Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la microscopía de escaneo láser confocal 3D para la obtención de imágenes de lapso de tiempo para evaluar cualitativa y cuantitativamente la biocompatibilidad in vitro de los composites dentales. Esto se logra tomando primero muestras esféricas de composite dental sin curar en el segundo paso. Los fibroblastos gingivales humanos se cultivan en presencia o ausencia de estos extractos compuestos, y luego las células se marcan con tinción de muertos vivos.

A continuación, se generan imágenes de mapa de los cultivos celulares y se crean imágenes superpuestas para las áreas de interés. En última instancia, las diferencias en tiempo real en el comportamiento celular que ocurren en presencia o ausencia de los compuestos probados se pueden monitorear de acuerdo con los cambios en las señales fluorescentes verdes o rojas observadas en las imágenes. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes son que permite la monitorización en tiempo real de células vivas sin inducir cambios en la estructura celular.

No se requieren pasos de fijación o secado después de la tinción celular o antes de la observación por lapso de tiempo. Para preparar el extracto de composite, comience utilizando un soporte a medida con un radio de dos milímetros para formar muestras esféricas del composite dental sin curar. Transfiera las muestras a pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de cultivo, teniendo cuidado de dejar algunos pocillos con medios solos para cultivos celulares de control, y luego coloque una lámpara LED con una intensidad de 1070 milivatios centímetros cuadrados dentro de 0,5 milímetros de las muestras.

Se curaron las muestras durante 40 segundos para simular el contacto temporal entre los dientes y el composite dental descuidado, y luego se incubaron las muestras de composite durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio cada tres días y las celdas de paso cada cinco días. Luego, después de que el cultivo haya alcanzado la cofluidez, recoja las células y hágalas girar durante cinco minutos a 90 veces G y a 37 grados Celsius.

Vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo y, después de contar las células, siembre la suspensión celular a una densidad celular de 2,5 veces 10 a la cuarta celda por mililitro en un sistema de portaobjetos de cámara durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. A la mañana siguiente, reemplace el medio en dos pocillos del portaobjetos de la cámara con un mililitro de los extractos compuestos probados, y vuelva a colocar el portaobjetos en la incubadora para obtener imágenes de las células por confocal. Imágenes de lapso de tiempo.

En primer lugar, etiquete las células compuestas cocultivadas y de control con tinción de citotoxicidad muerta viva para células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 15 minutos después de la tinción, coloque el portaobjetos de la cámara en la oscuridad en la cámara confocal integrada en condiciones de cultivo celular y caliente los láseres de 473 nanómetros y 559 nanómetros. A continuación, utilice un detector con un espectro recientemente desarrollado para establecer automáticamente las condiciones de imagen para el láser de 473 nanómetros.

Utilice las funciones de encuadre y zoom para seleccionar el área de interés y, a continuación, elija el modo de observación. Seleccione hasta cinco tipos de modos de observación, incluido el Zack de lapso de tiempo y el área múltiple según sea necesario, y luego capture rápidamente cinco imágenes de mapa con un láser de 473 nanómetros bajo el objetivo de 10 x tanto para la muestra de prueba como para las celdas de control cuando se hayan adquirido las imágenes deseadas. Cambie al láser de 559 nanómetros y capture imágenes de la célula en el segundo fluorescente como se acaba de demostrar.

Alternativamente, superponga las imágenes fluorescentes y de contraste de luz utilizando el punto seleccionado en la pantalla en vivo del X 60 para observar el almacenamiento de imágenes en vivo. Las imágenes cartográficas en el formato de imagen Olympus para el análisis de señales y las imágenes de proyección máxima son de 24 bits por píxel. A continuación, los archivos TIFF utilizan las diferentes herramientas de análisis para medir el perfil de intensidad de la señal y la relación de intensidad entre los dos canales fluorescentes.

Por último, analizar las diferencias en la señalización de las células fluorescentes entre los dos grupos con el software adecuado. En estas imágenes cartográficas de células vivas con tinción TED en medios solos o expuestos a extracto compuesto, no se observaron diferencias en la viabilidad de las células a los 15 minutos del período de lapso de tiempo. Aquí, las imágenes de proyección máxima de las células de control muestran el destino magnificado de las células dentro de los primeros 15 minutos y cinco horas más tarde, al final del período de lapso de tiempo, como se observó, no hubo variación significativa en la fluorescencia dentro de las células de control durante el período de incubación.

Las células expuestas a la contracción extra baja ELS asumieron una morfología de huso similar a la de las células de control, pero mostraron una ligera disminución en la señal fluorescente verde y un aumento muy leve en la fluorescencia roja al final del período de lapso de tiempo. El perfil de intensidad de las células teñidas se ilustra en estos gráficos, en los que se midieron las intensidades de emisión de una fluorescencia del homodímero de endotelio de calcio en células expuestas de control y compuestas a intervalos de una hora durante un máximo de cinco horas. No se observaron diferencias significativas en la señalización entre las dos culturas.

En la tabla se muestran las relaciones de viabilidad para las células de control y compuestas expuestas. En presencia del compuesto probado, se encontró que el porcentaje de células vivas disminuyó ligeramente del 100 al 93,9% después de una hora de contacto después de cinco horas. Se observaron diferencias significativas en la viabilidad celular entre el ELS compuesto ensayado, la contracción extra baja y los cultivos celulares de control negativo a pesar de la no citotoxicidad del compuesto.

Los datos actuales ponen de manifiesto el uso de la imagen confocal time-lapse como un método preciso y sensible para evaluar el comportamiento de los fibroblastos gen en contacto con los composites dentales después de su desarrollo. Este método es una forma privada para que los investigadores en el campo de la toxicología exploren la citotoxicidad y la evaluación de riesgos de materiales dentales, medicamentos, sustancias químicas y otros dispositivos médicos.