Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del empalme alternativo de pre-ARNm. En concreto, proporciona un sistema de ensayo robusto y sensible para examinar patrones de empalme alternativos in situ en cortes de tejido. Con este método, el empalme alternativo se puede analizar simultáneamente en muchos subtipos que están contenidos en estructuras biológicas complejas, como el cerebro de un ratón.

La principal ventaja de esta técnica es que utiliza sondas de unión de exones antiestáticas de choque en la hibridación in situ de ARNm para producir señales de hibridación específicas de isoformas. La tecnología de amplificación de señal de construcción aumenta la sensibilidad de la detección para proporcionar señales de hibridación robustas. La señal detectada fue la inclusión de exones que escapó de sondas específicas que se utilizan para calcular el porcentaje de empalme en los signos vitales en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón.

En este estudio, el exón 23a de NF1 se utiliza como ejemplo para ilustrar el uso del sistema de ensayo. Sin embargo, el sistema se puede adaptar al análisis de patrones de expresión de muchos exones alternativos. Para iniciar la parafinación de la sección D del cerebro de ratón, llene dos platos de lavado con 250 mililitros de xileno.

Y otros dos con 250 mililitros de etanol 100% dentro de una campana extractora. Inserte los portaobjetos de papel en una rejilla de lavado. A continuación, coloque la rejilla de lavado en un plato que contenga xileno e incube durante cinco minutos mientras mueve la rejilla hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces y repita con el segundo plato de xileno.

Luego coloque la rejilla en un plato que contenga etanol e incube durante dos minutos con los mismos movimientos hacia arriba y hacia abajo y luego repita con el segundo plato de etanol. Para secar los portaobjetos, mueva la rejilla de la segunda placa de etanol y colóquela dentro de una incubadora a 60 grados centígrados durante cinco minutos. Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar una barrera de 0.75 pulgadas por 0.75 pulgadas alrededor de la sección de tejido y seque al aire durante tres minutos a temperatura ambiente.

Enciende el horno de hibridación y ajusta la temperatura a 40 grados centígrados. Después de humedecer completamente el papel humidificador con agua destilada, colóquelo en una bandeja de control de humedad. A continuación, inserte la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación.

Después de colocar los portaobjetos secos en un banco, cubra completamente las secciones de tejido de cada portaobjetos con cinco a ocho gotas de solución de peróxido de hidrógeno. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Golpee los portaobjetos sobre un papel absorbente, uno a la vez para eliminar la solución de peróxido de hidrógeno e inserte los portaobjetos en una rejilla de lavado.

Sumerja la rejilla en un plato que contenga agua mientras la mueve hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para lavar los portaobjetos. Llene un vaso de precipitados de vidrio de un litro colocado en una placa caliente con 700 mililitros de tratamiento de eliminación de objetivos 1X y cúbralo con papel de aluminio. Inserte un termómetro a través de la cubierta de papel de aluminio y encienda la placa calefactora, a temperatura alta durante 10 a 15 minutos.

Una vez que la temperatura del reactivo de recuperación alcance los 98 grados centígrados, ajuste la placa calefactora a baja temperatura para mantener una condición de ebullición suave. A continuación, retire con cuidado el papel de aluminio y coloque la rejilla dentro del vaso de precipitados. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio e incube durante 15 minutos.

Use pinzas para transferir la rejilla del vaso de precipitados a un plato de lavado que contenga 200 mililitros de agua destilada e incube durante 15 segundos. Después de 15 segundos, coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga etanol al 100% e incube durante tres minutos. Retire la rejilla del plato y seque a 60 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de colocar los portaobjetos en una rejilla para manchas, cubra las secciones de tejido con cinco gotas de proteasa 3 por portaobjetos. Coloque con cuidado la rejilla en la bandeja de control de humedad e inserte la bandeja en el horno de hibridación e incube a 40 grados centígrados durante 30 minutos. Después de retirar la rejilla de la bandeja, golpee las correderas para eliminar el exceso de líquido e insértelas en una rejilla de lavado.

Coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga agua destilada y mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para lavar los portaobjetos. Para prepararse para la hibridación in situ, incube las sondas y los reactivos AMP a temperatura ambiente durante 30 minutos. Inserte la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación y ajústela a 40 grados centígrados.

Para la hibridación de la sonda, retire los portaobjetos de la rejilla de lavado y golpéelos para eliminar el exceso de líquido. Coloque los portaobjetos en un estante para manchas. Use un lápiz para etiquetar las láminas con el nombre de la sonda.

Coloque tres portaobjetos de tejido cerebral cortados adyacentemente para hibridarlos con tres sondas de mitosis tipo uno de fibras neuronales diferentes juntas. Debido a que hay sondas específicas de isoformas muy diferentes, utilizo secciones de tejido cortadas adyacentes. Es fundamental que estas secciones se traten exactamente igual en los pasos de hibridación, amplificación y detección de señales para garantizar la precisión del empalme porcentual en el cálculo.

Cubra las secciones de tejido con cuatro gotas de sonda por sección, un portaobjetos a la vez para evitar que se sequen las secciones. A continuación, coloque la rejilla de manchas en la bandeja de control de humedad e insértela en el horno a 40 grados centígrados durante dos horas. A continuación, coloque una rejilla de lavado en un plato de lavado lleno de 200 mililitros de tampón de lavado 1X.

A continuación, golpee cada portaobjetos, uno a la vez, sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. E inserte inmediatamente cada corredera en la rejilla de lavado. Incube a temperatura ambiente durante dos minutos en un plato lleno de tampón de lavado fresco mientras mueve la rejilla hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces y luego repita el lavado en un plato nuevo.

Para amplificar la señal, golpee cada portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de lavado y colóquelos en una rejilla para manchas. Cubra la sección de tejido de cada portaobjetos con cuatro gotas de reactivo AMP zero. A continuación, coloque la rejilla en la bandeja de control de humedad, inserte la bandeja en el horno e incube a 40 grados centígrados durante 30 minutos.

Lave el portaobjetos dos veces con tampón de lavado como se hizo anteriormente en este experimento. Repita el paso de amplificación de señal con los reactivos AMP del uno al seis, como se describe en el protocolo de texto, y lave los portaobjetos después de cada paso. Para la detección de señales, retire el exceso de tampón de lavado de los portaobjetos dando golpecitos y colóquelos en un estante de manchas.

A continuación, mezcle dos microlitros de rojo rápido B con 120 microlitros de rojo rápido A en un tubo de microcentrífuga. Agregue la solución a las secciones de pañuelo en cada portaobjetos para cubrirlas por completo. Coloque la rejilla de manchas en la bandeja de control de humedad, cubra la bandeja e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire la solución e inserte los portaobjetos en una rejilla de lavado. Coloque la rejilla en un plato de lavado que contenga agua del grifo para lavar los portaobjetos y repita el lavado. Después del segundo lavado, golpee un papel absorbente para eliminar el exceso de agua.

A continuación, coloque la rejilla en un plato que contenga una solución de tinción de hematoxilina al 50%. Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo varias veces. E incubar durante dos minutos a temperatura ambiente.

Transfiera la rejilla a un plato de lavado que contenga agua del grifo. Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo cinco veces y repita el lavado hasta que los portaobjetos se aclaren, mientras que las secciones de pañuelos permanecen moradas. A continuación, transfiera la rejilla a un plato que contenga agua con 0,02% de amoníaco.

Mueva la rejilla hacia arriba y hacia abajo de dos a cuatro veces hasta que las secciones se vuelvan azules. Lave los portaobjetos con agua del grifo de tres a cinco veces en el plato para teñir. A continuación, coloque la rejilla dentro de una incubadora e incube durante 15 minutos a 60 grados centígrados para secar los portaobjetos.

Cuando esté completamente seco, agregue una gota de medio de montaje en cada portaobjetos para cubrir la rebanada. Luego, coloque con cuidado un cubreobjetos de 24 por 50 milímetros sobre las secciones de tejido en cada portaobjetos. Después de secar los portaobjetos al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente, proceda con la recopilación de datos.

Para calcular el porcentaje empalmado o el valor PSI para el exón 23a, se cuenta el número de células y puntos en tres subregiones de la corteza y el hipocampo CA3. El ensayo de hibridación in situ de ARN se realiza en secciones del cerebro de ratones de tipo salvaje CD1 utilizando tres sondas específicas NF1 diferentes. Los puntos rojos punteados observados en las secciones de la corteza y el hipocampo indican señales positivas por sondas NF1 totales, específicas de inclusión y específicas de omisión.

A continuación, se cuentan las señales ISH de las tres sondas y se utilizan para calcular el PSI. El ensayo de hibridación in situ de ARN se realiza en la corteza de ratones de tipo salvaje C57 negro 6J y ratones mutantes C57 negro 6J en los que el exón 23a está incluido en todos los tipos de células. Los puntos rojos punteados observados en la corteza de los ratones de tipo salvaje C57 Black 6J indican señales positivas por NF1 total, inclusión específica y omisión específica.

En ratones mutantes negros 6J C57, se obtienen señales similares mediante sondas totales y específicas de inclusión de NF1. Sin embargo, no se detecta ninguna señal cuando se utiliza la omisión de una sonda específica, lo que indica que dos sondas dirigidas a la inclusión o la omisión de exones son muy específicas. Debido a que el etiquetado multicolor en los mismos portaobjetos de tejido aún no está disponible para este procedimiento, se utilizan diferentes sondas en los diferentes portaobjetos de tejido.

Para obtener los valores precisos de empalme porcentual, es importante utilizar portaobjetos cortados adyacentemente y tratar los portaobjetos exactamente de la misma manera a lo largo de este procedimiento. Complementando este procedimiento están las medidas como la inmunohistoquímica, que se puede realizar para responder preguntas adicionales sobre la localización y la función de las isoformas de empalme expresadas diferencialmente.