y las células. Para cada región de interés, cuenta más de 400 células de varias subregiones como se indica en la figura 4.</li>
			<li>Recopilar datos de las mismas subregiones de cada uno de los tres sondeos. Calcular PSI como número de puntos por la célula con la sonda de inserción exón 23a / (número de puntos por celular con la sonda de inserción exón 23a + número de punto por la célula con la exon23a salta sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta comunicación informa el uso de BaseScope ARN ISH para examinar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Está demostrado que empalme exón-exón de anti-sentido sondas de menos de 50 nucleótidos pueden dirigirse a inclusión de exón y saltar isoformas robusta y específicamente. Además, la señal resultante puede utilizarse para calcular PSI de un exón alternativo.
Se analizaron algunas variaciones en el procedimiento. Por ejemplo, secciones congeladas del tejido generada...

Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del1,2. Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer3,4. Por lo tanto es crucial investigar y comprender mejor los mecanismos de splicing alternativos en un intento de encontrar nuevos tratamientos de enfermedades humanas.
COMO a menudo se regula de manera específica de tipo celular. Es importante determinar el patrón de expresión de AS de un gen específico en un sistema biológico dado. Sin embargo, esto se complica cuando se estudia un órgano complejo que contiene muchos tipos diferentes de células, como el cerebro o el corazón. En este caso, una opción ideal de sistema de ensayo es RNA en situ hibridación (ISH utilizando) las secciones por lo que el modelo AS de expresión de un gen específico puede ser detectado en muchos tipos celulares simultáneamente. De hecho, se han utilizado sondas exón específico para evaluar los niveles de expresión de un exón alternativo5,6,7. Sin embargo, este enfoque no es adecuado para análisis del patrón por las siguientes razones. En primer lugar, convencionales métodos ISH suelen utilizan sondas de más de 300 bp, mientras que el tamaño promedio de exones internos vertebrados (no primer o último exón) es 170 nucleótidos8,9. En segundo lugar, cuando una sonda de exón específico se utiliza para examinar el patrón de corte y empalme de un exón alternativo interno, la única isoforma de mRNA detectada por la sonda es la que contiene el exón, mientras que la isoforma de mRNA sin el exón no puede ser detectado. Así, el cálculo por ciento empalmado en valor (PSI) para el exón alternativo es complicado. Además, ISH fluorescente convencional a menudo combina ISH con inmunotinción, que reduce la eficiencia de la detección y la robustez. Por ejemplo, en un estudio que investigó la tensión inducida empalme isoform de la conmutación de la acetilcolinesterasa (AChE) mRNA, digoxigenina fue incorporado en la sonda ISH y detectado usando anticuerpo anti-digoxigenina. Alternativamente, la sonda marcada con biotina fue detectado por un conjugado de fosfatasa alcalina/estreptavidina y sustrato para fosfatasa alcalina10. Ni método utiliza cualquier estrategia de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Como resultado, es difícil detectar las transcripciones del mRNA que se expresan en niveles bajos. Por lo tanto, es necesario un sistema de análisis ISH más simple y más robusto para analizar patrones de expresión en situ.
BaseScope es un reciente desarrollo basado en la plataforma de RNAscope, una bien establecida y ampliamente utilizado sistema de ensayo ISH. Ambos sistemas de ensayo emplean una tecnología de amplificación específico del destino que aumenta la sensibilidad de detección11,12. Lo que distingue una de la otra es la longitud de la secuencia de destino, que es tan corta como 50 nucleótidos para BaseScope y 300-1.000 nucleótidos de RNAscope. Por lo tanto, es posible sondas de diseño dirigidos a uniones exón-exón para detectar específico alternativo mRNA isoforms. En el presente estudio, se estableció un procedimiento para examinar como patrones de expresión de la neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) exón 23a, un exón alternativo estudiado en el mismo laboratorio13,14,15 , 16 , 17, en secciones de cerebro de ratón. Los resultados demuestran que el BaseScope es un sistema ideal para el estudio de patrones de expresión de Nf1 exón 23a in situ. Como este sistema de análisis puede ser adaptado para analizar como patrones de expresión de muchos exones alternativos, representa una poderosa nueva herramienta en los estudios de AS.

<table><tbody><tr><td><Equipo fuerte></fuerte>Horno de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hibridación</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Control de Humedad (con tapa)</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Tinción</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III Incubadora de propósito general</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de portaobjetos</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< kit >pretratamiento fuerte</fuerte></td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrógeno</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa III*</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>Recuperación de Objetivos 10x</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos de detección BaseScope</td><td>Diagnóstico celular avanzado</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Diagnóstico Celular Avanzado Rápido RED-A</td><td></td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Diagnóstico Celular Avanzado RED-B Rápido</td><td>Tampón de</td> lavado <td>50x</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de Control Negativo - Ratón DapB-1ZZ</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de Control Positivo- Ratón (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Pellet de celda 3T3 de control</td><td>Diapositiva Celular Avanzada</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</ fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Otros suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel humidificador</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado 310015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estante de lavado</td> American <td>Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Lavar platos</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de barrera hidrofóbica</td><td>Laboratorio de vectores</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>solución de formalde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific 173942</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis cuantitativo de empalmes alternativos del pre-mrna en secciones de cerebro de ratón usando análisis de arn in situ hibridación

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Empalme alternativo (AS) ocurre en más del 90% de genes humanos. El patrón de expresión de un exón alternativamente empalmado a menudo está regulado de manera específica de tipo celular. COMO expresión patrones típicamente son analizados por RT-PCR y RNA-seq con muestras de RNA aislados de una población de células. In situ examen de como patrones de la expresión de una particular estructura biológica puede realizarse por el RNA en situ hibridación (ISH) utilizando sondas exón específico. Sin embargo, este uso particular del ISH ha sido limitada porque exones alternativos son generalmente demasiado cortos para el diseño de sondas exón específico. En este informe, el uso de BaseScope, una tecnología recientemente desarrollada que emplea cortos oligonucleótidos antisentidos en ARN ISH, se describe a analizar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Exón 23a de neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) se utiliza como ejemplo para ilustrar que corta exón-exón cruce sondas exhiben señales de hibridación robusto con alta especificidad en el análisis de ARN ISH en secciones de cerebro de ratón. Más importante aún, las señales detectadas con exón específico inserción y saltar las puntas de prueba pueden utilizarse para calcular fiablemente el porcentaje empalmado en los valores de expresión de 23a exón de Nf1 en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón. Presentan el protocolo experimental y el método de cálculo para análisis. Los resultados indican que BaseScope proporciona una nueva herramienta poderosa para evaluar como los patrones de expresión en situ.

BaseScope ISH se llevó a cabo utilizando tres cepas de ratón: CD1 tipo salvaje ratones, C57BL/6J tipo salvaje ratones y ratones mutantes Nf123aIN/23aIN en el fondo de C57BL/6J, en qué exón 23a está incluido en todos los tipos de células como resultado del sitio del empalme de ingeniería las mutaciones14,15.
Como primer paso, el sistema de ensayo ISH ...

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del empalme alternativo de pre-ARNm. En concreto, proporciona un sistema de ensayo robusto y sensible para examinar patrones de empalme alternativos in situ en cortes de tejido. Con este método, el empalme alternativo se puede analizar simultáneamente en muchos subtipos que están contenidos en estructuras biológicas complejas, como el cerebro de un ratón.La principal ventaja de esta técnica es que utiliza sondas de unión de exones antiestáticas de choque en la hibridación in situ de ARNm para producir señales de hibridación específicas de isoformas. La tecnología de amplificación de señal de construcción aumenta la sensibilidad de la detección para proporcionar señales de hibridación robustas. La señal detectada fue la inclusión de exones que escapó de sondas específicas que se utilizan para calcular el porcentaje de empalme en los signos vitales en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón.En este estudio, el exón 23a de NF1 se utiliza como ejemplo para ilustrar el uso del sistema de ensayo. Sin embargo, el sistema se puede adaptar al análisis de patrones de expresión de muchos exones alternativos. Para iniciar la parafinación de la sección D del cerebro de ratón, llene dos platos de lavado con 250 mililitros de xileno.Y otros dos con 250 mililitros de etanol 100% dentro de una campana extractora. Inserte los portaobjetos de papel en una rejilla de lavado. A continuación, coloque la rejilla de lavado en un plato que contenga xileno e incube durante cinco minutos mientras mueve la rejilla hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces y repita con el segundo plato de xileno.Luego coloque la rejilla en un plato que contenga etanol e incube durante dos minutos con los mismos movimientos hacia arriba y hacia abajo y luego repita con el segundo plato de etanol. Para secar los portaobjetos, mueva la rejilla de la segunda placa de etanol y colóquela dentro de una incubadora a 60 grados centígrados durante cinco minutos. Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar una barrera de 0.75 pulgadas por 0.75 pulgadas alrededor de la sección de tejido y seque al aire durante tres minutos a temperatura ambiente.Enciende el horno de hibridación y ajusta la temperatura a 40 grados centígrados. Después de humedecer completamente el papel humidificador con agua destilada, colóquelo en una bandeja de control de humedad. A continuación, inserte la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación.Después de colocar los portaobjetos secos en un banco, cubra completamente las secciones de tejido de cada portaobjetos con cinco a ocho gotas de solución de peróxido de hidrógeno. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Golpee los portaobjetos sobre un papel absorbente, uno a la vez para eliminar la solución de peróxido de hidrógeno e inserte los portaobjetos en una rejilla de lavado.Sumerja la rejilla en un plato que contenga agua mientras la mueve hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para lavar los portaobjetos. Llene un vaso de precipitados de vidrio de un litro colocado en una placa caliente con 700 mililitros de tratamiento de eliminación de objetivos 1X y cúbralo con papel de aluminio. Inserte un termómetro a través de la cubierta de papel de aluminio y encienda la placa calefactora, a temperatura alta durante 10 a 15 minutos.Una vez que la temperatura del reactivo de recuperación alcance los 98 grados centígrados, ajuste la placa calefactora a baja temperatura para mantener una condición de ebullición suave. A continuación, retire con cuidado el papel de aluminio y coloque la rejilla dentro del vaso de precipitados. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio e incube durante 15 minutos.Use pinzas para transferir la rejilla del vaso de precipitados a un plato de lavado que contenga 200 mililitros de agua destilada e incube durante 15 segundos. Después de 15 segundos, coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga etanol al 100% e incube durante tres minutos. Retire la rejilla del plato y seque a 60 grados centígrados durante 10 minutos.Después de colocar los portaobjetos en una rejilla para manchas, cubra las secciones de tejido con cinco gotas de proteasa 3 por portaobjetos. Coloque con cuidado la rejilla en la bandeja de control de humedad e inserte la bandeja en el horno de hibridación e incube a 40 grados centígrados durante 30 minutos. Después de retirar la rejilla de la bandeja, golpee las correderas para eliminar el exceso de líquido e insértelas en una rejilla de lavado.Coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga agua destilada y mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para lavar los portaobjetos. Para prepararse para la hibridación in situ, incube las sondas y los reactivos AMP a temperatura ambiente durante 30 minutos. Inserte la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación y ajústela a 40 grados centígrados.Para la hibridación de la sonda, retire los portaobjetos de la rejilla de lavado y golpéelos para eliminar el exceso de líquido. Coloque los portaobjetos en un estante para manchas. Use un lápiz para etiquetar las láminas con el nombre de la sonda.Coloque tres portaobjetos de tejido cerebral cortados adyacentemente para hibridarlos con tres sondas de mitosis tipo uno de fibras neuronales diferentes juntas. Debido a que hay sondas específicas de isoformas muy diferentes, utilizo secciones de tejido cortadas adyacentes. Es fundamental que estas secciones se traten exactamente igual en los pasos de hibridación, amplificación y detección de señales para garantizar la precisión del empalme porcentual en el cálculo.Cubra las secciones de tejido con cuatro gotas de sonda por sección, un portaobjetos a la vez para evitar que se sequen las secciones. A continuación, coloque la rejilla de manchas en la bandeja de control de humedad e insértela en el horno a 40 grados centígrados durante dos horas. A continuación, coloque una rejilla de lavado en un plato de lavado lleno de 200 mililitros de tampón de lavado 1X.A continuación, golpee cada portaobjetos, uno a la vez, sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. E inserte inmediatamente cada corredera en la rejilla de lavado. Incube a temperatura ambiente durante dos minutos en un plato lleno de tampón de lavado fresco mientras mueve la rejilla hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces y luego repita el lavado en un plato nuevo.Para amplificar la señal, golpee cada portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de lavado y colóquelos en una rejilla para manchas. Cubra la sección de tejido de cada portaobjetos con cuatro gotas de reactivo AMP zero. A continuación, coloque la rejilla en la bandeja de control de humedad, inserte la bandeja en el horno e incube a 40 grados centígrados durante 30 minutos.Lave el portaobjetos dos veces con tampón de lavado como se hizo anteriormente en este experimento. Repita el paso de amplificación de señal con los reactivos AMP del uno al seis, como se describe en el protocolo de texto, y lave los portaobjetos después de cada paso. Para la detección de señales, retire el exceso de tampón de lavado de los portaobjetos dando golpecitos y colóquelos en un estante de manchas.A continuación, mezcle dos microlitros de rojo rápido B con 120 microlitros de rojo rápido A en un tubo de microcentrífuga. Agregue la solución a las secciones de pañuelo en cada portaobjetos para cubrirlas por completo. Coloque la rejilla de manchas en la bandeja de control de humedad, cubra la bandeja e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, retire la solución e inserte los portaobjetos en una rejilla de lavado. Coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga agua del grifo para lavar los portaobjetos y repita el lavado. Después del segundo lavado, golpee un papel absorbente para eliminar el exceso de agua.A continuación, coloque la rejilla en un plato que contenga una solución de tinción de hematoxilina al 50%. Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo varias veces. E incubar durante dos minutos a temperatura ambiente.Transfiera la rejilla a un plato de lavado que contenga agua del grifo. Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo cinco veces y repita el lavado hasta que los portaobjetos se aclaren, mientras que las secciones de pañuelos permanecen moradas. A continuación, transfiera la rejilla a un plato que contenga agua con 0,02% de amoníaco.Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo de dos a cuatro veces hasta que las secciones se vuelvan azules. Lave los portaobjetos con agua del grifo de tres a cinco veces en el plato para teñir. A continuación, coloque la rejilla dentro de una incubadora e incube durante 15 minutos a 60 grados centígrados para secar los portaobjetos.Cuando esté completamente seco, agregue una gota de medio de montaje en cada portaobjetos para cubrir la rebanada. Luego, coloque con cuidado un cubreobjetos de 24 por 50 milímetros sobre las secciones de tejido en cada portaobjetos. Después de secar los portaobjetos al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente, proceda con la recopilación de datos.Para calcular el porcentaje empalmado o el valor PSI para el exón 23a, se cuenta el número de células y puntos en tres subregiones de la corteza y el hipocampo CA3. El ensayo de hibridación in situ de ARN se realiza en secciones del cerebro de ratones de tipo salvaje CD1 utilizando tres sondas específicas NF1 diferentes. Los puntos rojos punteados observados en las secciones de la corteza y el hipocampo indican señales positivas por sondas NF1 totales, específicas de inclusión y específicas de omisión.A continuación, se cuentan las señales ISH de las tres sondas y se utilizan para calcular el PSI. El ensayo de hibridación in situ de ARN se realiza en la corteza de ratones de tipo salvaje C57 negro 6J y ratones mutantes C57 negro 6J en los que el exón 23a está incluido en todos los tipos de células. Los puntos rojos punteados observados en la corteza de los ratones de tipo salvaje C57 Black 6J indican señales positivas por NF1 total, inclusión específica y omisión específica.En ratones mutantes negros 6J C57, se obtienen señales similares mediante sondas totales y específicas de inclusión de NF1. Sin embargo, no se detecta ninguna señal cuando se utiliza la omisión de una sonda específica, lo que indica que dos sondas dirigidas a la inclusión o la omisión de exones son muy específicas. Debido a que el etiquetado multicolor en los mismos portaobjetos de tejido aún no está disponible para este procedimiento, se utilizan diferentes sondas en los diferentes portaobjetos de tejido.Para obtener los valores precisos de empalme porcentual, es importante utilizar portaobjetos cortados adyacentemente y tratar los portaobjetos exactamente de la misma manera a lo largo de este procedimiento. Complementando este procedimiento están las medidas como la inmunohistoquímica, que se puede realizar para responder preguntas adicionales sobre la localización y la función de las isoformas de empalme expresadas diferencialmente.

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Investigación

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Genética

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Este video demuestra la detección de la síntesis de ARN del receptor de serotonina utilizando sondas de oligonucleótidos en tejido cerebral de rata afectado por el síndrome de serotonina. El protocolo incluye pretratamiento de tejidos, hibridación de sondas y detección enzimática para visualizar y cuantificar la expresión del ARN del receptor de serotonina bajo un microscopio.

Hibridación in situ mediante sondas de oligonucleótidos para estudiar la expresión de ARN en secciones de cerebro de rata

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

Establecimos un ensayo de hibridación in situ dúplex para mapear las isoformas de los receptores de insulina IR-A e IR-B en el plexo coroideo murino, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. Este enfoque de alta resolución revela la expresión específica de isoformas, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la señalización de la insulina en el cerebro y posibles terapias dirigidas a isoformas para trastornos neurológicos.

Visualización precisa de los receptores de insulina A y B en el cerebro murino con un ensayo de hibridación in situ de ARN

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Aprenda a detectar empalmes alternativos del pre-ARNm en secciones de cerebro de ratón mediante hibridación in situ con sondas de unión a unión de exones y amplificación de señal. Este método permite analizar patrones de empalme en múltiples subtipos celulares simultáneamente.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación (Video) | JoVE Journal

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

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