Name: Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la citocompatibilidad de composites dentales mediante microscopía confocal 3D en tiempo real. Este método permite monitorear fibroblastos gingivales humanos sin alterar la estructura celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Las empresas Saremco Dental Switzerland y Olympus Microsystems France están muy agradecidas por su apoyo financiero. Saremco Dental también es reconocida por la generosa donación de los composites dentales ELS de contracción extra baja. Los autores también desean expresar su agradecimiento al Dr. Simon Banks del departamento de Química del University College London, por su ayuda en la revisión del inglés.

El protocolo consta de tres pasos principales: la primera etapa comprende la preparación de extracto de material compuesto en medios de cultivo; el segundo se refiere la Primaria Humanos fibroblastos gingivales (HGF) de cultivo de células, el contacto de las células con los extractos compuestos y tinción de células; la tercera etapa consiste en la formación de imágenes confocal y el análisis de la señal fluorescente. Para tejidos gingivales tomando, el protocolo fue aprobado en cumplimiento de la legislación francesa, el consentimiento informado y el comité de ética local. 1. Extractos Compuesto Preparación Utilice medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) como el medio de elución. Asegúrese de que la relación entre el área superficial de las muestras y el volumen de medio de extracción está en el nivel más bajo de los requisitos de la norma ISO 10993/12. El procedimiento se describe recientemente 11 y esbozó brevemente a continuación: <ol><li> Formar muestras esféricas de material compuesto no curado dental utilizando una retención a medidaer. El tamaño titular es 2 mm de radio, que está de acuerdo con la profundidad de curado generalmente se recomienda en el tratamiento clínico oral. </li><li> Preparar pocillos de la placa, cada uno conteniendo 1 ml de medio de cultivo (DMEM), con una mezcla de 5% de penicilina / estreptomicina y 1% de la anfotericina pero sin suero bovino fetal (FBS). </li><li> Muestras de curación en el medio DMEM que contiene bien utilizando una lámpara de luz LED con un 1,070 mW cm -2 intensidad (λ = 465-475 nm) durante 40 segundos. Asegúrese de que la distancia entre la punta de curado y las muestras está en el intervalo de 0,5 mm. Utilice este modo de curado para simular el contacto temporal entre el diente y el material compuesto no curado dental. En la situación clínica, el contacto se produce cuando el compuesto de restauración se coloca en la cavidad oral. </li><li> Incubar las muestras (composites especímenes en medio DMEM) a 37 ° C en ambiente humidificado de 5% de CO 2 en el aire. Incubar medio DMEM (sin muestras compuestas) para las células de control en las mismas condiciones. </li></ol> 2. HGF Cultivo Celular, Compuesto Extractos Pruebas y tinción de las células <ol><li> Crecimiento y mantenimiento de cultivos de células Aislar fibroblastos gingivales humanos de biopsias de tejidos gingivales sanos de pacientes tomadas durante las extracciones de ortodoncia de rutina. <ol><li> Cultivar fibroblastos gingivales humanos en DMEM en presencia de 10% de FBS, 5% de penicilina / estreptomicina y 1% anfotericina B. mantener las células a 37 ° C en una incubadora bajo una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire. </li><li> Medianas cambian cada 3 días, y de paso las células cada 5 días. Después de alcanzar la confluencia, las células de la cosecha por tripsinización. </li><li> Centrifugar las células a 90 xg durante 5 minutos y volver a suspender en el medio de cultivo. Recuento de células con un contador de células automatizado de mano cetro. </li><li> Seed suspensión de células a una densidad celular de 2,5 x 10 4 células / ml en un sistema de cámara de diapositivas. Permitir la incubación de las células durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de 5%. </li></ol></li><li> La adición de extractos de compuestos a las células en cultivo <ol><li> Reemplazar los medios de comunicación de dos pocillos de la cámara de diapositivas por 1 ml de los extractos compuestos ensayados (después de 24 h de incubación). </li><li> Mantener los dos pozos restantes (células de control) en las mismas condiciones. </li><li> Incubar el portaobjetos cámara que contiene los cuatro pozos a 37 ° C en la incubadora, en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire. </li></ol></li><li> La tinción fluorescente Utilice el Live / Dead mancha de citotoxicidad para las células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: el kit proporciona un ensayo fluorescente de dos colores rápida para determinar la viabilidad de las células en una población basada en la integridad de la membrana plasmática y la actividad esterasa. La mancha distinguir en vivo de las células dañadas por el etiquetado simultáneamente con verde fluorescente calceína-AM para indicar la actividad de la esterasa intracelular y de etidio rojo fluorescente homodímero-1 (EthD-1) para indicar la pérdida de membrane integridad. <ol><li> Preparar una solución de trabajo de los dos reactivos de tinción que contienen 2 mM de calceína AM y 4 M EthD-1 (concentración final notificado para ser adecuado para la tinción de fibroblastos). Añadir la mancha para las células adherentes cultivadas en la presencia o ausencia de los extractos compuestos seleccionados. </li><li> Observar directamente y rápidamente las poblaciones de células teñidas en el menos 15 minutos después de la tinción y por medio de la proyección de imagen de lapso de tiempo. No centrífuga y no fixe las células teñidas. </li></ol></li></ol> Lapso de tiempo 3. confocal de imágenes y Análisis de Señales El sistema utilizado está equipado con un cuatro unidades de láser de diodo y una imagen multi-manchado durante un máximo de cuatro tintes fluorescentes para cada espécimen. El sistema puede realizar una imagen de mapeo (magnificación 10X) que da una visión general de la muestra de ensayo en la que uno se puede mover para observar una región de interés (aumento 600X). <ol><li> Proyección de imagen Lapso de tiempo <ol><li> Coloca las specimens (la diapositiva cámara que contiene las muestras teñidas) en el cuarto oscuro de la incubadora integrada confocal (37 ° C, 5% de CO 2 y la atmósfera húmeda). </li><li> Seleccione los láseres correspondientes. Utilice las dos fuentes de láser 473 nm (15 mW) y 559 nm (18 mW) para excitar Calceína y EthD-1. </li><li> Utilice un modo de dos secuencial para adquirir imágenes a través de secuencias de línea y sin interferencia en la imagen con los dos colorantes fluorescentes usados. </li><li> Utilice un detector con un espectro recientemente desarrollado para ajustar automáticamente las condiciones de conformidad con el colorante de fluorescencia en la unidad de exploración. </li><li> Optimizar los anchos de banda de la fluorescencia detectada para cada canal al máximo. Registre todas las adquisiciones de forma secuencial para evitar posibles cruz-parlante. </li><li> Seleccione las condiciones de formación de imágenes más adecuados basados ​​en la selección colorante fluorescente utilizando el software de adquisición. </li><li> Adquirir una imagen de mapa que se crea de forma automática desde el centro en forma de espiral,con el área de interés de ser seleccionado para un examen más fácilmente. </li><li> Seleccione el modo de observación. Seleccione hasta cinco tipos de modos de observación, incluyendo time-lapse, Z-pila, y multi-zona, según sea necesario. Use una combinación de modos de time-lapse Z-pila y en el presente estudio y completar rápidamente la captura de imágenes, </li><li> Cambiar y cambiar el tinte fluorescente. Alternativamente, superponer el fluorescente y las imágenes de contraste de luz entre sí. Observe la imagen en vivo usando el punto seleccionado en la pantalla del mapa inferior izquierdo. </li><li> Determinar el área de formación de imágenes mediante el uso de la formulación y zoom funciones. Opcionalmente, cambiar entre las pantallas para cada tipo de colorante fluorescente. NOTA: El microscopio usado en este protocolo tiene la misma funcionalidad que un alto confocal convencional en un diseño compacto. El microscopio está equipado con objetivos de inmersión en agua invertidas que se adaptan de forma óptima para estable time-lapse de células vivas con una incubadora integrado simplificado. </lyo&gt; </ol></li><li> Análisis de la señal y la cuantificación <ol><li> Utilice el software de imágenes para cuantificar la señal de fluorescencia. Obtener cinco imágenes de mapa con el objetivo de 10X, tanto para la muestra y la celda de control probado. </li><li> Obtenido 1.024 × 1.024 píxeles imágenes regulares, con un tamaño de 0.231 × 0.231 píxeles micras micras. Almacenar imágenes en formato de imagen Olympus (OIF) para el análisis de señales. Este formato permite almacenar varios ajustes de los parámetros y las imágenes juntos. Utilizar diferentes herramientas de análisis (medición de perfil de intensidad, relación de intensidad entre los dos canales utilizados). </li><li> Guarde las imágenes de proyección máximas como archivos TIFF de 12 bits / pixel. </li><li> Preforma análisis estadísticos utilizando el software R comandante. Analizar las diferencias utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con una prueba de repetición. Informe de resultados de la desviación estándar como media (± DE) y la significación estadística de p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos, no tienen nada que revelar.

Comportamiento del material biocompatibilidad es el parámetro más requisito previo para ser evaluados antes de su uso médico. Las normas internacionales cubren los dispositivos médicos ISO 10993 33 y específicamente los materiales dentales ISO 7405 34. La ausencia de los efectos tóxicos a las células circundantes es la norma fundamental en la evaluación de la biocompatibilidad de estos materiales. Es por eso que las pruebas de citotoxicidad tiene tal importancia en la evaluación de la biocompatibilidad material dental 35-37. La ISO sugirió métodos de prueba podrían basarse en la actividad metabólica o integridad de la membrana. Puntos finales seleccionados deben seguir condiciones específicas para la clasificación de efectos adversos inducidos por un material de ensayo con el fin de minimizar el tiempo y el costo de los ensayos de evaluación. El método actual de investigación (imágenes por lapso de tiempo confocal 3D) es la integridad de la membrana basada. La evaluación de la citotoxicidad a través de este punto final parece ser un valioso marcador de biocompa celulartibilidad con materiales probados y que es también la ISO aprobó punto final. In vitro pruebas están diseñadas para determinar cómo una muestra de material afecta a un tipo de célula particular. El ensayo colorimétrico MTT fue descrito originalmente por Mossman (1983) como un método útil para la medición de la citotoxicidad in vitro y la proliferación celular. La prueba de MTT se basa en la conversión de la sal de tetrazolio en cristales de formazán por las células activas, que determina la actividad mitocondrial. Esto se puede traducir por bajos viabilidad 38. Gupta y colaboradores informaron de que la prueba de MTT es el método más ampliamente utilizado para medir la citotoxicidad de las resinas compuestas. Deshidrogenasa succínico y respuestas de fosfatasa alcalina también se han utilizado para el mismo propósito 39. Sin embargo, las células de destino no puede ser objeto de seguimiento, puesto que el ensayo de MTT requiere matar las células en cada punto de tiempo de medición. Con el fin de seguir más de cerca el comportamiento de las células teñidas en el estudio actual, diSe llevó a cabo la observación de células vivas rect, gracias a imágenes CLSM lapso de tiempo combinado con una tinción protocolo corto, análisis de imágenes automatizado y cuantificación de la señal fluorescente. Materiales compuestos dentales vienen en estrecho contacto con los tejidos orales, especialmente células de la encía y la pulpa. Los fibroblastos serían el blanco de los componentes liberados de estos compuestos restauradores 40-41. Además, varios estudios han informado de que las células inmortalizadas y células primarias pueden tener diferentes respuestas celulares en contacto con biomateriales. Se encontraron células primarias para ser más apropiada para evaluar los efectos biomateriales 42. Esto explica el uso de células de fibroblastos gingivales humanos primarios como modelo de células para la evaluación de la citotoxicidad del material compuesto dental probada en el estudio actual. El potencial toxicidad de las sustancias liberadas a partir de composite dental ha sido ampliamente estudiado 43-44. A fin de evaluar tél potencial citotóxico de los materiales, dos células modelo de contacto se podrían realizar. En el sistema modelo de contacto directo el material se coloca directamente con las células diana, mientras que en el sistema de contacto indirecto, las células diana están en contacto con eluye de medios biológicos. En las aplicaciones clínicas y para los procedimientos de restauración, compuesto dental se colocan en contacto indirecto con los tejidos gingivales. Por esta razón, el protocolo experimental actual se centra en el sistema de contacto indirecto con fibroblastos gingivales humanos (células en presencia de los extractos compuestos ensayados). Como se informó anteriormente por Dahl y colaboradores, las respuestas de citotoxicidad se clasificaron como graves (&lt;30%), moderada (30-60%), leve (60-90%) o no citotóxico (&gt; 90%), basado en la actividad relativa a los valores obtenidos para los controles 45. Por lo tanto, según este ranking, ya la luz de los resultados obtenidos (Tabla 1), compuesto ELS adicional baja contracción podría ser clasificado como very ligeramente citotóxica y mostró un comportamiento comparable con las células control durante todo el período de lapso de tiempo. Utilizando el mismo método de investigación, precisamente, los resultados de este estudio podrían ser comparados con los de un estudio recientemente publicado. El extra de compuesto de baja contracción ELS demostró la biocompatibilidad superior en comparación con los dos compuestos ensayados previamente utilizados para la misma aplicación clínica que es la restauración directa 11. Otros estudios son aún necesarios para establecer una comparación más completa. Al decidir que la citotoxicidad de ensayo para aprobar una evaluación específica de punto final, es importante entender las ventajas y las limitaciones de cada ensayo. El propósito principal de formación de imágenes confocal es lograr una arquitectura de 3-D de las células y órganos. La técnica es capaz de revelar no sólo la superficie de una muestra, sino también su subsuelo. El protocolo se describe en este documento pone de relieve el uso de 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso, como sensitiva método para evaluar el comportamiento de biocompatibilidad in vitro de un material compuesto dental. Sin embargo, a fin de evitar las limitaciones encontradas en este trabajo, estaciones de trabajo anti-vibración podrían ser utilizados con el fin de permitir que la imagen más estable y más largo lapso de tiempo; el tablero de la mesa podría aislar el sistema confocal utilizado por los efectos perjudiciales que las vibraciones en el laboratorio pueden causar. Además, los materiales que se utilizarán en la cavidad oral idealmente debería ser inocuo para los tejidos gingivales y no deben contener sustancias que podrían causar toxicidad sistémica. De acuerdo con la metodología utilizada y los resultados obtenidos en el presente estudio se puede concluir que el compuesto probado (ELS adicional baja contracción) no es citotóxica en las presentes condiciones experimentales. Como el método MBRC sensibilidad puede dar la velocidad inicial de células viables, otras posibilidades podrían preverse para evaluar más puntos finales. En particular, como se ha informado recientemente que los monómeros compuestos afectan a las células thrOugh especies reactivas de oxígeno (ROS) 46- 48, se necesita más investigación para evaluar si los hay correlaciones entre la citotoxicidad redes y la producción de ROS señalización. El futuro protocolo podría ser diseñado para evaluar simultáneamente la producción de ROS (H 2 O 2 y / o O 2 - tinción) y la relación de la citotoxicidad (tinción en vivo / muerto) utilizando imágenes CLSM lapso de tiempo.

Una de las principales normas citadas en las recomendaciones de la ISO para definir biocompatibilidad es la ausencia de toxicidad de material a las células. Compuestos dentales a base de resina pueden liberar componentes de la matriz resinosa, que podría ser debido inicialmente a la polimerización parcial, y / o más tarde debido a procesos de degradación con el tiempo 1-4. Estos componentes liberados entrar en contacto con los tejidos orales y pueden tener varios inconvenientes como las reacciones de urticaria y mucosas 5, el desarrollo de las reacciones alérgicas y de hipersensibilidad en los pacientes 6, modificaciones de la morfología de fibroblastos gingivales y la reducción en la proteína colágeno de tipo I 7, de inmunosupresión o inmunoestimulación en mitógeno impulsada por la proliferación de los linfocitos T purificados y células de bazo 8 y el daño del ADN en los fibroblastos gingivales humanos primarios, lo que subraya su potencial genotóxico 9. Muchos parámetros pueden afectar la toxicidad compuesto dental, como la sombra de la composite, la luz de curado, la composición química del monómero de la resina, el relleno y el grado de conversión de 10 13. Desde potencial tóxico in vitro de materiales puede predecir en situaciones in vivo y podría ser comparado con situaciones clínicas por el estudio de algunas variables relevantes. La citotoxicidad de compuestos dentales y sus componentes han sido ampliamente evaluado utilizando sistemas de cultivo celular 14- 16. Estos sistemas in vitro se han desarrollado para evaluar compuestos dental biocompatibilidad en términos de: crecimiento celular, y la apoptosis celular utilizando THP-1monocytes como las células 17, la citotoxicidad en fibroblastos gingivales humanos 18, el potencial inflamatorio en queratinocitos HaCaT como las células 2, la funcionalidad de células odontoblast- como 23 MDPC células 19, la reducción de los niveles de ARN total, y aumento significativo en la inducción de la apoptosis de queratinocitos gingival humano 20 yDaño en el ADN en fibroblastos gingivales y pulpa de células 21. Diferentes metodologías se sugieren para investigar la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales. Ensayos colorimétricos, que implican colorantes específicos y medidas de adsorción de luz, siguen siendo los más utilizados, debido a su relativa simplicidad y bajo costo 22- 26. Análisis de Microscopía de contraste de luz con frecuencia consume más tiempo e incurre en mayores costos. Sin embargo, estas técnicas de microscopía tienen algunas ventajas importantes. La observación de la estructura celular proporciona información ampliada sobre los efectos tóxicos experimentados, proporcionando así datos más relevantes y sensibles. En particular, la introducción de la microscopía confocal 27 ha permitido para la observación de estructuras biológicas con la mejora de la resolución axial en comparación con el de campo amplio tradicionales microscopios de fluorescencia de imágenes. Por lo tanto, la imagen confocal se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en diferentes campos de lainvestigaciones médicas y científicas. En contraste con las técnicas de microscopía electrónica, microscopía de barrido confocal ofrece la capacidad de visualizar los distintos componentes de las células mediante la incorporación de marcadores fluorescentes específicos. La mayoría de estos trazadores específicos son estables en un entorno acuoso, sensiblemente medible, barato y no tóxico 28, lo que permite su uso en clínica, así como los estudios de investigación de laboratorio. Por otra parte, el secado y fijación de muestras requerido para el análisis de microscopía electrónica convencional no es necesaria para la formación de imágenes confocal lapso de tiempo, la adquisición de este modo dependiente del tiempo también es posible en muestras. En comparación con la formación de imágenes de dos dimensiones, el principio de formación de imágenes confocal permite una visualización del subsuelo muestra y la estructura tridimensional de reconstrucción de las diferentes imágenes de profundidad obtenidos; detalles que dan como resultado, más precisos y más estructurales 29, 30. El presente estudio de vídeo es un ejemplo de la utilización de tres dimensiones de intervalos de tiempo Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) combinada con etiquetado Live / Dead fluorescente y la cuantificación de la señal como un método innovador. La técnica presentada en este documento tiene la ventaja de permitir la evaluación y el lapso de tiempo sensible de imágenes de células vivas sin cambiar la estructura de la célula evaluado. No se requieren pasos de preparación antes del análisis confocal. Anteriormente, la misma tinción se utilizó para evaluar la viabilidad del cultivo núcleos de hueso esponjoso 31 pero sin confocal de lapso de tiempo siguiente. Del mismo modo se utilizó el mismo procedimiento confocal de lapso de tiempo para evaluar la actividad de letalidad eritromicina en las bacterias de lodos activados de acuerdo a su tipo de Gram 32 utilizando una bacteria específica Vivir / tinción muertos. Estos métodos se han adaptado y utilizado para comparar la toxicidad de compuestos dentales basados ​​en monómeros de metacrilato de 11 recientemente.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Microscopio confocal</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 Incubadora</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>Live/Dead Kit</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Mancha&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS contracción extra baja &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Composite dental</td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Medio de cultivo</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>células de recolección sistema de</td></tr><tr><td>portaobjetos de cámara&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Cámara de cultivo</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Recuento de células&nbsp;</td></tr></tbody></table>

confocal lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la evaluación cytocompatibility de composites dentales

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Es generalmente aceptado que la interacción in vitro de material celular en es un criterio útil en la evaluación de biocompatibilidad material dental. El objetivo de este estudio fue utilizar 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso para evaluar la biocompatibilidad in vitro de compuestos dentales. Este método proporciona una indicación exacta y sensible de la tasa de células viables en contacto con extractos de compuestos dentales. El ELS adicional baja contracción, un compuesto dental utilizado para la restauración directa, se ha tomado como ejemplo. En la evaluación in vitro se realizó en células de fibroblastos gingivales humanos en cultivo primario mediante la tinción de Live / Dead. Las imágenes se obtuvieron con el sistema biológico FV10i confocal invertido y analizados con el Software 3.1 FV10-ASW. Análisis de la imagen mostró una muy ligera citotoxicidad en presencia del compuesto de prueba después de 5 horas de lapso de tiempo. Una ligera disminución de la viabilidad celular se muestra en contacto con el compuesto de extractos compar probadoed con las células control. Los resultados pusieron de relieve el uso de 3D CLSM imágenes lapso de tiempo como un método sensible para evaluar cualitativa y cuantitativamente el comportamiento de biocompatibilidad de materiales compuestos dentales.

La figura 1 muestra una vista general de las células teñidas de vivos / muertos en imágenes obtenidas de mapeo (objetivo 10X), tanto para el control y las células expuestas a los extractos compuestos ensayados (ELS muy baja contracción). La estructura tridimensional de las células puede ser visualizado en la 600X aumentos. Visualización de células recogidas en la cámara de control y de las células recogidas en la cámara en presencia de los extractos compuestos ensayados se presenta en la Figura 2. La proyección máxima (60X objetivo) muestra el destino de las poblaciones celulares seleccionadas en el comienzo de el lapso de tiempo (a 15 min) y al final del período de tiempo transcurrido (en 5 h). Cincuenta y siete pilas de imágenes (tomografía xyzt mod, 39 imágenes por pilas, voxel de profundidad 1,00 m) se obtuvieron durante este periodo. Una ligera disminución en la señal fluorescente verde y muy ligera variación en el fluorescente de color rojo se obtuvieron en las células expuestas. No se observó variación significativa para el control delas células. Células expuestas extractos compuestos supone la morfología del huso similar a las células de control; morfología no fue alterada en estas condiciones experimentales (a pesar de la disminución de la señal verde y el aumento de la señal roja en la presencia del compuesto probado). El análisis de imágenes se realizó en cinco diferentes pilas de imágenes seleccionadas correspondientes a diferentes poblaciones de células a partir de las imágenes obtenidas para el compuesto probado en comparación con células de control negativo para la señal de tanto verde y rojo. El perfil de intensidad de las células teñidas se ilustra en la Figura 3; la evolución de la señal verde y rojo de las células en contacto con el compuesto probado fue comparable a las de las células de control. Calceína y EthD-1 intensidades de emisión de fluorescencia se midieron en células de control y en las células expuestas compuestos. La medición se realizó a intervalos de una hora durante un máximo de cinco horas. La proporción verde / rojo de fluorescencia (basado en las intensidades integradas de la verde 495-515 nm y 620-650 nm señales rojas) Se calculó durante el período de lapso de tiempo. Las proporciones de viabilidad para el control y las células expuestas a los extractos de ELS adicional baja contracción se muestran en la T abla 1. En la presencia del compuesto de prueba, se encontró que el porcentaje de células vivas para disminuir ligeramente de 100% a 93,9% después de 1 h de contacto. Se observó una diferencia significativa entre el compuesto probado y el control negativo (células sin ningún extractos compuestos) después de 5 horas del período de lapso de tiempo indicado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Figura 1: Vista general de mapeo de imagen mostró células en objetivo de 10X, las células de control (A) y (B) las células teñidas en presencia de extractos de compuestos (ELS muy baja contracción) en el comienzo del período de tiempo transcurrido (t = 15 min). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. En estecondiciones del experimento, no de variación (tanto para la fluorescencia verde y rojo) se observó para los compuestos expuestos células en comparación con células de control negativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Figura 2: imágenes CLSM en objetivo 60X de una población celular de (A) y la cámara de control (B) cámara de extractos de compuestos en el comienzo y el final del período de exposición de lapso de tiempo (I: 15 min y II: 5 hr, respectivamente ). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. El panel de las imágenes demostró ligero cambio en la señal de intensidad (ligero descenso en la señal verde y muy ligero incremento en el rojo). No se observaron alteraciones en la morfología celular en presencia de extractos de material compuesto; exponer células mantenido su morfología en forma de huso y fibroblástica como las células de control. Figura 3: Perfil Línea de células observadas en microscopía de lapso de tiempo las células (A) de control (B) células extractos compuestos expuestos, (I) a los 15 min y (II) a las 5 h.. Ninguna variación visible en la evolución de la señal verde en presencia de compuesto probado independientemente el tiempo de contacto. Sin embargo, se observó ligero aumento de la señal de color rojo en presencia de compuesto después de 5 h de contacto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> El tiempo de contacto (horas) </td><td colspan="5"> Viabilidad celular (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Las células de control </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS adicional baja contracción ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Tasa de HGF en vivo evolución células después de 1, 2, 3, 4 y 5 hr de contacto con los extractos compuestos se ensayó la viabilidad celular mediante la tinción utilizando el kit de citotoxicidad Live / Dead. Los datos muestran valores medios ± DE de cinco imágenes apila análisis. Los valores son significativamente diferentes de las células de control en p &lt;0,05.

El aspecto más estudiado de la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales es su citotoxicidad 3D CLSM imágenes lapso de tiempo combinado con la cuantificación de la señal fluorescente permite la evaluación sensible del destino celular en el tiempo. Utilizando este método podría ser una herramienta eficaz para evaluar la cytocompatibility de composites dentales.

Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la microscopía de escaneo láser confocal 3D para la obtención de imágenes de lapso de tiempo para evaluar cualitativa y cuantitativamente la biocompatibilidad in vitro de los composites dentales. Esto se logra tomando primero muestras esféricas de composite dental sin curar en el segundo paso. Los fibroblastos gingivales humanos se cultivan en presencia o ausencia de estos extractos compuestos, y luego las células se marcan con tinción de muertos vivos.A continuación, se generan imágenes de mapa de los cultivos celulares y se crean imágenes superpuestas para las áreas de interés. En última instancia, las diferencias en tiempo real en el comportamiento celular que ocurren en presencia o ausencia de los compuestos probados se pueden monitorear de acuerdo con los cambios en las señales fluorescentes verdes o rojas observadas en las imágenes. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes son que permite la monitorización en tiempo real de células vivas sin inducir cambios en la estructura celular.No se requieren pasos de fijación o secado después de la tinción celular o antes de la observación por lapso de tiempo. Para preparar el extracto de composite, comience utilizando un soporte a medida con un radio de dos milímetros para formar muestras esféricas del composite dental sin curar. Transfiera las muestras a pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de cultivo, teniendo cuidado de dejar algunos pocillos con medios solos para cultivos celulares de control, y luego coloque una lámpara LED con una intensidad de 1070 milivatios centímetros cuadrados dentro de 0,5 milímetros de las muestras.Se curaron las muestras durante 40 segundos para simular el contacto temporal entre los dientes y el composite dental descuidado, y luego se incubaron las muestras de composite durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio cada tres días y las celdas de paso cada cinco días. Luego, después de que el cultivo haya alcanzado la cofluidez, recoja las células y hágalas girar durante cinco minutos a 90 veces G y a 37 grados Celsius.Vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo y, después de contar las células, siembre la suspensión celular a una densidad celular de 2,5 veces 10 a la cuarta celda por mililitro en un sistema de portaobjetos de cámara durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. A la mañana siguiente, reemplace el medio en dos pocillos del portaobjetos de la cámara con un mililitro de los extractos compuestos probados, y vuelva a colocar el portaobjetos en la incubadora para obtener imágenes de las células por confocal. Imágenes de lapso de tiempo.En primer lugar, etiquete las células compuestas cocultivadas y de control con tinción de citotoxicidad muerta viva para células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 15 minutos después de la tinción, coloque el portaobjetos de la cámara en la oscuridad en la cámara confocal integrada en condiciones de cultivo celular y caliente los láseres de 473 nanómetros y 559 nanómetros. A continuación, utilice un detector con un espectro recientemente desarrollado para establecer automáticamente las condiciones de imagen para el láser de 473 nanómetros.Utilice las funciones de encuadre y zoom para seleccionar el área de interés y, a continuación, elija el modo de observación. Seleccione hasta cinco tipos de modos de observación, incluido el Zack de lapso de tiempo y el área múltiple según sea necesario, y luego capture rápidamente cinco imágenes de mapa con un láser de 473 nanómetros bajo el objetivo de 10 x tanto para la muestra de prueba como para las celdas de control cuando se hayan adquirido las imágenes deseadas. Cambie al láser de 559 nanómetros y capture imágenes de la célula en el segundo fluorescente como se acaba de demostrar.Alternativamente, superponga las imágenes fluorescentes y de contraste de luz utilizando el punto seleccionado en la pantalla en vivo del X 60 para observar el almacenamiento de imágenes en vivo. Las imágenes cartográficas en el formato de imagen Olympus para el análisis de señales y las imágenes de proyección máxima son de 24 bits por píxel. A continuación, los archivos TIFF utilizan las diferentes herramientas de análisis para medir el perfil de intensidad de la señal y la relación de intensidad entre los dos canales fluorescentes.Por último, analizar las diferencias en la señalización de las células fluorescentes entre los dos grupos con el software adecuado. En estas imágenes cartográficas de células vivas con tinción TED en medios solos o expuestos a extracto compuesto, no se observaron diferencias en la viabilidad de las células a los 15 minutos del período de lapso de tiempo. Aquí, las imágenes de proyección máxima de las células de control muestran el destino magnificado de las células dentro de los primeros 15 minutos y cinco horas más tarde, al final del período de lapso de tiempo, como se observó, no hubo variación significativa en la fluorescencia dentro de las células de control durante el período de incubación.Las células expuestas a la contracción extra baja ELS asumieron una morfología de huso similar a la de las células de control, pero mostraron una ligera disminución en la señal fluorescente verde y un aumento muy leve en la fluorescencia roja al final del período de lapso de tiempo. El perfil de intensidad de las células teñidas se ilustra en estos gráficos, en los que se midieron las intensidades de emisión de una fluorescencia del homodímero de endotelio de calcio en células expuestas de control y compuestas a intervalos de una hora durante un máximo de cinco horas. No se observaron diferencias significativas en la señalización entre las dos culturas.En la tabla se muestran las relaciones de viabilidad para las células de control y compuestas expuestas. En presencia del compuesto probado, se encontró que el porcentaje de células vivas disminuyó ligeramente del 100 al 93,9% después de una hora de contacto después de cinco horas. Se observaron diferencias significativas en la viabilidad celular entre el ELS compuesto ensayado, la contracción extra baja y los cultivos celulares de control negativo a pesar de la no citotoxicidad del compuesto.Los datos actuales ponen de manifiesto el uso de la imagen confocal time-lapse como un método preciso y sensible para evaluar el comportamiento de los fibroblastos gen en contacto con los composites dentales después de su desarrollo. Este método es una forma privada para que los investigadores en el campo de la toxicología exploren la citotoxicidad y la evaluación de riesgos de materiales dentales, medicamentos, sustancias químicas y otros dispositivos médicos.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente: Parker, J. J., et al. Un modelo de cultivo de corte organotípico de glioblastoma humano para el estudio de la migración de células tumorales y los efectos específicos del paciente de los fármacos antiinvasivos. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra las imágenes de cortes de tejido de glioblastoma que expresan proteína verde fluorescente (GFP) a través de microscopía confocal. Las imágenes de alta resolución se capturan a intervalos constantes para rastrear el movimiento y la dirección...

Imágenes de la migración de células tumorales en tejido de glioblastoma mediante microscopía confocal de barrido de lapso de tiempo

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

En este estudio, se discutirá el uso de un dispositivo de carga en situ junto con la tomografía de rayos micro-X calculado para la biomecánica conjuntos fibrosos. Lecturas experimentales identificables con un cambio general en la biomecánica articular serán los siguientes: 1) fuerza reaccionaria contra el desplazamiento, es decir, el desplazamiento del diente en el alveolo y su respuesta reaccionaria a la carga, 2) en tres dimensiones (3D) la configuración espacial y la morfometría, es decir...

In situ carga de compresión y de imágenes no invasiva correlativa del hueso-ligamento periodontal de dientes fibroso Conjunta

Con el fin de entender el desarrollo espacial de la tensión de contracción de polimerización en restauraciones de composite de resina dental, se utilizó la correlación digital de imagen para proporcionar de campo completo de medición de desplazamiento / deformación de las cavidades de vidrio modelo restaurados mediante la correlación de las imágenes de la restauración se toma antes y después de la polimerización.

Contracción de Dental Composite en Simulado Cavidad Medido con Correlación Digital de Imágenes

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.

Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

Presentamos un protocolo para el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar de forma no invasiva la distribución espacio-temporal de los liposomas en el ojo tras la inyección subconjuntival.

Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica

La técnica de identificación asistida por fluorescencia es un enfoque practicable, rápido y confiable para la diferenciación de restauraciones de resina compuesta de sustancia dental, y facilita la eliminación mínimamente invasiva y completa de restauraciones de resina compuesta y férulas de trauma unidas compuestas.

Detección y eliminación de resina compuesta del color del diente utilizando la técnica de identificación asistida por fluorescencia

Esta metodología permite aplicar un aparato dental sobre cualquier espécimen en cualquier ángulo con fuerza y estabilidad estandarizadas. Este enfoque podría usarse ampliamente en las ciencias de la salud para estandarizar los impactos de los equipos dentales con elementos de sujeción manual como micromotores, turbinas y raspadores ultrasónicos en diversas superficies.

Impacto de la rugosidad del raspador dental piezoeléctrico en dos materiales de relleno compuestos fluidos distintos

Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Aprende a evaluar la citocompatibilidad de composites dentales mediante microscopía confocal 3D en tiempo real. Este método permite monitorear fibroblastos gingivales humanos sin alterar la estructura celular.

Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales

Explorar más videos