Técnicas Experimentales y de imagen para examinar la estructura coágulo de fibrina en normales y enfermos Unidos

El objetivo general de este procedimiento es examinar las diferencias morfológicas en las estructuras anormales de los coágulos que se producen en la diabetes y la anemia de células falciformes, condiciones patológicas para los coágulos diabéticos simulados. Esto se logra mediante la obtención de imágenes de estructuras de coágulos glicosilados mediante microscopía confocal para muestras de sangre de pacientes con anemia falciforme. Los coágulos de fibrina que contienen glóbulos rojos se visualizan en tiempo real.

A continuación, se puede realizar un análisis microscópico para evaluar las tasas de fibrinólisis en las estructuras de coágulos normales y glicosilados. En última instancia, este análisis en tiempo real se puede utilizar para evaluar las diferencias morfológicas que se producen en las estructuras anormales de los coágulos en respuesta a los estados de enfermedad en los que surgen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis y la hemostasia, como ¿En qué se diferencian las estructuras de los coágulos de fibrina en pacientes con diabetes o enfermedad de células falciformes?

Para evaluar coágulos diabéticos simulados por microscopía confocal, primero descongele el fibrinógeno humano y el conjugado de fibrinógeno humano marcado con fluorescencia al 10% a 37 grados Celsius cuando las soluciones de fibrinógeno humano calentado se mezcló con fibrinógeno humano y el conjugado de fibrinógeno en una solución de cloruro de sodio de glucosa e incubó la solución protegida de la luz en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cerca del final de la incubación, use un adhesivo de base no líquida para fijar un adhesivo delgado en dos lados de un portaobjetos de vidrio para hacer una cámara, luego mezcle una solución de fibrinógeno con factor de temperatura ambiente 13 y trombina hasta un volumen final de 50 microlitros, e inmediatamente transfiera 30 microlitros de la solución de fibrina a la cámara de portaobjetos del microscopio. Ahora coloque un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros con un punto de 15 milímetros de grosor encima del adhesivo y selle los lados abiertos de la cámara con adhesivo transparente, teniendo cuidado de que el adhesivo no interactúe con el coágulo.

Deje que los coágulos de fibrina se polimericen a 21 a 23 grados centígrados durante dos horas. A continuación, adquiera imágenes de microscopía confocal de los coágulos utilizando un objetivo de 40 x y un láser de argón de 488 nanómetros para evaluar los coágulos de pacientes con anemia falciforme. Primero diluir la muestra de glóbulos rojos a 1 millón de células por mililitro en un medio de cultivo de células libres en suero y mezclar las células con cinco microlitros de la solución de marcaje celular adecuada mediante un pipeteo suave.

Después de 20 minutos a 37 grados centígrados, lavar las células tres veces en un medio a 37 grados centígrados mientras las células están en la mezcla centrífuga con solución de fibrinógeno recién preparada, factor 13 y trombina como se acaba de demostrar. A continuación, transfiera 10 microlitros de los glóbulos rojos marcados a la solución de fibrina e inmediatamente dispense 30 microlitros de la solución celular en una cámara adhesiva. En un portaobjetos de microscopio de vidrio, permita que la fibrina se polimerice a 21 a 23 grados Celsius después de dos horas, adquiera imágenes confocales de los coágulos utilizando láseres de excitación con longitudes de onda de 488 nanómetros y 633 nanómetros para excitar la fibrina y los glóbulos rojos marcados con fluorescencia respectivamente.

Para evaluar las tasas de fibrinólisis y las estructuras de los coágulos glicosilados, primero prepare coágulos glicosilados, como se acaba de demostrar esta vez. Sin embargo, después de dispensar la solución de coágulo de fibrina en la cámara adhesiva, no selle los extremos de la cámara. En su lugar, permita que los coágulos se polimericen a 21 a 23 grados Celsius en un recinto sellado que contenga 250 mililitros de agua para evitar la deshidratación.

Después de una hora y media, adquiera imágenes de los coágulos por microscopía confocal como se acaba de demostrar. A continuación, pipetee 25 microlitros de plasmina en el extremo abierto de la cámara y deje que la plasmina se disperse por todo el coágulo por capilaridad. Finalmente, abra las funciones de series temporales del software de microscopio confocal, haga clic en el modo de adquisición y seleccione series temporales.

A continuación, seleccione el número de ciclos y el intervalo de tiempo de grabación para capturar secuencias de vídeo en tiempo real de la lisis del coágulo inducida por plasmina El análisis de los coágulos normales y glicosilados revela que los coágulos glicosilados son más densos con poros más pequeños que los coágulos normales, con y sin la adición de factor 13 durante la polimerización del coágulo. De hecho, en los coágulos glicosilados de la ONU, hay una menor concentración de fibrina, lo que crea una estructura menos densa que la observada en los coágulos glicosilados, que contienen una mayor concentración de fibrina. Los coágulos de fibrina de pacientes con anemia falciforme contienen glóbulos rojos y exhiben estructuras más densas que las de los coágulos de fibrina sanos debido a una mayor concentración de fibrinógeno en estos individuos.

Además, la tendencia natural de los glóbulos rojos de los pacientes con anemia falciforme agregados y géneros, grupos de glóbulos rojos que se entretejen en la red de fibrina, lo que resulta en la formación de estructuras de coágulos aberrantes que son marcadamente diferentes en morfología a las observadas en pacientes normales. Por último, el análisis de las tasas de fibrinólisis de los coágulos normales frente a los glicosilados demuestra una capacidad significativamente deteriorada de los coágulos diabéticos simulados para eliminar la fibrina en ausencia de suficiente plasmina. Esta investigación ayudará a abrir el camino para los investigadores en el campo de la trombosis y la hemostasia, especialmente para los pacientes que desarrollan patologías comórbidas como consecuencia de la enfermedad de células falciformes y la diabetes.